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1 Agilent ZORBAX

2 Agilent ZORBAX HPLC... phzorbax

3 ...2 ZORBAX ZORBAX ZORBAX USP ZORBAX...19 ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX Eclipse XDB ZORBAX 80Å StableBond ZORBAX Rx ZORBAX 80Å Extend-C ZORBAX Bonus-RP ZORBAX ZORBAX ZORBAX ZORBAX ZORBAX 1.8 µm ZORBAX 3.5 µm ZORBAX ZORBAX 1.0 mm ZORBAX ZORBAX PrepHT Ultron ZORBAX...89 ZORBAX 300Å StableBond ZORBAX 300Å Extend-C ZORBAX Poroshell ZORBAX Eclipse (AAA) ZORBAX GF-250 GF ZORBAX SAX SCX

4 ZORBAX Eclipse Plus LC Eclipse Plus 600 bar ZORBAX (RRHT) 1.8 µm LC ZORBAX Eclipse LC

5 Agilent HPLC 40 Agilent 1200 ZORBAX RRHT 1.8 µm LC 60% , ZORBAX RRHT 1200 HPLC 3

6 ZORBAX Eclipse ZORBAX Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse 1.8 µm 7 µm... ph 1.8 µm 7 µm 600 bar ZORBAX 20 60% 4

7 ZORBAX USP Agilemt ZORBAX HT Eclipse Plus USP ph ph 5

8 LC H 2 O H 2 O 19 > > "Practical HPLC Methodology and Applications," Brian A. Bidlingmeyer, John Wiley & Sons, Inc., New York, p

9 ZORBAX ZORBAX ZORBAX RP-HPLC Eclipse Plus ph µm QA/QC Eclipse XDB StableBond (SB) ph (ph 2-9) µm ph C18 90 C C8 C3 Aq 80 C ph C18 C8 C3 CNAq (TFA) LC/MS (TFA) µm ZORBAX Rx Bonus-RP Extend-C18 ph SB Rx-C8 SB-C8 ph ph ph 3.5 µm pka ph ph 11.5 LC/MS ph 3.5 µm ZORBAX ZORBAX ph SB SB ph 51 ZORBAX ODS Classic ph SB XDB

10 ZORBAX HPLC HPLC ZORBAX MW < 2000 MW > Å 300Å 80-20Å 300Å (300SB) Eclipse Plus C18 StableBond 300SB-C18 C18 C mm 4.6 mm LC/MS (mm) mg ml/min ug ml/min + HPLC ug ml/min ++ LC/MS ug µl/min ++++ LC/MS 0.5, ug 1-15 µl/min LC/MS 0.1, ng nl/min LC/MS mg 5-10 ml/min mg mg ml/min 1 8

11 ZORBAX MW < 2000 MW > µm 5µm 5 µm 3.5µm HT 1.8µm 3.5µm 5 µm 60% 1.8 µm 200% 3.5µm Poroshell 5µm 3.5 µm Poroshell 150 mm 150 mm 5 µm 150 mm 250 mm (3.5 µm) 75 mm 50 mm 150mm (3.5 µm) (50 mm) Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm Eclipse Plus C x 75 mm, 3.5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 50 mm, 3.5 µm bar Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm ZORBAX Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm

12 HPLC 5000 (60-100Å) 300Å HPLC 5 µm 3.5 µm 1.8 µm 3.5 µm 1.8 µm 3.5 µm LC 50 mm 1.8 µm RRHT LC LC 400 bar 4.6 x 150 mm 4.6 x 75 mm (4.6 x 250 mm) mm ZORBAX ZORBAX SIL ZOR- BAX Rx-SIL ZORBAX SIL ZORBAX Rx-SIL ZORBAX Rx-SIL Eclipse StableBond ZORBAX SIL 10

