血浆中溴鼠灵测定方法 1. 范围 本操作规程规定了检测血浆中溴鼠灵浓度的方法 本操作规程适用于中毒人群血浆中溴鼠灵浓度的测定 2. 规范性引用文件 (1) GBZ/T 职业卫生标准制定指南第 5 部分 : 生物材料中化学物质测定方法 ; (2) 主要参考文献 : [1] Xinf
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1 血浆中溴鼠灵测定 操作规程 编制人 : 李海斌宋爽编制单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所编制日期 :2015 年 11 月
2 血浆中溴鼠灵测定方法 1. 范围 本操作规程规定了检测血浆中溴鼠灵浓度的方法 本操作规程适用于中毒人群血浆中溴鼠灵浓度的测定 2. 规范性引用文件 (1) GBZ/T 职业卫生标准制定指南第 5 部分 : 生物材料中化学物质测定方法 ; (2) 主要参考文献 : [1] Xinfeng Dong, Shuxuan Liang and Hanwen Sun. Determination of seven anticoagulant rodenticides in human serum by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry.anal. Methods, 2015,7, [2] Vandenbroucke V, Desmet N, De Backer P, et al. Multi-residue analysis of eight anticoagulant rodenticides in animal plasma and liver using liquid chromatography combined with heated electrospray ionization tandem mass spectrometry[j]. Journal of Chromatography B, 2008, 869(1): [3] Vudathala D, Cummings M, Murphy L. Analysis of multiple anticoagulant rodenticides in animal blood and liver tissue using principles of QuEChERS method[j]. Journal of analytical toxicology, 2010, 34(5): 血浆中溴鼠灵的超高效液相色谱 - 质谱 / 质谱测定方法 3.1 原理血浆样品经乙腈沉淀蛋白 无水硫酸镁等无机盐相分离 吸附剂分散固相萃取前处理后, 真空浓缩至干并用甲醇定容, 经 Waters Acquity UPLC BEH-C18 柱分离后, 用三重四级杆质谱仪以 MRM 模式进行检测, 保留时间与定性离子对 ( ) 定性, 外标法定量 3.2 仪器 塑料离心管,2 ml 15 ml 容量瓶,10 ml 25 ml 移液器,100 μl 1000 μl
3 3.2.4 分析天平, 感量 0.1 mg 离心机, r/min 涡旋混合器 真空浓缩仪 超高效液相色谱串联质谱 / 质谱仪 色谱条件 色谱柱 :Waters Acquity UPLC BEH-C18,2.1 mm 50mm 1.7μm); 流动相 :A: 甲醇, 流动相 B:4mmol ph=6.4 的乙酸铵溶液 ; 柱温 :40 ; 流速 :0.25 ml/min; 进样体积 5μl; 运行时间 5 min; 梯度洗脱程序 : 见表 1 表 1. 梯度洗脱程序 时间 /min %A %B Curve 起始 质谱条件离子源 :ESI 源 ; 扫描模式 : 负离子 MRM 扫描 ; 源参数 :CUR:40.00psi,CAD:Medium,IS: V,TEM:600.00, GS1:25.00psi,GS2:25.00psi; 定量定性离子对信息 : 见表 2; 化合物离子对电参数信息 : 见表 3 表 2. MRM 扫描模式定量定性离子对 化合物名称 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 溴鼠灵 表 3. 化合物离子对电参数信息 离子对 DP/V EP/V CE/V CXP/V
