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1 Dominic Foley 和 Lisa Calton 沃特世公司 ( 英国威姆斯洛 ) 应用优势 通过去除干扰物有效提升分析选择性, 进而改善重现性 优化分析灵敏度, 准确定量低生理浓度的 利用多孔板规格的自动化操作实现高样品通量 简介是一种属于盐皮质激素的类固醇激素, 在调节血压方面发挥着重要作用 过去, 人们一直采用放射免疫分析法来分析 然而, 此类方法需要使用危险的放射性同位素 此外, 由于结构相似的类固醇激素和代谢物会发生交叉反应, 这些方法往往缺乏特异性, 而这会极大地影响检测的精密度和准确度 为了最大限度解决特异性问题, 放射免疫分析法需采用耗时的手动提取方案 UPLC-MS/MS 与具备样品追踪功能的自动化样品制备流程相结合, 为临床研究中的分析提供了一种替代方法 这种集成工作流程解决方案有助于实现高选择性 高灵敏度的检测, 同时还能缩短样品处理时间 本应用纪要介绍了一种利用 Oasis MAX µelution 板从血浆中提取的临床研究方法, 且该方法已在 Tecan Freedom Evo /4 液体处理器上实现了自动化 其使用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱, 在 ACQUITY UPLC I-Class 系统上对样品进行色谱分离, 然后在 Xevo TQ-S 串联四极杆质谱仪上进行检测 ( 图 1) 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC I-Class 系统 Oasis MAX µelution 板 CORTECS UPLC C 18 色谱柱 Xevo TQ-S 质谱仪 MassLynx 软件 关键词,SPE,UPLC-MS/MS 图 1. Waters ACQUITY UPLC I-Class 系统和 Xevo TQ-S 质谱仪 1

2 实验 UPLC 条件系统 : ACQUITY UPLC I-Class 进样针 : 3 µl 色谱柱 : CORTECS UPLC C 18, 2.1 x mm, 1.6 µm ( 沃特世部件号 ) 样品制备认证参比溶液及其稳定标记内标 ( 4 H 2 ) 分别购自 Cerilliant 公司 ( 德克萨斯州圆石 ) 和 IsoSciences( 宾夕法尼亚州普鲁士国王 ) 使用购自 Golden West Biologicals( 加利福尼亚州特曼库拉 ) 的替代基质 MSG4( 经处理的人血清 ) 制备校准品 的校准范围为 pmol/l (15-15 pg/ml) 使用购自 SeraLab( 英国海沃兹希斯 ) 的混合血浆制备浓度分别为 99 5 和 2 pmol/l (36 18 和 72 pg/ml) 的 QC 样品 将数据除以 可将 SI 单位 (pmol/l) 转换为传统的质量单位 (pg/ml) 流动相 A: 水 流动相 B: 甲醇 洗针液 : 8 甲醇 ( 水溶液 ) 灌注溶剂 : 4 甲醇 ( 水溶液 ) 柱温 : 45 C 进样体积 : 25 µl 流速 :.4 ml/min 梯度 : 见表 1 运行时间 : 4. min MS 条件 系统 : Xevo TQ-S 分辨率 : MS1 (.7 FWHM) MS2 (.5 FWHM) 采集模式 : 多反应监测 (MRM) ( 详见表 2) 极性 : ESI 负离子模式 毛细管电压 : 2.4 kv 离子源温度 : 15 C 脱溶剂气温度 : 6 C 驻留时间 :.1 s 样品提取使用 Tecan Freedom Evo /4 液体处理器提取样品 向 2 µl 样品中添加 25 µl 4 pmol/l 的内标 2 µl.1 M 硫酸锌的 5 甲醇溶液和 45 µl.5 (v/v) 磷酸 每次添加试剂之后充分混合样品 将样品在 g 下离心 5 min 先后使用 2 µl 甲醇和水平衡和活化 Oasis MAX µelution 板 ( 沃特世部件号 ) 从每份预处理的样品中取 625 µl 上样至 Oasis MAX µelution 板的各个孔中, 并在低真空下缓慢抽滤样品 接下来, 分别使用 2 µl.5 (v/v) 磷酸 2 µl.1 氨的 1 甲醇溶液和 2 µl 水进行连续清洗 然后, 先后使用 5 µl 7 甲醇 ( 水溶液 ) 和 4 µl 水洗脱 方法条件设置仪器时, 确保冲洗流动相管路至少 1 min, 以去除可能对分析的灵敏度产生不利影响的添加剂 时间流速 A B 曲线 (min) (ml/min) 初始 初始 扫描间延迟时间 : 通道间延迟时间 :.1 s.2 s 表 1. 用于分离的梯度表 初始条件下的操作背压为 12 psi 数据管理 带 TargetLynx 应用软件的 MassLynx 4.1 版 2