13 ZORBAX C18 C8 C3 CN C8 C18 C8 ph (THF) 200 nm ph ph ph ph ph 2 4 ph HPLC / 11

14 USP (USP) USP USP L1 L1 L7 L11 (RRHT) USP USP (µm) (Å) L µm 1.8, 3.5, 5, 7 ZORBAX Eclipse Plus C18 ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18 ZORBAX StableBond SB-C18 ZORBAX Extend-C18 ZORBAX Rx-C18 ZORBAX ODS ZORBAX ODS Classic L µm ZORBAX Sil ZORBAX Rx-Sil L7 L8 L10 L11 L13 L14 L20 L33 L35 L56 L µm 10 µm 3 10 µm µm 3 10 µm 10 µm 3 10 µm 4, ,000 ph 3 10 µm 5 µm 120 ZORBAX Eclipse Plus C8 ZORBAX Eclipse XDB-C8 ZORBAX SB-C8 ZORBAX Rx-C8 ZORBAX C8 3, , 3.5, 5, 7 3.5, 5 3, ZORBAX NH ZORBAX Eclipse XDB-CN ZORBAX SB-CN ZORBAX CN ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX SB-Phenyl ZORBAX 3.5, 5 3.5, 5 3, 5 3.5, 5 1.8, ZORBAX TMS 5 70 ZORBAX SAX 5 70 ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX SB-C3 3.5, 5 80 Ultron ES-OVM

15 ZORBAX ph 1-12 ph ph ph ph ph ph 1 ph ph ph ph ph 1 HPLC ph pka ph pka 6.5 ph < 3 - A ph 7 - B ph > 9 - C ph RP-HPLC / ph ph LC/MS ph (TFA) pka ph ph SiOH ph 4-5 SiO TEA Rx-SIL Rx-SIL ph 13

16 ph (ph 2-3) ph ph 2-3 ph ph ph ph mm (ph 2-3) LC/MS ph LC/MS ph ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph Eclipse Plus Eclipse Eclipse Plus ph 2-9 ph

17 ZORBAX ph ph Eclipse Plus Eclipse XDB C18 C8 StableBond SB-C18 SB-C8 SB-Phenyl SB-CN SB-C3 SB-Aq ph ph ph 1-2 StableBond ph 15

18 ph (4-9) ZORBAX Eclipse Plus ph ph Eclipse Plus C18 ph Eclipse Plus ph 9 ph - ph ph 6-9 ph ph ph Eclipse Plus C18 ph=7 ph ph LC/MS ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl CN Bonus-RP ph ph Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-CN Bonus-RP Bonus-RP 100% 16

19 ZORBAX ph 3 2a Eclipse XDB 60 C Stablebond C ph 7 ph 9 1 ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph 2.5 (2-3) mm T=30 C 60 C 0.5 < k < % (v/v) < k < Eclipse XDB-C18 C8 SB-CN AQ Bonus-RP 1 5 ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph 7 (6-9) mm T = 30 C 40 C 0.5 < k < % (v/v) < k < ZORBAX Eclipse XDB Bonus-RP 5 9 ZORBAX Extend-C18 ph 10.5 (9-11.5) 5-20 mm mm T = 25 C 40 C 0.5 < k < 20 ph ph 1a ZORBAX SB-C18 SB-C8 ph mm T = 30 C 90 C 0.5 < k < 20 1c 5% (v/v) 5c 5% (v/v) 1b 10 mm mm ph < k < 20 1d 5% (v/v) 1e 0.5 < k < 20 5a 10 mm mm ph < k < 20 5b 5d 0.5 < k < 20 10a < k < 20 HPLC 17

20 HPLC Agilent HPLC mm ZORBAX 400 bar PEEK 1/16 LC ZORBAX 3.5 µm 1.8 µm ZORBAX ZORBAX Prep LC/MS LC/MS/MS Eclipse XDB ph 2-9 StableBond ph 2000 psi 135 bar 13.5 MPa 1/16 LC mm 18

21 ZORBAX ZORBAX ZORBAX ph ZORBAX ZORBAX Eclipse Plus HPLC ZORBAX Eclipse XDB HPLC ZORBAX StableBond HPLC ph ZORBAX Rx HPLC ph 9 ZORBAX Extend-C18 HPLC ph ZORBAX Bonus-RP HPLC - ZORBAX ZORBAX ZORBAX HPLC A 19

22 ZORBAX Eclipse Plus LC... Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Eclipse Plus Eclipse Plus µm LC LC LC Eclipse 1.8 µm 7 µm 20

23 ZORBAX ph HPLC 1.8µm Eclipse Plus ph ZORBAX Eclipse Plus C18 95Å 160 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse Plus C8 95Å 160 m 2 /g 60 C % 21

