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裟铁余
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1 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品中果聚糖的测定发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布

2 食品安全国家标准食品中果聚糖的测定 1 范围本标准规定了食品中果聚糖含量的离子色谱法测定方法本标准适用于乳及乳制品婴幼儿配方食品婴幼儿谷类辅助食品固体饮料配制酒中单独添加的低聚果糖多聚果糖或菊粉含量的测定 2 原理试样经热水浸提, 样液中的蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖经硼氢化钠还原成相应的糖醇, 多余的硼氢化钠用乙酸中和样液中的果聚糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖, 经离子色谱 - 脉冲安培检测器测定果糖含量, 通过换算系数, 折算得到果聚糖的含量 3 试剂和材料 3.1 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水氢氧化钠 (NaOH) 马来酸 (C4H4O4) 蔗糖酶 : 来源于酵母, 酶活力 300U 硼氢化钠 (NaBH4) 冰乙酸 (CH3COOH) 三水乙酸钠 (CH3COONa 3H2O) 果聚糖酶 : 来源于黑曲霉, 酶活力 10000U % 氢氧化钠溶液 (NaOH): 色谱纯无水乙酸钠 (CH3COONa): 纯度 99.0% 氮气 (N2): 纯度 99.9% 3.2 试剂配制氢氧化钠溶液 (1mol/L): 称取 40g 氢氧化钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水并稀释至 1000 ml, 室温下可放置 2 个月马来酸钠缓冲溶液 (100mmol/L,pH6.5): 称取 1.16g 马来酸 ( 精确至 0.01g) 于 150 ml 烧杯中, 加入约 70mL 水溶解, 用 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph6.5, 用水稀释至 100mL 4 保存, 可放置 3 个月蔗糖酶溶液 (4.5 U/mL): 将蔗糖酶 ( 活力为 300 U) 溶解于 66 ml 马来酸钠缓冲溶液, 分装到 2mL 的离心管中,-20 保存, 可放置 6 个月使用前需测定酶活力氢氧化钠溶液 (50mmol/L): 称取 2g 氢氧化钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水并稀释至 1000 ml, 室 1

3 温下可放置 2 个月硼氢化钠溶液 (10 mg/ml): 准确称取适量硼氢化钠 ( 精确至 0.001g) 于聚丙烯离心管中, 用 50mmol/L 氢氧化钠溶液溶解, 最终质量浓度为 10mg/mL, 用时现配乙酸溶液 (200mmol/L): 吸取 0.6mL 冰乙酸, 用水稀释至 50mL,4 保存, 可放置 2 个月乙酸钠溶液 (200mmol/L): 称取 1.36g 三水乙酸钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水并稀释至 50 ml, 4 保存, 可放置 2 个月乙酸钠缓冲溶液 (ph 4.5): 吸取 14 ml 乙酸溶液和 11 ml 乙酸钠溶液混合, 并用水稀释至 50mL, 用时现配果聚糖酶溶液 (455U/mL): 将果聚糖酶 ( 活力为 10000U) 溶解于 22mL 乙酸钠缓冲溶液, 分装到 2mL 的离心管中,-20 保存, 可放置 6 个月使用前需测定酶活力氢氧化钠溶液 (200mmol/L): 取 10.4mL50% 氢氧化钠溶液, 用水稀释至 1000mL, 通入氮气保护, 缓慢摇匀, 室温下可放置 7d 氢氧化钠 (150 mmol/l) 乙酸钠 (500 mmol/l) 混合溶液 : 称取 41g 无水乙酸钠 ( 精确至 0.01g), 用约 500mL 水溶解,0.22μm 滤膜过滤, 脱气 10min, 加入 7.8mL50% 氢氧化钠溶液, 并用水稀释至 1000mL, 通入氮气保护, 缓慢摇匀, 室温下可放置 7d 3.3 标准物质果糖标准物质 (C6H12O6): 纯度 99.0% 3.4 标准溶液的配制果糖贮备溶液 (2000mg/L): 准确称取 0.05g( 精确至 0.1mg)80 烘干至恒重的果糖标准物质于 50mL 烧杯中, 加入约 10mL 热水, 待果糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至 25mL 容量瓶中, 摇匀, 4 保存, 可放置 1 个月果糖中间溶液 (80.0mg/L): 吸取果糖贮备溶液 1mL, 用水稀释至 25mL 容量瓶中, 用时现配果糖标准曲线工作溶液 : 取适量果糖中间溶液, 用水配制成质量浓度为 0.800mg/L 1.60mg/L 4.00mg/L 8.00mg/L 16.0mg/L 的标准曲线工作溶液 3.5 材料净化柱 : 反相固相萃取柱, 填料为苯乙烯二乙烯基苯,2.5mL 微孔滤膜 : 水相,0.22μm 4 仪器和设备 4.1 离子色谱仪 : 配有三元及以上梯度泵, 脉冲安培检测器,Au 工作电极 4.2 天平 : 感量为 0.1mg 0.001g 和 0.01g 4.3 ph 计 : 精度为 0.01pH 4.4 旋涡振荡器 4.5 恒温水浴摇床 : 控温精度 ±1 4.6 离心机 : 转速 3000r/min 2

