4. 前处理方法 称取 2.0g 奶粉样品或 5ml 液态奶样品, 加入 20mL( 对于液态奶添加 15ml)1/1 的乙腈水溶液溶解, 手摇震荡混匀, 然后均质混匀 2 分钟, 室温下 8000r/min 离心 15 分钟, 取上清液过 0.2um 滤膜 ; 对于某些样品由于糖含量很高, 所以过

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1 ACQUITY UPLC-ELSD 测定奶粉和牛奶中八种糖的含量 赵淑军 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京实验室中国 关键词 超高效液相色谱奶粉牛奶 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose ( 麦芽四糖 ) 实验方法 1. 材料 试剂和仪器 乙腈为色谱纯, 三乙胺为优级纯, 实验用水为超纯水 (18MΩ,TOC 3ppb), 牛乳清蛋白标准品 Bα-La Bβb-Lg 和 Bβa-Lg;ACQUITY UPLC 超高效液相色谱系统,ACQUITY ELSD 检测器,FILTER MIXER (425μl,P/N ) 2. 色谱条件 液相系统 : Waters ACQUITY UPLC 配 ACQUITY ELSD 蒸发光检测器 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH TM Amide 2.1mm x 100mm,1.7 μm 柱温 : 35 C 分析时间 : 18 min 进样量 : 5ul( 样品进样 2ul) 流动相 : A: 水 B:0.2%TEA 乙腈溶液, 梯度洗脱 弱洗溶剂 : 乙腈 / 水 =90/10,800ul 强洗溶剂 : 乙腈 / 水 =10/90,500ul 进样方式 : 不充满定量环 ( 使用针溢出 ) ELSD 条件 : 增益 : 500 数据率 : 10pps 喷雾器模式 : 冷却 漂移管温度 : 55 气体压力 : 30psi 实验室试验温度 : 20 实验室试验湿度 : 45% 工作电源 : 220V 稳定电源 梯度方法见下表 : 表 1 检测梯度表 时间 / (min) 流量 / (ml/min) A% B% 曲线 3. 数据处理系统 Empower 初始

2 4. 前处理方法 称取 2.0g 奶粉样品或 5ml 液态奶样品, 加入 20mL( 对于液态奶添加 15ml)1/1 的乙腈水溶液溶解, 手摇震荡混匀, 然后均质混匀 2 分钟, 室温下 8000r/min 离心 15 分钟, 取上清液过 0.2um 滤膜 ; 对于某些样品由于糖含量很高, 所以过滤后的样品可能需要用乙腈 / 水 =70/30 的溶液稀释一定倍数后, 进样检测 结果与讨论 1. 标准配制八种糖标准分别称取 10mg, 用 1/1 的乙腈水定容 1ml, 然后用乙腈 / 水 =70/30 的溶液稀释配制各个浓度的标准品, 进行实验 2. 八种糖 UPLC 分离检测色谱图及数据 图 1 八种糖 UPLC 分离检测色谱图 图 1 是八种糖 50ppm 混合标准品用 UPLC(ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱 ) 分离,ELSD 检测的色谱图, 按照保留时间顺序分别是 :Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 ); 包括 5 种单糖和 3 种多糖 有关数据见下表 表 2 八种糖标准品分离分析数据 名称 保留时间 ( 分钟 ) 面积 % 面积 高度 ( 微伏 ) 峰类型 USP 分离度 s/n Fructose 找到 58 Sorbose 找到 Glucose 找到 Sucrose 找到 Maltose 找到 Lactose 找到 Maltotriose 找到 Maltotetraose 找到 其中较难分离的 Fructose( 果糖 ) 和 Sorbose( 山梨糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) 和 Lactose( 乳糖 ) 均分别达到 的分离度 3. 方法的检出限 如图 2 所示, 为 5ppm 的混标色谱图, 此浓度下按保留时间顺序八种糖的信噪比分别达到 和 3,( 进样量 10ul):

3 图 2 5ppm 的混标色谱图 可见, 八种糖中 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) 和 Maltotetraose( 麦芽四糖 ) 的检测限为 5ppm; 此浓度下 Lactose( 乳糖 ) 可达到定量限, 而 Sucrose( 蔗糖 ) 的定量限可以到达 2ppm 4. 方法的线性相关性 浓度分别为 mg/l 的八种糖标准品依次进样, 进样量均为 5EL, 外标法定量 以峰面积 A 的 lg 值为纵坐标, 浓度 C 的 lg 值为横坐标进行线性回归, 得到 8 种糖的线性方程 复相关系数和线性曲线图如图 3- 图 10 所示, 在 mg/l 范围 8 中糖均具有良好的 lg-lg 线性关系 图 3 Fructose 工作曲线和方程 图 4 Sorbose 工作曲线和方程 图 5 Glucose 工作曲线和方程 图 6 Sucrose 工作曲线和方程 图 7 Maltose 工作曲线和方程 图 8 Lactose 工作曲线和方程 图 9 Maltotriose 工作曲线和方程 图 10 Maltotetraose 工作曲线和方程 5 实际样品检测结果 从市场取某一奶粉样品, 进行实际提取实验, 进样检测, 色谱图及结果数据见图 11 所示, 可以看出此样品中含有蔗糖 乳糖 麦芽三糖和麦芽四糖四种糖成分, 同时发现蔗糖和乳糖得含量相当高, 已经超出检测器的响应范围 ; 因此将此样品稀释 100 倍后再次进样检测, 结果数据见图 12