3 分析物 ( 定量离子 ) ( 定性离子 ) - 4 H 2 母离子子离子 (m/z) (m/z) 锥孔电压 碰撞能量 表 2. 定量离子 定性离子及其内标 ( - 4 H 2 ) 的 MRM 参数 结果本研究检测了 9 种结构相关化合物 (18- 羟基皮质酮 皮质醇 可的松 11- 脱氧皮质酮 皮质酮 11- 脱氧皮质醇 21- 脱氧皮质醇 泼尼松龙和强的松 ), 而在的保留时间处未观察到干扰物 如图 2 所示, 及其代谢前体 18- 羟基皮质酮实现了基线分离, 证明此色谱柱具有良好的色谱选择性 当样品中的 18- 羟基皮质酮含量为 6 nmol/l 时, 可在 - 4 H 2 内标的 MRM 谱图中检测到其同位素离子, 因此必须分离 18- 羟基皮质酮 此外, 强的松浓度为 1 µmol/l 时会对产生离子抑制作用, 因此还需分离强的松 由于实现了基线分离, 我们可以单独定量 分析灵敏度研究结果表明, 该方法可以精确定量 42 pmol/l 的 (RSD < 2) 在十次独立分析中,42 pmol/l 校准标准品的信噪比 (S/N) > 1:1 我们在五天内每天两次提取和定量分析三个浓度的 QC 样品 ( 每个浓度三个重复样, n = 3), 以此确定该方法的总精密度 每个 QC 水平设置三个重复样, 以评估方法的重复性 表 3 展示了这些实验的结果, 低 (99 pmol/l) 中(5 pmol/l) 和高 (2 pmol/l) 浓度水平分析的总精密度和重复性为 RSD H > 羟基皮质酮 361.2>189.2 Time 图 2. 使用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱对 - 4 H 2 和 18- 羟基皮质酮进行 UPLC 分离的结果 总 QC 精密度 (RSD) QC 重复性 (RSD) 化合物 低 中 高 低 中 高 表 3. 分析的总精密度和重复性 3

4 将不同比例的高浓度和低浓度混合样品组合进行分析的结果表明, 该方法在 pmol/l 的范围内呈线性 此外, 在 1 次独立分析中, 加标血清样品的校准曲线呈线性, 且决定系数 (r 2 ) >.996 分析 14 pmol/l 的高浓度样品之后, 未在后续的空白进样中观察到系统残留物污染 通过 1:2 稀释成功测定了浓度为 766 pmol/l 的超线性范围样品, 平均准确度为 99,RSD 为 4.4 我们还评价了基质效应, 具体方法是提取并分析后加标血浆样品的峰面积, 然后计算其在相等加标浓度的提取溶剂样品结果中所占的百分比 的平均 ( 范围 ) 基质效应为 1.1 ( ),RSD 为 5.9 分析物: 内标响应比率的计算结果显示, 内标可补偿信号增强, 使得的平均 ( 范围 ) 净基质效应为 1. (.9 1.1),RSD 为 7.7 我们选用一系列样品 (n = 59) 将该方法与专为开发的 LC-MS/MS 方法进行了对比 图 3 显示了比较分析中某些样品的结果, 其定量值为 < pmol/l 这些色谱图证实了提取方案的选择性和分析方法的灵敏度 7 pmol/l 信噪比 :PtP = > ( 定量离子 ) pmol/l 信噪比 :PtP = pmol/l 信噪比 :PtP = pmol/l 信噪比 :PtP = pmol/l 信噪比 :PtP = 时间 图 3. 定量值 < pmol/l 的血浆样品的五个代表性色谱图 信噪比使用峰到峰噪音 (±2 SD) 基于原始数据计算 4

5 使用 Analyse-it 软件 2.3 版处理比较数据 对比两种独立的 LC-MS/MS 方法之后, 生成了 Deming 回归 y = 1.7x ( 图 4A), 且没有显著的比例偏差或常值偏差 (p>.5) 这些方法之间的 Altman-Bland 一致性证明, 本文所述的 UPLC-MS/MS 方法具有 -4.9 (95 CI - 1.3~.5) 的负平均偏差 ( 图 4B) 35 A 8 B 偏差 (-4.9) 3 6 Waters UPLC-MS/MS (pmol/l) 差异 CI 95 一致性限度 (-45.8 ~ 36.) CI 带 Deming 拟合 ( x) CI LC/MS/MS (pmol/l) 平均值 (pmol/l) 图 4.A) Deming 回归, 比较了 Waters UPLC-MS/MS 分析方法与另一种 LC-MS/MS 分析方法 ;B)Altman-Bland 一致性, 显示了 Waters UPLC-MS/MS 方法与另一种 LC-MS/MS 方法之间的差异 结果本研究为血浆的分析开发了一种高灵敏度 高选择性的临床研究方法 此方法仅使用 2 µl 的样品即可在低生理浓度的 (42 pmol/l) 分析中达到足够的分析灵敏度 得益于高选择性的色谱分离, 以及采用 SPE 方法通过阴离子交换去除干扰物, 此法可提供干净的色谱图, 有助于在整个浓度范围内精准定量 分析方法的自动化与样品追踪功能相结合, 改进了实验室工作流程并减少了样品处理操作, 从而有效避免了潜在的操作人员错误 参考文献感谢南曼彻斯特大学医院 ( 英国威森肖 ) 临床生物化学系的 Brian Keevil 教授及其同事提供匿名血浆样品 仅供研究使用 不适用于诊断 Waters The Science of What s Possible ACQUITY UPLC Oasis CORTECS UPLC Xevo 和 MassLynx 是沃特世公司的注册商标 TargetLynx 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 215 年沃特世公司 中国印刷 215 年 1 月 ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 (4)

Dominic Foley Michelle Wills 和 Lisa Calton 沃特世公司 ( 英国威姆斯洛 ) 应用优势 优化分析灵敏度, 准确定量低生理浓度的类固醇 通过去除干扰物有效提升分析选择性, 进而改善重现性 利用多孔板实现自动化, 提高 LC-MS/MS 分析的样品通量 简介睾酮 雄烯二酮和硫酸脱氢表雄酮 (DHEAS) 是属于雄激素的类固醇激素, 与性别特征的调节有关 通过 LC-MS/MS

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