ZH 全血中合成大麻素

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弟榔凌
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1 Xin Zhang, Jonathan P. Danaceau 和 Erin E. Chambers 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势可省略活化和平衡步骤的简单 SPE 方案所有测试化合物均可实现高效回收和低基质效应用于全血中合成大麻素及其代谢物分析的一种快速通用萃取方法与蛋白质沉淀法相比, 磷脂去除率 >95% 针对各种合成大麻素及其代谢物的定量具有出色的准确度和精密度简介 Oasis PRiME HLB 是一种新型反相固相萃取 (SPE) 吸附剂, 能够简化和加快 SPE 流程, 同时相较其他样品制备方法能够获得更洁净的萃取液使用 Oasis PRiME HLB, 使用省略了活化和平衡步骤的 3 步法 ( 上样 - 清洗 - 洗脱 )SPE 流程, 可成功从全血样品中萃取 22 种合成大麻素及其代谢物整个化合物组均可获得出色的回收率, 并且能够将基质效应 (ME) 控制在适当范围内所有化合物获得的结果具有良好的一致性, 变化差异较低此外,Oasis PRiME HLB 与蛋白质沉淀 (PPT) 相比, 能够去除全血样品中超过 95% 的磷脂我们使用沃特世 Oasis PRiME HLB 30 mg 萃取板萃取了 22 种合成大麻素及其代谢物, 所有化合物的校准曲线范围为 ng/ml 我们利用质控样品在整个校准浓度范围内获得了准确精密的定量结果对于这些不同类别的药物及其代谢物的分析 ( 包括中性分子酸和碱 ) 证明了该方法能够应用于不同化学性质, 并可用于新化合物的方法开发, 必要时也可对该方法作出适当的调整沃特世解决方案 PRiME HLB 30 mg 萃取板 CORTECS UPLC C 18, 90Å, 1.6 m, 2.1 x 100 mm 色谱柱 ( 部件号 ) ACQUITY I-Class 系统 Xevo TQD 质谱仪 Xevo TQD 质谱仪 2 ml 96 孔收集板 ( 部件号 18022) 关键词合成大麻素 UPLC 法医毒理学全血固相萃取 CORTECS 实心核 Oasis PRiME HLB 磷脂去除 1

实验 LC 条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱 : CORTECS UPLC C 18, 90Å, 1.6 m; 2.1 x 100 mm( 部件号 1807095) 柱温 : 30 C 进样体积 : 5 L 流速 : 0.6 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ 水溶液流动相 B: 0.