4 5 分析步骤 5.1 试样制备试样预处理固体样品 : 用四分法缩分至约 200g 样品经粉碎机粉碎, 混匀, 备用液体样品 : 将试样装入能够容纳 2 倍试样体积的带盖容器中, 摇匀, 备用提取准确称取 1g~5g( 精确至 0.001g, 至少含有果聚糖 5mg) 试样于 150mL 锥形瓶中, 加入 80 ± 1 热水约 50mL, 置于 80 ±1 恒温水浴摇床中,150r/min 振摇 15min 后, 取出, 冷却至室温, 转移至 100mL 容量瓶中, 用水分三次冲洗锥形瓶, 定容, 摇匀, 溶液经滤纸过滤或者离心, 滤液或上清液依据标准曲线的线性范围确定稀释倍数, 备用取上述备用样液 200μL 于 10mL 具塞玻璃试管中, 估算样液中可能的蔗糖含量, 按照每毫克蔗糖加入 300μL 蔗糖酶溶液, 旋涡振荡混匀, 置于 40 ±1 恒温水浴摇床中,150r/min 振摇 60min 后, 加入 300μL 硼氢化钠溶液, 旋涡振荡混匀, 置于 40 ±1 恒温水浴摇床中,150r/min 振摇 30 min 后, 取出, 冷却至室温加入 750μL 乙酸溶液, 静置 10min 估算样液中可能的果聚糖含量, 按照每毫克果聚糖加入 1.2mL 果聚糖酶溶液, 旋涡振荡混匀, 置于 40 ±1 恒温水浴摇床中,150r/min 振摇 30min 后, 取出, 冷却至室温转移至 10mL 容量瓶中, 用水分三次冲洗玻璃试管, 定容, 摇匀活化净化柱, 试样溶液依次通过 0.22μm 水相滤膜和净化柱, 弃去前面 3 倍柱体积洗脱液, 收集后面洗脱液待测同时做试剂空白试验 5.2 仪器参考条件仪器参考条件色谱柱 : 可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱淋洗液 :A: 水 ;B: 氢氧化钠溶液 (200mmol/L);C: 氢氧化钠 (150mmol/L) 乙酸钠 (500mmol/L) 混合溶液梯度洗脱条件见表 1 表 1 梯度洗脱条件时间 min 流速 ml/min 淋洗液 % A B C 曲线 0~ 线性 20.1~ 线性 30.1~ 线性 40.1~ 线性检测器 : 脉冲安培检测器,Au 工作电极,Ag/AgCl 参比电极, 检测池温度 30, 果糖检测波形参见表 2 3

5 表 2 果糖检测波形时间 s 电位 V 积分时间 s 电位 V 积分开始结束柱温 : 进样体积 :10μL 仪器参考条件色谱柱 : 可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱淋洗液 :A: 氢氧化钠溶液 (90mmol/L);B: 氢氧化钠 (150mmol/L) 乙酸钠 (500mmol/L) 混合溶液梯度洗脱条件见表 3: 表 3 梯度洗脱条件时间 min 流速 ml/min A 淋洗液 % B 曲线 0~ 线性 22.1~ 线性 35.1~ 线性脉冲安培检测器,Au 工作电极,Pd 参比电极, 检测池温度 35, 果糖检测波形参见表 4: 表 4 果糖检测波形时间 s 电位 V 积分开始结束柱温 : 进样体积 :20μL 5.3 标准曲线的制作将标准曲线工作溶液从低到高依次注入离子色谱仪中, 测定相应的响应值 ( 峰面积 ), 以标准工作液 4