24 Eclipse Plus: : Eclipse Plus C18 Ace 5 C18 SunFireC18 XBridgeC18 Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm 1 2 : : : : A 60% B 40% 1.0 ml/min UV 254 nm EN DiscoveryHS C18 LunaC18 (2) GeminiC18 XTerra MS C min Eclipse Plus C18 C8 RRHT RR A B Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm Eclipse Plus C x 50 mm, 3.5 µm 1. Oxybenzone 2. Internal Std. 3. Octylmethoxycinnamate : : (30:70) : 2.0 ml/min : 30 C : UV 230 nm 100 C 0.45 µm bar N: 8800 Pw: min. TF: 1.20 N: Pw: min. TF: 1.06 N: Pw: min TF: min N: 5000 Pw: min. TF: 1.09 N: 6600 Pw: min. TF: 0.99 N: 6300 Pw: min. TF: min. 88 bar min C8 RRHT C8 22

25 ZORBAX ph 2 ph 7 : Eclipse Plus C x 50 mm, 5 µm 1 : % B/3 min ph 2.7 A 0.1% B 0.1% fa ph 7.0 A 20 mm B: Excedrin ph m 1 ph min m Eclipse Plus C18 C8 ph Eclipse Plus C8 Eclipse Plus C18 A B Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm : : : 80% 8mM K 2 HPO 4 ph ml/min UV 215 nm 0.05 µg/µl 0.5 µl Tf= min Tf= min C8 C18 Eclipse Plus C8 C

26 ZORBAX Eclipse Plus A XBridge C x 150mm 5µm A 1 N = Tf = N = Tf = B Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm min B 1 N = Tf = 1.01 N = Tf = min : A 0.1% B 0.1% : 1.0 ml/min : 0.0 min 10% B 15 min 30% B : 40 C : UV 254 nm EN Eclipse Plus A Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm A Tf = 1.00 O O N + Cl - OCH 3 1. : A 50% 8 mm K2HPO4 ph 7 B 50% ACN : 1.0 ml/min : : UV 254 nm EN 0.4 mg/ml 2 ul OCH min B Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm B Tf = min 24

27 ZORBAX ZORBAX Eclipse Plus Eclipse Plus C18 USP L1 Eclipse Plus C8 USP L7 (mm) (µm) 4.6 x x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x x x x x x x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x / 4.6 x / 2.1 x

28 O CH 3 Si ZORBAX Eclipse XDB O O CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 Si CH 3 ph (ph 2-9) 1.8 µm 7 µm CH 3 CH 3 O Si CH 3 CH 3 CH 3 O Si CH 3 Eclipse XDB Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 C8 ph (ph 2-9) Eclipse XDB ph (2-3) ph (6-8) ph Eclipse XDB ph µm Eclipse XDB C18 ph ZORBAX Eclipse XDB-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse XDB-C8 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse XDB- 80Å 180 m 2 /g 60 C % Phenyl ZORBAX Eclipse XDB-CN 80Å 180 m 2 /g 60 C % 26

29 ZORBAX ZORBAX Eclipse XDB ph : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 1.5 ml/min : 40 C A : ph % 25 mm ph % B : ph % 20 mm ph % ACN N- 3. N- ZORBAX Eclipse XDB ph ph 2-9 ph 3 60 C : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 70% 50 mm NaAc-HCl ph % ACN 65% 35% : 1.0 ml/min : 60 C : ZORBAX SB-C8 P/N ZORBAX Eclipse XDB-C8 P/N Competitive C Eclipse XDB ph ph Eclipse ph 3 SB-C8 60 C ph 3 12,000 (amitriptyline) Eclipse XDB 27

30 ph 7.0 : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 60% ACN 40% 250 mm ph 7.0 : 1.5 ml/min : 60 C : Rx-Sil sil-gel - ph 7 (60 C) (250 mm)- Eclipse XDB StableBond A Eclipse XDB-C x 75 mm, 3.5 µm B ZORBAX Rx/SB-C x 75 mm, 3.5 µm : 70% 25 mm NaH2PO4 ph % : 1.0 ml/min : 35 C Time (min) Time (min) Eclipse XDB StableBond 28