2 实验 LC 条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱 : CORTECS UPLC C 18, 90Å, 1.6 m; 2.1 x 100 mm( 部件号 ) 柱温 : 30 C 进样体积 : 5 L 流速 : 0.6 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ 水溶液流动相 B: 0.1% 甲酸的乙腈溶液梯度 : 初始条件为 30% 的流动相 B 流动相 B 在 2 min 内增加至 %, 并在 % 保持 1 min, 再在 4 min 内增加至 90%, 然后在 0.2 min 内返回至 30% 重新平衡系统 1.3 min 整个循环时间为 8.5 min 表 1 列出了溶剂梯度 MS 条件 MS 系统 : Xevo TQD 电离模式 : ESI+ 采集模式 : MRM( 请参阅表 2 和 3 获取离子通道信息 ) 毛细管电压 : 1 kv 碰撞能量 (ev): 针对各化合物优化 ( 见表 2) 锥孔电压 (V): 针对各化合物优化 ( 见表 2) 数据管理采用沃特世 MassLynx 软件 4.1 版 (scn 855) 采集和分析所有数据, 并使用 TargetLynx TM 软件进行定量利用 IntelliStart TM 优化质谱条件材料 AM2233 JWH-015 RCS-4 JWH-203 RCS-8 JWH-210 JWH-073 和 JWH-018 均购自 Cerilliant( 德克萨斯州圆石 ) 所有其他化合物和代谢物购自 Cayman Chemical( 密歇根州安阿伯 ) 各种储备液 (1 mg/ml) 采用甲醇 DMSO 或 : DMSO/ 甲醇配制所有化合物的混合储备液 (10 µg/ml) 用甲醇配制工作溶液使用 % 甲醇每日现配校准和质量控制 (QC) 样品由不同浓度的工作标准液加入基质 ( 全血 ) 中配制而得所有分析物的校准浓度范围为 ng/ml 配制的质量控制样品在全血中的浓度为和 75 ng/ml 本文中所分析的 22 种化合物列于表 1 中, 构成了一组包含各类法医毒理学相关合成大麻素的化合物其中包括金刚烷甲酰吲哚类 (AM 12 和 AKB) 萘甲酰吲哚类(JWH 022) 苯乙酰吲哚类 (RCS-4 和 RCS-8) 和四甲基环丙基吲哚类 (UR-1 和 XLR11) 还包括 JWH-073 和 JWH-018 的主要代谢物, 由于其中一些化合物为质谱碎片相同的结构异构体, 因此对其准确定量需要达到足够的色谱分离度样品制备使用 Oasis PRiME HLB 30 mg 萃取板萃取样品将 0.1 ml 的 0.1 M 硫酸锌 / 醋酸铵溶液加入 0.1 ml 全血中, 并涡旋混合 5 s 使血细胞溶解然后在所有样品中加入 0 µl 乙腈进行沉淀全部样品涡旋 10 s 并在 7000 rcf 速度下离心 5 min 然后将上清液在上样前用 1.2 ml 水稀释样品直接加载到 Oasis PRiME 30 mg 萃取板上, 无需活化和平衡使用 25:75 甲醇 : 水清洗所有孔洞 2 次, 每次 0 µl, 用 90/10 乙腈 / 甲醇洗脱 2 次, 每次 0 µl 洗脱液在氮气条件下挥发, 并在 100 µl 的 30% 乙腈中复溶将 5 µl 样品注入 UPLC 系统分析物回收率按照以下公式计算 : ( ) 峰面积 A % 回收率 = x 100% 峰面积 B 其中,A= 所萃取样品的峰面积,B = 萃取样品后加入化合物的峰面积基质效应按照以下公式计算 : ( ) 基质效应 = x 100% 存在基质时的峰面积是指在萃取后加入化合物的分析物的峰面积无基质时的峰面积指在纯溶剂中的分析物的峰面积 2

3 结果与讨论色谱实心核 CORTECS 颗粒设计结合了最佳的色谱柱填装技术, 可获得出色的色谱性能使用 20 ng/ml 校准标准品获得的所有化合物代表性色谱图如图 1 所示使用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱 (90Å, 1.6 m, 2.1 x 100 mm), 在 7.5 min 内完成所有分析物的分析, 总循环时间为 8.5 min 所有化合物的峰形良好, 无明显的拖尾或不对称, 且在 5% 基线处的所有峰宽小于 3 s 时间 (min.) 流速 (ml/min.) %A %B 表 1. 流动相梯度流动相 A 和流动相 B 的组成列于方法小节中回收率和基质效应本应用纪要中的合成大麻素及其代谢物包含中性酸性和碱性化合物使用 Oasis PRiME HLB 吸附剂能够同时萃取所有待测化合物及其代谢物, 无论它们具有何种官能团根据实验部分所述的公式计算回收率和基质效应 (ME), 结果如图 2 所示采用本文的萃取方案, 所有化合物能够实现几乎完全回收, 并且大多数分析物的基质效应极小除一种化合物外, 其他所有化合物的回收率均大于或等于 80%, 所有化合物的平均回收率为 91% 所有化合物的回收率一致性好, 平均 %RSD 为 5% 整个化合物组的基质效应非常低仅两种化合物的基质效应略微超过 %, 其余化合物基质效应均低于 25% 平均基质效应程度仅为 17% 该组合成大麻素的高回收率和极低的基质效应表明 : 使用 Oasis PRiME HLB 通过简单的上样 - 清洗 - 洗脱流程应用于其他相关化合物时能够获得类似的结果 100 % % , 10 11, , 图种合成大麻素及其代谢物的 UPLC/MS/MS 色谱图 Recovery 22 ME Time Time 1) AM ) RCS4, M10 3) RCS-4, M11 4) AM 12 5) JWH 羧基代谢物 6) JWH 羧基代谢物 7) JWH 羧基代谢物 8) JWH-073 (+/-) 3- 羧基代谢物 9) JWH 羧基代谢物 10) JWH-018 (+/-) 4- 羧基代谢物 11) JWH ) RCS-4 13) JWH ) JWH ) XLR-11 16) JWH ) JWH ) RCS-8 19) UR-1 20) JWH ) AB ) AKB 图 2. Oasis PRiME HLB µelution 板从全血中萃取的合成大麻素的回收率和基质效应图中的条柱和误差条柱分别表示平均值和标准偏差 (N=6) 3