6 中果糖的质量浓度为横坐标, 以响应值 ( 峰面积 ) 为纵坐标, 绘制标准曲线标准溶液色谱图参见附录 A 5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入离子色谱仪中, 记录色谱图根据保留时间定性, 记录峰面积, 根据标准曲线得到待测液中果糖的质量浓度同时测定试剂空白 6 分析结果的表述试样中果聚糖含量按式 (1) 式 (2) 式 (3) 计算 : 式中 : X X = k1 k2 (c-c0) V 10 m k1 = (n-1) 180 n k2 = n n-1 试样中果聚糖的含量, 单位为克每千克 (g/kg); k1 对果聚糖水解过程中增加的水分子进行校正 ; (1 ) (2 ) (3 ) k2 对于 Fn 型果聚糖末端果糖基被还原和 GFn 型果聚糖末端葡萄糖不被检测进行校正 ; c c0 V 试样测定液中果糖的质量浓度, 单位为毫克每升 (mg/l); 试剂空白测定液中果糖的质量浓度, 单位为毫克每升 (mg/l); 试样定容体积, 单位为毫升 (ml); 10 试样酶解液定容体积, 单位为毫升 (ml); m 试样质量, 单位为克 (g); 0.2 用于酶解的样品溶液体积, 单位为毫升 (ml); 1000 单位转换系数 ; n 平均聚合度, 对于低聚果糖, 按照 n=4 计算 ; 对于多聚果糖, 按照 n=23 计算 ; 对于菊粉, 按照 n=10 计算计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 保留三位有效数字 7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 8 其他当称样量为 5g 时, 检出限为 0.4g/kg, 定量限为 2.0g/kg 5

7 附录 A 果糖标准溶液奶粉样品色谱图 A.1 果糖标准溶液色谱图 ( 参考条件 1) 果糖标准溶液色谱图 ( 参考条件 1) 见图 A.1 图 A.1 果糖标准溶液色谱图 A.2 奶粉样品色谱图 ( 参考条件 1) 奶粉样品色谱图 ( 参考条件 1) 见图 A.2 图 A.2 奶粉样品色谱图 6

8 A.3 果糖标准溶液色谱图 ( 参考条件 2) 果糖标准溶液色谱图 ( 参考条件 2) 见图 A.3 图 A.3 果糖标准溶液色谱图 A.4 奶粉样品色谱图 ( 参考条件 2) 奶粉样品色谱图 ( 参考条件 2) 见图 A.4 图 A.4 奶粉样品色谱图 7

9 附录 B 酶活力测定方法 B.1 蔗糖酶活力测定方法 B.1.1 原理蔗糖酶 (Sucrase,EC ) 又称转化酶, 可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键, 使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖是还原糖, 其含量可通过 3,5- 二硝基水杨酸比色法测定, 从而度量酶活力的大小由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活, 所以可用碱终止反应 3,5- 二硝基水杨酸和还原糖共热后生成棕红色氨基化合物, 在最大吸收波长 540nm 处测定, 在一定浓度范围内吸光值与还原糖含量呈线性关系, 因此可用于还原糖含量的测定, 从而测定蔗糖酶的活力大小蔗糖酶活力定义为 : 在 37 ph6.5 条件下, 每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需的酶量 ( 活性 ) 定义为 1 个酶活力单位 B.1.2 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB/T6682 规定的一级水 B 葡萄糖标准物质 (C6H12O6): 纯度 99.0% B 蔗糖 (C12H22O11): 纯度 99.0% B 氢氧化钠 (NaOH) B 马来酸 (C4H4O4) B 二硝基水杨酸 (C7H4N2O7) B 酒石酸钾钠 (C4H4KNaO6) B 苯酚 (C6H5OH) B 亚硫酸钠 (Na2SO3) B.1.3 试剂配制 B μmol/mL 葡萄糖标准溶液 : 准确称取 0.045g( 精确至 0.1 mg)80 烘干至恒重的葡萄糖标准物质于 50mL 烧杯中, 加入约 10mL 热水, 待葡萄糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至 100 ml 容量瓶中, 摇匀,4 保存, 可放置 1 个月 B 氢氧化钠溶液 (1mol/L): 称取 40g 氢氧化钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水并稀释至 1000 ml, 室温下可放置 2 个月 B 马来酸钠缓冲溶液 (0.1mol/L,pH6.5): 称取 1.16g 马来酸 ( 精确至 0.01g) 于 150 ml 烧杯中, 加入约 70mL 水溶解, 用 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 至 6.5, 用水稀释至 100 ml,4 保存, 可放置 3 个月 B mol/L 蔗糖溶液 : 准确称取 34.2g( 精确至 0.01g) 蔗糖, 用约 50mL 水溶解, 用马来酸钠缓冲溶液稀释至 100mL, 摇匀, 用时现配 B 氢氧化钠溶液 (2mol/L): 称取 80g 氢氧化钠 ( 精确至 0.01g), 用水溶解并稀释至 1000 ml, 室温下可放置 2 个月 B ,5- 二硝基水杨酸溶液 : 将 6.3g 二硝基水杨酸和 262 ml2 mol/l NaOH 溶液, 加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加 5g 苯酚和 5g 亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后用水稀释至 8