31 ZORBAX Eclipse XDB A B C Eclipse XDB-Phenyl x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm : 15% :85% : 1.0 ml/min : 35 C : O Eclipse XDB C18 C8 Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-C8 : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 85% 25 mm Na 2 HPO 4 ph 7:15% : 1.0 ml/min : 35 C : Cefoxatime Eclipse XDB-C8 A Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm B C Eclipse XDB-CN x 150 mm, 5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : A. 60:40 : B. 60:40 : C. 77:23 : : 1.0 ml/min : 25 C : Eclipse XDB-C18 Eclipse XDB-CN 29

32 ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 XDB-Phenyl USP L11 XDB-CN USP L10 (, 400 bar) 9.4 x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 30

33 ZORBAX ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 17 x PrepHT 2/ XDB-Phenyl USP L11 XDB-CN USP L10 (mm) ( ) 4.6 x x x x / 4.0 x (, 400 bar) 4.6 x / 4.6 x (µm) XDB-C18 USP L1 2.1 x / 2.1 x XDB-C8 USP L7 31

34 ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 ( ) 4.6 x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 2.1 x x x x x x x x x x

35 ZORBAX ZORBAX 80Å StableBond ph ph 1 ph SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-Phenyl SB-C3 SB- Aq B Agilent ZORBAX StableBond (SB-C18) SB-C8 SB-C3 SB-Phenyl SB-CN SB-Aq ph StableBond StableBond ph ZORBAX StableBond O OH O OH R Si R R Si R R R 1 R 1 * ph * ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 90 C % SB-C18 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-C8 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-C3 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-Phenyl ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-CN ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C SB-Aq *StableBond ph ph 6-8 <40 C M ph Eclipse XDB Bonus-RP O Si R StableBond R

36 StableBond SB-C18 ph ph C : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : ZORBAX Rx-C x 150 mm, 5 µm : 50% /50% 1.0% : 90 C Relative Retention Stablebond SB-C18 -C18 ZORBAX Rx-C18 -C18 A-C18 B-C18 C-C18 D-C18 E-C18 Column Volumes of Mobile Phase Purge PH (0.8) (90 C) StableBond SB-C18 ZORBAX Rx-C18 StableBond SB-C18 ZORBAX SB-CN ph (ph C) : ZORBAX SB-CN x 150 mm, 5 µm % k Remaining ZORBAX StableBond SB-CN StableBond ph CN Column Volumes SB-CN A ZORBAX SB-C x 75 mm, 3.5 µm B ZORBAX SB-CN x 75 mm, 3.5 µm : 30% 70% 25mM NaH 2 PO 4 ph 2.5 : 1.0 ml/min : 35 C Time (min) Time (min) SB-CN 50% 34

37 ZORBAX RRHT mau : (40%): 60% ph=2.4 25mM NaH 2 PO 4 : 1.85 ml/min 5 3, 4 & A SB-C x 50 mm, 1.8 µm B SB-C x 50 mm, 1.8 µm C ZORBAX SB-Phenyl x 50 mm, 1.8 µm D ZORBAX SB-CN x 50 mm, 1.8 µm min DAD 254 nm LC Agilent 1200 RR LC 1 µl StableBond 5 SB-Aq A ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm D ZORBAX SB-Phenyl x 150 mm, 5 µm B ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm E ZORBAX SB-CN x 150 mm, 5 µm C ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm SB-C3 StableBond SB-C3 Rx-SIL : 18.8 min 0-100% B A 50 mm NaH 2 PO 4 ph % / 5% B 50 mm NaH 2 PO 4 ph % / 53% : 1.0 ml/min : 26 C : : 254 nm d

38 ZORBAX 80Å StableBond (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 SB-CN USP L10 SB-C3 USP L56 SB-Phenyl USP L11 SB-Aq (, 400 bar) 9.4 x x x x x x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 36

39 ZORBAX ZORBAX 80Å StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-C3 SB-Phenyl (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L56 USP L11 SB-Aq 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x x / 2/ 9.4 x / 4.6 x / 2.1 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 17 x / PrepHT 2/ *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm ( ) 4.6 x (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 4.6 x x / 4.0 x

40 ZORBAX 80Å StableBond (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 (, 400 bar) 4.6 x / 4.6 x x / 2.1 x ( ) 4.6 x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 2.1 x x x x * 0.5 x x x x x x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 38