4 磷脂去除 Oasis PRiME HLB 的重要特征之一是能够获得较其他样品制备方法更洁净的萃取液达到这个效果的途径之一是去除内源性磷脂图 3 显示了相同样品分别通过 Oasis PRiME HLB 萃取和蛋白质沉淀处理后所得磷脂分析对比色谱图与蛋白质沉淀 (PPT) 相比,Oasis PRiME HLB 去除了超过 95% 的磷脂 ( 图 3), 获得了更洁净的萃取液这意味着基质效应将得到有效的降低色谱柱的寿命会更长, 并且质谱离子源的维护频率也会相应降低 Oasis PRiME HLB 萃取蛋白质沉淀标准曲线性能准确度精密度和灵敏度为了评估分析方法的线性和分析灵敏度, 我们为所有组分建立了浓度范围为 ng/ml 的校准曲线此外, 还对浓度为和 75 ng/ml 的质量控制样品 (N=4) 进行了萃取和分析所有化合物的校准曲线 R2 值和 QC 总结数据汇总于表 2 中实验在低中和高浓度范围内均获得了准确的质量控制 (QC) 结果低浓度 QC 样品 (2.5 ng/ml) 的准确度范围为 %( 化合物 AM2233 除外 ), 平均值为 102% 所有分析物( 一个例外 ) 的中高浓度 QC 样品所得结果非常出色, 准确度在期望值的 15% 范围之内并且, 大多数分析物的 RSD% 低于 10%, 最大不超过 15%, 表明分析精度非常好各浓度水平 ( 低中和高 ) 下的准确度评估结果显示, 平均回收率介于 93%-104% 之间大多分析物的定量限能达到 0.1 ng/ml 且不大于 1 ng/ml 这些结果未使用氘代内标, 再次证明了使用 Oasis PRiME HLB 的一致性图 3. Oasis PRiME HLB 萃取与蛋白质沉淀的磷脂残留色谱对比比例一致 QC 浓度 (ng/ml) R 2 准确度 % %RSD 准确度 % %RSD 准确度 % %RSD 平均值 AM RCS4, M RCS 4, M JWH-073, 4-COOH JWH-073, 4-OH JWH-018, 5COOH JWH-073, 3-OH JWH-018, 5-OH JWH-018, 4-OH MET JWH RCS JWH JWH XLR JWH JWH RSC UR JWH AB AKB 平均值表 2. 所有化合物的 R2 值和质量控制结果下方的平均值表示所有化合物在特定浓度下的平均值右侧的值表示各个化合物在整个 QC 浓度范围内的平均值 4