10 1000mL, 贮于棕色瓶中备用 B.1.4 仪器和设备 B 恒温水浴锅 : 控温精度 ±1 B 分光光度计 : 带 1cm 玻璃比色皿 B 微量移液器 :100μL 1000μL B.1.5 B 分析步骤待测酶的制备准确称取测试酶样品约 0.1g( 精确 0.001g), 用 0.1mol/L 马来酸钠缓冲溶液溶解并稀释, 控制酶活力浓度在 1U/mL~5U/mL 范围内 B B 测定葡萄糖标准曲线的制作取 6 支 10mL 刻度试管, 编号, 按表 B.1 配制不同浓度的葡萄糖标准溶液 : 表 B.1 葡萄糖标准溶液管号葡萄糖原液量 /ml 加水量 /ml 葡萄糖浓度 /( μ mol/ml) 在上述各试管中分别加入 0.5mL3,5- 二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热 10 min 取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至 5 ml, 混匀, 以 1 号试管为空白, 用分光光度计测定波长 540nm 处的吸光值以吸光值为纵坐标, 葡萄糖质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线 B 蔗糖酶活力的测定取 10mL 刻度试管, 用微量移液器准确移取 1.0mol/L 蔗糖溶液 0.8mL, 准确加入待测酶 0.1mL, 在 37 ±1 恒温水浴保温 30min, 取出后立即加入 0.1mL1mol/LNaOH 溶液, 摇匀以终止酶促反应在相同的条件下, 以沸水浴钝化酶液作为试剂空白再向该溶液中加入 0.5mL3,5- 二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热 10 min 取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至 5mL, 混匀用分光光度计测定波长 540nm 处的吸光值, 由标准曲线计算待测酶测定液中和试剂空白测定液中葡萄糖的质量浓度 B.1.6 计算蔗糖酶活力按式 (B.1) 计算 : 式中 : X c X = ( c-c0) V Vx 30 蔗糖酶活力, 单位为活力单位每毫升 (U/mL); 待测酶测定液中葡萄糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升 ( μ mol/ml); (B.1 ) 9