41 ZORBAX ZORBAX Rx Eclipse XDB-C18 StableBond SB-C18 Rx-C18 ph StableBond SB-C18 12% 10% ph Rx-C18 Rx-C18 ph 9 Rx-C8 SB-C8 ph ZORBAX Rx-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Rx-C8 80Å 180 m 2 /g 60 C % Rx-C18 : : : ZORBAX Rx-C x 250 mm, 5 µm 35% :65% 0.5 ml/min Rx-C18 (USP) 4.6 x 250 mm 3.0 mm Rx- C18 60% 39

42 ZORBAX Rx Rx-C18 Rx-C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7** 9.4 x x x x x x x x x x x * 2.1 x / 9.4 x / 4.6 x / 2.1 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ *RR 3.5 µm **Rx-C8 SB-C8 40

43 ZORBAX ZORBAX 80Å Extend-C18 ph ph 11.5 ph LC/MS O Si C18 ZORBAX Extend-C18 C18-C18 ph ph ph ph ph ph 10.5 LC/MS ph Extend-C18 ph Extend-C18 ph * ph ZORBAX Extend-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % * ph 8 60 C ph C O Si C18 Silica Support Extend C-18 C18-C

44 Extend-C18 ph : : : : : : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm ph 7 30% 20 mm Na2HPO4 70% ph 11 30% 20 mm 70% 1.0 ml/min 254 nm ph ph Extend-C18 ph Time (min) Time (min) Extend-C18 ph : : : : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm 20% 80% 0.1 M ph ml/min ph W ZORBAX Extend-C18 ph Amount of Dissolved Silica (mg) ZORBAX Extend-C18 W Volume Eluent (L) 42

45 ZORBAX Extend-C18 ph : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm : 80% 25 mm NaH2PO4 ph % : 1.0 ml/min : 35 C : 254 nm : Extend-C18 ph Extend-C18 ph ph Time (min) ZORBAX 80Å Extend-C18 (mm) (, 400 bar) 4.6 x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x (µm) 43

46 ZORBAX 80Å Extend-C18 (mm) (µm) 2.1 x x * 2.1 x * 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 44

47 ZORBAX ZORBAX Bonus-RP ph ph 100% O CH 3 R 1 Si R 1 PG R Agilent ZORBAX Bonus-RP ph Bonus-RP C18 C8 Si CH 3 CH 3 R 1 O Si R 1 PG R CH 3 * ph ZORBAX Bonus-RP 80Å 180 m 2 /g 60 C % * ph 8 60 C ph C Si CH 3 CH 3 R 1 O Si R 1 PG R Bonus-RP ZORBAX Bonus-RP A ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm B Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 75% 25 mm ph 6 25% : 1.0 ml/min : : 254 nm : 3 µl Time (min) Bonus-RP 45

48 Bonus-RP : Alkye-C8 4.6 x 150 mm 5 µm : 75% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min : 40 C : 254 nm C8 Bonus-RP ph Bonus-RP TF Time (min) Bonus-RP 2 : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm : 80% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min : 40 C : 254 nm TF Time (min) 46

49 ZORBAX ph ph ZORBAX Bonus-RP : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm : 60% 25 mm ph 7.0:40% ACN : 1.5 ml/min : 23 C Toluene Plate Height, cm / Bonus-RP Column Volume of Purge Bonus-RP ph 7 10,000 -C18/ Bonus-RP : : : : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm 50% 50% 0.1% 80% 20% 1.0 ml/min 60 C 23 C Toluene Plate Height, cm -C18/ Bonus-RP Column Volume of Purge ph 47

50 ZORBAX Bonus-RP (mm) (, 400 bar) 4.6 x x x x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x *RR 3.5 µm (µm) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x

51 ZORBAX ZORBAX ph 2-9 Eclipse ph StableBond ph (1-11.5) ph ph ZORBAX StableBond 4.6 x 150 mm 5 µm SB-C18 SB-CN SB-Phenyl StableBond 4.6 x 75 mm 3.5 µm SB-C18 SB-CN Eclipse XDB 4.6 x 150 mm 5 µm XDB-C18 XDB-C8 XDB-Phenyl Eclipse XDB 4.6 x 75 mm 3.5 µm XDB-C18 XDB-C8 ph 4.6 x 150 mm 5 µm SB-C18 XDB-C18 Extend-C18 ph 4.6 x 75 mm 3.5 µm SB-C18 XDB-C18 Extend-C x 150 mm 5 µm SB-Aq Bonus RP SB-C x 75 mm 3.5 µm SB-Aq Bonus RP SB-C