4 3.3 试剂 实验用水为去离子水 甲醇 (CH3OH), 色谱纯 乙腈 (HCN), 色谱纯 乙酸铵, 分析纯 无水硫酸镁, 分析纯 氯化钠, 分析纯 柠檬酸氢二钠, 分析纯 柠檬酸三钠, 分析纯 DSC-18 固体吸附剂 PSA( 乙二胺 -N- 丙基硅烷 ) 固体吸附剂 流动相 :A: 甲醇, B:4mmol ph=6.4 的乙酸铵溶液 溴鼠灵, 纯度 98% 溴鼠灵标准储备溶液 [ρ( 溴鼠灵 )=20 μg/ml]: 准确称取 1.0 mg 溴鼠灵, 于 50 ml 容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度 此溶液为 20 μg/ml 溴鼠灵标准储备液 溴鼠灵标准应用溶液 [ρ( 溴鼠灵 )=0.2 μg/ml]: 准确吸取溴鼠灵标准储备溶液 0.5 ml, 于 50 ml 容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度 此溶液为 0.2 μg/ml 溴鼠灵标准应用溶液 3.4 样品的采集 运输和保存在样品的采集 运输和保存过程中, 应注意冷藏密封, 并尽快送达实验室, 以防止样品污染, 保证待测物稳定, 不变质, 不损失 3.5 分析步骤 样品处理准确移取 1.0 ml 血浆样品 样品空白 试剂空白于 15 ml 塑料离心管中, 加入 1.0 ml 乙腈, 涡旋震荡 2 min,3000 rpm 离心 5min, 将上清液转移至新的离心管中 ; 加入无水 MgSO4 0.65g,NaCl 0.15g, 柠檬酸氢二钠 0.09g, 柠檬酸三钠 0.17g, 涡旋震荡 2 min,3000 rpm 离心 5min,-4 冷冻 1h; 将上清液转移至新的离心管中, 加入无水 MgSO4 0.15g,DSC g,PSA0.026g, 涡旋震荡 2 min,3000 rpm 离心 5min, 将上清液转移至 2.0 ml 塑料离心管, 真空浓缩至干,1.0 ml 甲醇复溶待测 标准曲线的配制和回归方程的计算标准曲线的配制见表 4:
5 表 4. 标准曲线的配制 编号 S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 溴鼠灵标准应用溶液体积 (μl) 甲醇定容至 10 ml 浓度 (μg/l) 参照仪器操作条件, 将液相色谱质谱仪调节至最佳测定状态, 分别进样 5.0μl, 测定各标准系列 以测得的定量离子的峰面积对相应的待测物浓度 (μg/l) 计算回归方程 样品的测定按照前处理方法对样品 样品空白 试剂空白进行处理, 进行液相色谱质谱仪 MRM 模式测定, 测得峰面积值后, 由回归方程计算相应的待测物的浓度 (μg/l) 3.6 计算测定结果按下式计算样品中溴鼠灵的浓度 C : 血浆中溴鼠灵的浓度,μg/L; c : 测定溶液中溴鼠灵的浓度,μg/L; n : 为样品前处理的浓缩倍数, 本方法为 1, 根据样品实际浓缩倍数选择 3.7 质量控制 在测定样品的同时, 测定样品空白, 试剂空白及仪器空白, 结果应在允许 范围内 测定样品时至少做 2 个平行样, 相对标准偏差应 10% 测定样品的同时做低 中 高三个水平的加标回收, 加标回收率应在 75%~105% 3.8 注意事项 前处理过程中, 样品中加入 MgSO4 等盐类后, 应立即进行涡旋振荡, 以 防止样品混合不均匀 ; 为了更好的使样品溶液的相分离, 加入 MgSO4 等盐类 涡旋振荡及离心 后, 应置于 -4 摄氏度冷冻 1h
6 技术报告 一 溴鼠灵的理化性质 CAS 号 : ; 分子式 :C31H23BrO3; 分子量 :532.14; 性状 : 原药为白色至灰色结晶粉末 ;20 时溶解度为 : 几乎不溶于水和石油醚 可溶于氯仿 丙酮, 微溶于苯 二 样品前处理 三 UPLC-MS/MS 检测的仪器条件 1. 液相条件 1.1 流动相 :A: 甲醇 ;B:4mmol ph=6.4 的乙酸铵溶液 ; 1.2 色谱柱 :ACQUITY UPLC TM BEH C18,2.1 50mm 1.7µm; 1.3 柱温 :40 ; 1.4 流速 :0.25 ml/min;