5 编号化合物 RT 分子式孔电压 1 AM C 22 H 23 IN 2 O 2 RCS-4, M10 1. C 20 H 21 NO 3 3 RCS-4, M C 20 H 19 NO3 4 AM C 26 H N 2 O 5 JWH 丁酸代谢物 2.47 C 23 H 19 NO 3 6 JWH 羟丁基代谢物 2.51 C 23 H 21 NO 2 7 JWH 戊酸代谢物 2.71 C 24 H 21 NO 3 8 JWH-073 (+/-) 3- 羟丁基代谢物 2.74 C 23 H 21 NO 2 9 JWH 羟基戊基代谢物 2.84 C 24 H 23 NO 2 10 JWH-018 (+/-) 4- 羟基戊基代谢物 2.89 C 24 H 23 NO 2 11 JWH C 23 H 21 NO 12 RCS C 21 H 23 NO 2 14 JWH C 24 H 21 NO 13 JWH C 23 H 21 NO 15 XLR C 21 H 28 FNO 16 JWH C 21 H 22 ClNO 17 JWH C 24 H 23 NO 18 RCS C 25 H 29 NO 2 19 UR-1 6. C 21 H 29 NO 20 JWH C 26 H 27 NO 21 AB C 24 H 31 NO 22 AKB 7.05 C 23 H 31 N 3 O MRM 通道碰撞能量表 3. 本应用纪要中的合成大麻素化合物及其代谢物的分子式保留时间和 MS/MS 条件先列出的是定量通道, 然后是确证通道 5

母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 496. 184. 35 30 0. 184. 35 30 2. 184. 35 30 4. 184. 35 30 704. 184. 35 30 758. 184. 35 30 7. 184. 35 30 784. 184. 35 30 786. 184. 35 30 806. 184. 35 30 808. 184. 35 30 参考文献 1.

6 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 参考文献 1. Danaceau, J. P, Chambers, E. E., and Fountain, K. J, Analysis of synthetic cannabinoids from urine for forensic toxicology using Oasis HLB µelution Plates and CORTECS UPLC Columns, Waters Application note p/n EN 表 4. 磷脂的 MS/MS 条件结论本应用纪要重点介绍了 Oasis PRiME HLB 的使用, 这是一种新型反相 SPE 吸附剂, 它能够在去除几乎所有内源性磷脂的同时简化和加快 SPE 流程使用简单的上样 - 清洗 - 洗脱策略, 无需任何吸附剂活化或平衡步骤, 即可从全血样品中萃取一组 22 种合成大麻素整个化合物组的平均萃取回收率为 91%, 平均基质效应程度仅为 17% 所有化合物获得的结果具有良好的一致性,%RSD 均值为 5% 此外, 相比蛋白质沉淀法, 本文的方法能够去除超过 95% 的磷脂定量结果同样出色即使不使用氘代内标, 校准曲线仍具有良好线性, 其中 21 种化合物 ( 共 22 种 ) 的 R 2 值为 % 的 QC 结果处于目标值的 15% 范围内, 并且所有 %RSD 均小于 15% 总之,Oasis PRiME 能够实现良好的一致性高回收率和低基质效应, 并能基本去除全血样品中的内源性磷脂即使不使用氘代内标, 也能获得出色的定量结果扫一扫, 关注沃特世微信沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, The Science of What s Possible, UPLC, Xevo, MassLynx, Oasis, CORTECS, ACQUITY UPLC 和 ACQUITY 是沃特世公司的注册商标 TargetLynx 和 IntelliStart 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 2015 年沃特世公司印制于中国 2015 年 5 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海广州成都香港免费售后服务热线 800 (0)

[ 应用纪要 ] [ 应用纪要 ] 使用 Oasis HLB µelution 板和 CORTECS UPLC 色谱柱对尿液中的合成大麻素进行法医毒理学分析 Jonathan P. Danaceau Erin E. Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美

[ 应用纪要 ] [ 应用纪要 ] 使用 Oasis HLB µelution 板和 CORTECS UPLC 色谱柱对尿液中的合成大麻素进行法医毒理学分析 Jonathan P. Danaceau Erin E. Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美 Jonathan P. Danaceau Erin E. Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势用于分析尿液中合成大麻素及其代谢物的一种快速通用的提取方法结构异构体可达到基线分离 CORT ECS TM UPLC 色谱柱与全多孔颗粒色谱柱相比提高了分离效率和分离度采用 µelution 板无需蒸发步骤即可富集样品