52 ZORBAX ZORBAX HPLC (302) custom_columns@agilent.com

53 ZORBAX ZORBAX ZORBAX A (mm) (µm) ODS (C18) USP L1 C8 USP L7 USP L11 USP L10 TMS USP L13 (, 400 bar) 9.4 x x x x x x ( ) 2/ 9.4 x / 4.6 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 2/

54 Zorbax ZORBAX Rx-SIL (>99.995%) ZORBAX-SIL ZORBAX Rx-SIL HILIC ZORBAX Eclipse XDB-CN Rx-SIL ZORBAX Rx-SIL ZORBAX CN ZORBAX SIL ZORBAX SIL ZORBAX NH2 - ZORBAX SIL HPLC A D 52

55 ZORBAX ph ZORBAX Rx-SIL 80Å 180 m 2 /g ZORBAX Eclipse XDB-CN 80Å 180 m 2 /g % ZORBAX SIL 70Å 300 m 2 /g ZORBAX CN 70Å 300 m 2 /g % ZORBAX NH 2 70Å 300 m 2 /g % ZORBAX CN ZORBAX CN : ZORBAX CN x 250 mm, 5 µm : A B 2- / (50/50) : 2 ml/min : 10 min. B 2-20% 20% : 50 C : 278 nm (n = 10) Time (min) 53

56 Zorbax (mm) (µm) XDB-CN USP L10 Rx-SIL (, 400 bar) 9.4 x x * 4.6 x * 2.1 x * 2.1 x ( ) 2/ 9.4 x / 4/ 4.6 x x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x * 54

57 ZORBAX (3.5 µm) (1.8 µm) Eclipse XDB StableBond Eclipse Plus RR RRHT ZORBAX 4.6 mm 50% HPLC LC/MS ZORBAX HPLC 2.1 mm 5 ZORBAX ZORBAX Ultron 55

58 ZORBAX (RR) ZORBAX 600 bar RRHT Agilent % 1.8 µm ZORBAX LC RRHT LC, (RR) (RRHT) ZORBAX 1.8 µm Agilent HPLC 30-40% 56

59 ZORBAX 1.8 µm 1.8 µm [600 bar] 2 25% 95% HPLC mm ZORBAX (1.8 µm) 1.8 µm 250 mm 95% 80 RRHT ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX (Eclipse XDB StableBond Extend) 3.5 µm 1.8 µm HT HPLC 600 bar Agilent 1200 RRHT-1100 LC Agilent

60 1100 Agilent 1100 RRHT LC 1100 (VWD) 4.6 x 50 mm 1.8 µm (3) VWD 5 µl DAD SL DAD (MWD) 4.6 x 50 mm 1.8 µm (2) DAD 5 µl 2.1 x 50 mm 1.8 µm (2) DAD 1.7 µl LC/MS : : : : : 50 C : Eclipse XDB-C x 30 mm, 1.8 µm A 0.1% FA B 0.075% FA 18 65% B/2 min 65-88% B/3 min 276 nm 2g 10 ml + 10 µl 10 min 0.45 µm 1 µl mau mau mau Naringin confirmed by LCMS Grapefruit Rind min Hesperidin confirmed by LCMS Lime Rind min Citrus Flavonoids min

61 20X : : : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm , A:H2O B: ACN 1.2 ml/min, 1.0 ml/min, 2.4 ml/min 0.0 min 50% B 11/1.2/0.4 min 100% B : 40 C, 40 C, 95 C : UV 254 nm : Alkylphenones A 0 B 0 C min min 1. C3-Alkylphenone 2. C4-Alkylphenone 3. C5-Alkylphenone 4. C6-Alkylphenone 5. C7-Alkylphenone 6. C8-Alkylphenone 7. C9-Alkylphenone 8. C10-Alkylphenone 9. C12-Alkylphenone min : ZORBAX SB-C x 50 mm, 3.5 µm : ZORBAX SB-C x 50 mm, 3.5 µm (N) (N) : : : : 25% 75% 1.5 ml/min 254 nm µm 59