7 1.5 进样体积 :5 μl; 1.6 运行时间 :5 min; 1.7 梯度洗脱程序 : 见表 1 表 1. 梯度洗脱程序 时间 /min %A %B Curve 起始 质谱条件 2.1 离子源 :ESI 源 ; 2.2 扫描模式 : 负离子 MRM 扫描 ; 2.3 源参数 :CUR:40.00psi,CAD:Medium,IS: V,TEM:600.00, GS1:25.00psi,GS2:25.00psi; 2.4 定量定性离子对信息 : 见表 2; 2.5 化合物离子对电参数信息 : 见表 3 表 2. MRM 扫描模式定量定性离子对 化合物名称 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 溴鼠灵 表 3. 化合物离子对电参数信息 离子对 DP/V EP/V CE/V CXP/V 四 方法学验证 1. 标准曲线与线性范围 溴鼠灵的标准曲线 : 见图 1. 线性范围为 :1-60 μg/l 图 1. 溴鼠灵的标准曲线
8 2. 方法的检出限与定量限取六份空白血浆, 各 1.0 ml, 分别向其中加入 25μL 浓度为 40μg/L 的溴鼠灵标准溶液 ( 加标浓度为 1μg/L), 按照上述前处理步骤净化样品测定, 计算六份样品测定结果的标准偏差, 得方法的检出限 (3 倍的标准偏差 ) 与定量限 (10 倍的标准偏差 ) 如表 4: 表 4. 方法的检出限与定量限加标量加标样品测定值 (μg/l) 均数标准检出限定量限 (μg/l) (μg/l) 偏差 (μg/l) (μg/l) 方法的准确度与精密度 3.1 方法的准确度及日内精密度取空白血浆 1.0 ml 18 份, 加入 25 μl 低 ( 加标浓度为 1μg/L) 中( 加标浓度为 10μg/L) 高( 加标浓度为 50μg/L) 三个水平的溴鼠灵标准溶液, 每个水平 6 份, 按照上述前处理步骤净化样品, 上机检测, 内标法定量, 求得方法的准确度结果见表 5 6 7: 表 5. 低浓度加标样品检测结果的均值 回收率及相对标准偏差加标量加标样品测定值 (μg/l) 均数回收率 RSD (μg/l) (μg/l) (%) (%) 表 6. 中浓度加标样品检测结果的均值 回收率及相对标准偏差 加标量 加标样品测定值 (μg/l) 均数 回收率 RSD (μg/l) (μg/l) (%) (%) 表 7. 高浓度加标样品检测结果的均值 回收率及相对标准偏差加标量加标样品测定值 (μg/l) 均数回收率 RSD (μg/l) (μg/l) (%) (%) 由上表知方法的平均回收率为 :70.8%~83.2%, 相对标准偏差波动范围为 3.5%~7.7% 3.2 方法的日间精密度取空白血浆 1.0 ml 18 份, 分别加入 25 μl 低 ( 加标浓度为 1μg/L) 中( 加标浓度为 10μg/L) 高( 加标浓度为 50μg/L) 三个水平的溴鼠灵标准溶液, 每个水平 2 份, 按照上述前处理步骤净化样品, 上机检测, 内标法定量 按照上述处理方式, 重复测定 6 天, 求得方法的日间精密度结果如表 :
9 表 8. 低浓度加标样品批间精密度检测结果 加标溶度 不同时间加标样品检测结果 (μg/l) 均数 RSD (μg/l) 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天 (μg/l) (%) 表 9. 中浓度加标样品批间精密度检测结果 加标溶度 不同时间加标样品检测结果 (μg/l) 均数 RSD (μg/l) 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天 (μg/l) (%) 表 10. 高浓度加标样品批间精密度检测结果 加标溶度 不同时间加标样品检测结果 (μg/l) 均数 RSD (μg/l) 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天 (μg/l) (%) 由上表可知在加标浓度为低 中 高, 三个水平下, 日间精密度均 <10%, 符合要求 4. 方法的稳定性实验 取多份正常人血浆混匀后, 每管取 1.0 ml 样品, 各管加标量为中等浓度 10 μg/l, 混匀后置于 4 冰箱保存, 于当天 第 3 天 第 5 天, 按照第二部分 的前处理方法处理后进样测定, 结果见表 11: 表 11. 方法的稳定性实验结果 测定时间 溴鼠灵含量 (μg/l) 下降率 (%) 当天 8.53 第 3 天 第 5 天 由上表可以看出, 血浆中溴鼠灵在 4 冰箱中至少可以保存 5 天
10 5. 相关谱图 12 μg/l 溴鼠灵标准溶液谱图
11 10 μg/l 加标样品溶液谱图
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