4 名称 保留时间 ( 分钟 ) 面积 % 面积 高度 ( 微伏 ) 积分类型 含量 单位 Frucose 丢失 Sorbose 丢失 Glucose 丢失 Sucrose BB ug/g Maltose 丢失 Lactose BB ug/g Maltotriose BB ug/g Maltotetraose BB ug/g 图 11 奶粉提取样品色谱图及结果数据 名称 保留时间 ( 分钟 ) 面积 % 面积 高度 ( 微伏 ) 积分类型 含量 单位 峰类型 Frucose 丢失 缺失 Sorbose 丢失 缺失 Glucose 丢失 缺失 Sucrose BB ug/g 缺失 Maltose 丢失 缺失 Lactose BB ug/g 找到 Maltotriose 丢失 缺失 Maltotetraose 丢失 缺失 图 12 奶粉提取样品稀释 100 倍色谱图及结果数据 由图 11 和 12 的数据可以知道此奶粉中含有蔗糖 16.8mg/g 乳糖 140.1mg/g 麦芽三糖和麦芽四糖的含量分别只有 1.9mg/g 1.3mg/g 某液态奶提取后, 稀释 100 倍检测结果见图 13

5 名称 保留时间 ( 分钟 ) 面积 % 面积 高度 ( 微伏 ) 积分类型 含量 单位 峰类型 Frucose 丢失 缺失 Sorbose 丢失 缺失 Glucose 丢失 缺失 Sucrose 丢失 缺失 Maltose 丢失 缺失 Lactose BB ug/g 找到 Maltotriose 丢失 缺失 Maltotetraose 丢失 缺失 6 重现性 图 13 液态奶提取样品稀释 100 倍色谱图及结果数据 首先用 50ppm 混合标准 6 次连续重复进样, 考察标准品在本方法下的稳定性, 见图 14 所示重叠色谱图, 重复数据见表 3 表 4 组份摘要 : 保留时间 图 14 50ppm 标准品 6 次连续进样重叠色谱图 表 3 8 种分析物标准 6 次连续进样保留时间重现性 样品组名 采集日期 Fructose Sorbose Glucose Sucrose Matose Lactose Matotriose Matoteraose ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) ( 分钟 ) 1 tang_ :05:13CST tang_ :24:09CST tang_ :08:23CST tang_ :46:15CST tang_ :49:28CST tang_ :27:19CST Mean Std.Dev %RSD

6 组份摘要 : 面积 样品组名 采集日期 表 4 8 种分析物标准 6 次连续进样峰面积重现性 Fructose Sorbose Glucose Sucrose Matose Lactose Matotriose Matoteraose 1 tang_ :05:13CST tang_ :24:09CST tang_ :08:23CST tang_ :46:15CST tang_ :49:28CST tang_ :27:19CST Mean Std.Dev %RSD 提取奶粉实际样品, 由于乳糖含量较高, 将其稀释了 100 倍, 然后在不同天次连续 3 天进样检测, 考察本方法对于实际样品天间的重现性情况, 如图 15 所示是该实际样品 3 天内 3 次进样的重叠色谱图, 有图可见该方法对实际样品在天间具有较好的重现性 图 15 实际奶粉提取样品天间重叠色谱图 结论 : 本方法建立了用 Waters UPLC-ELSD 系统检测奶粉和牛奶实际样品中 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 )8 种常见糖的的定量分析方法 方法的检出限为有 6 种糖达到 5μg/g, 两外两种糖 Sucrose 和 Lactose 在 5μg/g 下的信噪比可达到 24 和 12 使用 ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱和三乙胺流动相体系,8 种糖均实现基线分离, 可以用于奶粉和牛奶中常见这 8 种糖的含量测定 参考文献 : Waters ACQUIT Y U P LC B EH Amide Columns Care & Use,P/ N: 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 年沃特世公司 于中国印制 2012 年 10 月 免费售后服务热线 :800 (400)

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图 1 八种糖 UPLC 分离检测色谱图 Fructose Sorbose 表 2 八种糖标准品分离分析数据 Glucose ACQUITY UPLC-ELSD 测定奶粉和牛奶中八种糖的 赵淑军沃特世科技有限公司 关键词 : 超高效液相色谱奶粉牛奶 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 ) 实验方法 材料 试剂和仪器乙腈为色谱纯,

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