62 A B C D : : : : Eclipse XDB-C x 250 mm, 5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 75 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 50 mm, 1.8 µm 73% : 27% 25 mm ph ml/min 254 nm A 25 cm 5 µm 11.5 min (3.5 µm) B C HT 2.2 min 80% A B : : : Eclipse XDB-C x 100 mm, 1.8 µm Eclipse XDB-C x 100 mm, 3.5 µm A B 0.5 ml/min 0.0 min 50% B 20.0 min 100% B : 40 C : UV 254 nm : A B mau min mau min C3-3. C4-4. C5-5. C6-6. C7-7. C8-8. C9-9. C C C14- : SB-C x 50 mm, 1.8 µm : A 60% B 40% : 1 ml/min : 80 C : UV 254 nm : QC 60

63 (1.8µm) (3.5µm) N (3.5 µm)* N (1.8 µm) ,000 32, ,000 24, ,500 17,000** , N 1/2 * 5 µm HPLC 40% N 4.6 mm ** ZORBAX 600 bar 9000 psi Eclipse Plus C18 (mm) (µm) USP L1 600 bar 4.6 x Eclipse Plus C8 USP L7 Eclipse XDB-C18 USP L1 Eclipse XDB-C8 USP L7 Extend- C18 USP L1 600 bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 1.0 x bar 1.0 x

64 ZORBAX 600 bar 9000 psi SB-C18 SB-C8 SB-Phenyl SB-CN (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L11 USP L10 SB-Aq 600 bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 1.0 x

65 Zorbax 400 bar 6000 psi XDB-C18 XDB-C8 SB-C18 SB-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L1 USP L7 USP L1 4.6 x / 4.6 x x / 2.1 x ( ) 4.6 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 2.1 x x /

66 ZORBAX 3.5 µm (4.6 mm) (2.1 mm) 5 µm Agilent ZORBAX 3.5 µm 5 µm mm mmlc/ms 3.5 µm 5 µm ZORBAX A ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm B ZORBAX Bonus-RP x 75 mm, 3.5 µm Time (min) C ZORBAX Bonus-RP x 50 mm, 3.5 µm : 80% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min 1.5 ml/min 0.3 ml/min : 40 C : 254 nm Time (min) Time (min) µm LC/MS 64

67 : ZORBAX SB-C x 75 mm, 3.5 µm : A 25 mm NaH 2 PO 4 ph 3.0 B : 2.0 ml/min : 35 C : 254 nm Time (min) Time (min) Time (min) 4.6 x 75 mm 3.5 µm ZORBAX 3.5 µm Eclipse (mm) Eclipse Plus C18 USP L1 Eclipse Plus C8 USP L7 Eclipse XDB-C18 USP L1 Eclipse XDB-C8 USP L7 Eclipse XDB-Phenyl USP L11 Eclipse XDB-CN USP L10 (µm) 4.6 x x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm 65

68 ZORBAX 3.5 µm StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-Phenyl SB-C3 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L11 USP L56 SB-Aq 4.6 x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x x / 4/ 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm 66

69 ZORBAX 3.5 µm Rx Bonus-RP Extend-C18 *RR 3.5 µm Rx-C18 Rx-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 Bonus-RP USP L1 4.6 x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x

70 ZORBAX 4.6 mm 60% S/N 2 3 LC/MS LC ZORBAX 3.0 mm 4.6mm 50% LC/MS 0.5 ml/min (APCI) (APPI) MS 4.6 mm 2 3 HPLC 60% A B : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm 20% : 80% 0.2 M Na2HPO M ph Time (min) Time (min) mm 50% 68

71 A B : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm 25% : 75% 0.4% 254 nm ,7-4.6 mm 2-3 HPLC Time (min) LC/MS : ZORBAX SB-C x 100 mm, 3.5 µm A 70% + 0.4% B 30% + 0.4% ml/min A UV 254 nm B APCI C LC/MS MS APCI 0.5 ml/min Time (min) 69