11 c0 V Vx 试剂空白测定液中葡萄糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升 ( μ mol/ml); 酶水解液最终定容体积 (5mL), 单位为毫升 (ml); 待测酶的用量, 单位为毫升 (ml); 30 反应时间, 单位为分 (min) B.2 果聚糖酶活力测定方法 B.2.1 原理果聚糖酶 (Inulinase,EC ) 又称菊粉酶, 是能够水解 β-2,1-d- 果聚糖果糖苷键的一类水解酶, 使菊粉水解生成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖是还原糖, 其含量可通过 3,5- 二硝基水杨酸比色法测定, 从而度量酶活力的大小 3,5- 二硝基水杨酸和还原糖共热后生成棕红色氨基化合物, 在最大吸收波长 540nm 处测定, 在一定浓度范围内吸光值与还原糖含量呈线性关系, 因此可用于还原糖含量的测定, 从而测定果聚糖酶的活力大小果聚糖酶活力定义为 : 在 55 ph4.5 条件下, 每分钟水解产生 1μmol 果糖所需的酶量 ( 活性 ) 定义为 1 个酶活力单位 B.2.2 试剂 B 果糖标准物质 (C6H12O6): 纯度 99.0% B 菊粉 : 纯度 90.0% B 冰乙酸 (CH3COOH) B 三水乙酸钠 (CH3COONa 3H2O) B 二硝基水杨酸 (C7H4N2O7) B 酒石酸钾钠 (C4H4KNaO6) B 苯酚 (C6H5OH) B 亚硫酸钠 (Na2SO3) B.2.3 试剂配制 B μmol/mL 果糖标准溶液 : 准确称取 0.045g( 精确至 0.1 mg)80 烘干至恒重的果糖标准物质于 50mL 烧杯中, 加入约 10mL 热水, 待果糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至 100mL 容量瓶中, 摇匀,4 保存, 可放置 1 个月 B 乙酸溶液 (200mmol/L): 吸取 0.6mL 冰乙酸, 用水稀释至 50mL,4 保存, 可放置 2 个月 B 乙酸钠溶液 (200mmol/L): 称取 1.36g 三水乙酸钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水并稀释至 50mL, 4 保存, 可放置 2 个月 B 乙酸钠缓冲溶液 (ph4.5): 吸取 14 ml 乙酸溶液和 11 ml 乙酸钠溶液混合, 并用水稀释至 50mL, 用时现配 B % 菊粉溶液 : 准确称取 10g( 精确至 0.01g) 菊粉, 用约 50 ml 热水溶解, 冷却至室温, 用乙酸钠缓冲溶液稀释至 100mL 容量瓶中, 摇匀,4 保存, 可放置 1 个月 B 氢氧化钠溶液 (2mol/L): 称取 80g 氢氧化钠 ( 精确至 0.01g), 溶于水中并稀释至 1000 ml, 室温下可放置 2 个月 B ,5- 二硝基水杨酸溶液 : 将 6.3g 二硝基水杨酸和 262mL2mol/LNaOH 溶液, 加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加 5g 苯酚和 5g 亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后用水稀释至 1000mL, 贮于棕色瓶中备用 10

12 B.2.4 仪器和设备 B 恒温水浴锅 : 控温精度 ±1 B 分光光度计 : 带 1cm 玻璃比色皿 B 微量移液器 :100μL 1000μL B.2.5 B 分析步骤待测酶的制备用乙酸钠缓冲溶液稀释测试酶样品, 控制酶活力浓度在 1U/mL~5U/mL 范围内 B B 测定果糖标准曲线的制作取 6 支 10mL 刻度试管, 编号, 按表 B.2 用去离子水配制不同浓度的果糖标准溶液表 B.2 果糖标准溶液管号果糖原液量 /ml 加水量 /ml 果糖浓度 /( μ mol/ml) 在上述各试管中分别加入 0.5mL3,5- 二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热 10min 取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至 5 ml, 混匀, 以 1 号试管为空白, 用分光光度计测定波长 540nm 处的吸光值以吸光值为纵坐标, 果糖质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线 B 菊粉酶活力的测定取 10mL 刻度试管, 用微量移液器准确移取 0.9 ml10% 菊粉溶液, 准确加入待测酶 0.1 ml, 在 55 ±1 恒温水浴保温 20min, 沸水浴中加热 5 min, 以终止酶促反应在相同的条件下, 以沸水浴钝化酶液作为试剂空白再向该溶液中加入 0.5 ml3,5- 二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热 10min 取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至 5 ml, 混匀用分光光度计测定波长 540nm 处的吸光值, 由标准曲线计算待测酶测定液中和试剂空白测定液中果糖的质量浓度 B.2.6 计算果聚糖酶活力按式 (B.2) 计算 : 式中 : X c c0 V Vx X = ( c-c0) V Vx 20 果聚糖酶活力, 单位为活力单位每毫升 (U/mL); 待测酶测定液中果糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升 ( μ mol/ml); 试剂空白测定液中果糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升 ( μ mol/ml); 酶水解液最终定容体积 (5mL), 单位为毫升 (ml); 待测酶的用量, 单位为毫升 (ml); 20 反应时间, 单位为分 (min) (B.2 ) 11

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中华人民共和国国家标准 GB 5009.169 2016 食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定 2016-08-31 发布 2017-03-01 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布前言本标准代替 GB/T5009.169 2003 食品中牛磺酸的测定和 GB5413.26 2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定本标准与 GB/T5009.169 2003