72 ZORBAX 80Å StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-C3 SB-Phenyl (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L56 USP L11 SB-Aq 3.0 x x x x ZORBAX 300Å StableBond 300SB-C18 300SB-C8 300SB-CN 300SB-C3 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L x x ZORBAX 80Å Eclipse XDB XDB-C18 XDB-C8 XDB-Phenyl XDB-CN (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L11 USP L x x x x x ZORBAX 80Å Bonus-RP Rx Rx-C18 Rx-C8 (mm) (µm) Bonus-RP USP L1 USP L7 3.0 x x x x ZORBAX 80Å Extend-C18 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 3.0 x x x x x

73 ZORBAX 1.0 mm LC/MS 1 mm 2.1 mm 5 50 µl/ HPLC 400 bar StableBond SB-C18 SB-C8 300SB-C18 Eclipse XDB-C18 XDB-C8 Bonus RP Extend C-18 Poroshell 1.8 µm ZORBAX 300SB-C18 : ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm : 60 min 2-60% B A 0.1% B 0.075% /80% : 50 µl/min : 50 C : 215 nm 2 µl rhgh 1.0 mm 71

74 ZORBAX 1.0 mm SB-C18 SB-C8 300SB-C18 300SB-C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L1 USP L7 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x SB-CN USP L10 ** 1.0 x / 1.0 x XDB-C18 XDB-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 Bonus-RP USP L1 * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x bar** 1.0 x / 1.0 x (mm) (µm) Poroshell Poroshell 300SB-C18 300SB-C8 Poroshell 300SB-C3 Poroshell 300Extend-C x / 1.0 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 72

75 ZORBAX LC/MS mm 80Å 300Å / Agilent ZORBAX mm mm HPLC LC/MS SCX 73

76 A B C D E F ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX 300Extend-C x 150 mm, 3.5 µm : % ph = 2.2 = A % = B 0.5%B/min 0 min = 1%B 60 min = 31%B 70 min = 50%B 75 min = 85%B 80 min = 85%B 81 min = 1%B 110 min = 1%B : 5.5 µl/min µl/min : 30 C : 206/10 nm 450/80 nm 0.1 µl ng/100 nl ng/100 nl ng/100 nl ng/100 nl 5. II 20 ng/100 nl Time (min) ZORBAX

77 : : : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm 200 ng 0.3 mm 4.6 mm mm mm 2000 Time (min) 75

78 : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : A 75% 0.4% B 25% 0.4% : 20 µl/min : 25 C : 0.1 µl StableBond-C x 150 mm 5 µm (k) 0.8% RSD (a) 0.4% RSD Time (min) 76

79 LC/MS ZORBAX HPLC 1100/ SCX 1100/ /1200 LC/MSD 1100/ SCX 1100/ /1200 LC/MSD 77

80 HPLC 2-D HPLC : : : : : MS : ZORBAX 300SB-C x 5 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm : 3% /0.1% : A =, 0.1%, B =, 0.1% : 30 µl/min : 300 nl/min : : 6 min = 3%B, 120 min = 60%B, 125 min = 80%B, 130 min = 80% B, 131 min = 3%B, 140 min = 3% B : Nano ESI, : 5L/min,.: 225 C. : : 1:35 V, : 115 V, 1:12 V, 2:3.5 V, : 80 V. ICC: on, : 4, : 150 ms; ,, MS/MS : 1-8 µl Salt Step Elution: 8ml 10 mm-100 mm KCI ( 10 mm ), 125 mm, 150 mm, 200 mm, 300 mm, 500 mm, 1M. Time (min) 30 mm KCI 60 mm KCI 75 mm KCI 120 mm KCI (BSA) HPLC BSA 78

81 ZORBAX Poroshell Eclipse 300SB- 300Extend Bio-SCX (mm) (µm) SB-C18 XDB-C18 C18 300SB-C8 300SB-C8 C18 II 0.8 x x x x x * 0.5 x x x x x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x / *RR 3.5 µm 300SB-C18 (mm) (µm) USP L1 ** 0.1 x ** x SB-C8 USP L7 * x /5/ 0.3 x / *RR 3.5 µm 79

82 ZORBAX PrepHT ZORBAX 2000 mg 5 7 µm 5000 psi/350 bar ZORBAX PrepHT Eclipse XDB StableBond Bonus-RP Extend-C18 ZORBAX PrepHT 5 7 µm ZORBAX 100 ml/min ZORBAX PrepHT 21.2 mm 150 mm 7 µm 80

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