实验方法条件 LC 条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C µm, mm ( 部件号 ) 柱温 : 进样体积 : 10 µl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ

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幕韵支
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1 [ 应用纪要 ] 使用 µelution 混合型 SPE 结合 UPLC/MS/MS 检测技术对尿液中的浴盐化合物进行法医毒理学分析 Jonathan P. Danaceau,Erin E. Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势快速, 通用的提取方法分析尿液中的合成卡西酮及代谢物对所有分析物和代谢物均有线性响应大多数分析物的回收率在 90% 以上所有化合物的基质效应低于 15% 对质谱图相同的异构体可达到基线分离无需蒸发或复溶步骤便可获得最终洗脱物简介合成卡西酮是化学品卡西酮的类似物, 它们常作为浴盐在市场上出售卡西酮天然存在于卡塔叶植物 ( 阿拉伯茶 ) 中这一类药物是中枢神经系统兴奋剂, 其药效可模拟安非他命甲基苯丙胺可卡因和哌醋甲酯等药物虽然这类药物通常被注明不适于人类使用, 但在过去几年里它们在人群中的接受和使用程度有着明显增长 1 此外, 人们正在通过修饰现有卡西酮结构不断开发并推广新药, 以规避为特定化合物设定的药物滥用法规本应用纪要详细介绍了一种成功提取和分析人体尿液样品中多种代表性合成卡西酮的法医毒理学方法通过使用混合型固相萃取 (SPE), 再进行 UPLC/MS/MS 分析, 由 10 种合成卡西酮组成的一组化合物被成功提取, 并获得了高回收率和分析灵敏度所有化合物的基质效应都很小, 并且校准曲线在 1 至 500 ng/ml 范围内呈线性对上述各类药物的分析使得此方法能够拓展于新开发的相关化合物, 必要时也可对该方法作出适当的调整沃特世解决方案 Oasis MCX µelution 板 96 孔板 ACQUITY UPLC BEH 色谱柱 ACQUITY UPLC 系统 Xevo TQD 质谱仪关键词浴盐, 卡西酮,UPLC, 法医毒理学,SPE 1

2 实验方法条件 LC 条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C µm, mm ( 部件号 ) 柱温 : 进样体积 : 10 µl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ 水溶液流动相 B: 0.1% 甲酸的乙腈溶液梯度 : 流动相 B 在 20% 的初始条件下保持 0.5 min, 在 2 min 内增加至 %, 然后在 0.1 min 内返回至 20% 重新平衡系统 1.4 min 整个循环时间为 4.0 min 样品瓶 / 板 : 96 孔样品收集板,700 µl ( 部件号 ) MS 条件质谱仪 : Xevo TQD 电离模式 : ESI+ 采集模式 : MRM( 请参阅表 1 中的离子通道 ) 毛细管电压 : 1 kv 碰撞能量 (ev): 针对具体化合物进行优化 ( 参阅表 1) 锥孔电压 (V): 针对具体化合物进行优化 ( 参阅表 1) 数据管理使用 Waters MassLynx 软件采集和分析所有数据材料 4- 甲基甲卡西酮 ( 甲氧麻黄酮,4-MMC) 3,4- 亚甲二氧基 -N- 甲基卡西酮 ( 甲基酮 ) 和亚甲基二氧吡咯戊酮 (MDPV) 均购自 Cerilliant( 德克萨斯州圆石 ) 所有其它化合物和代谢物购自 Cayman Chemical( 密歇根州安阿伯 ) 所有化合物的混合储液 (5 µg/ml) 由甲醇配制工作溶液需每天用使用基质 ( 尿液 ) 配制的标准品制备, 并进行连续稀释以得到所需浓度所有分析物的校准浓度范围为 ng/ml 本文中所分析的 10 种化合物列于表 1 中, 构成了一组包含法医毒理学相关卡西酮的化合物, 如吡咯烷基苯酮 (α-ppp,α-pv P) 亚甲二氧基卡西酮( 甲基酮, 乙基酮 ) 和甲氧基甲基卡西酮 ( 甲氧非君 ) 所有这些化合物为中等疏水性的弱碱性物质, 非常适合采用混合型离子交换进行提取所有化合物的锥孔电压 MRM 通道和各自的碰撞能量列于表 1 中样品制备采用混合型强阳离子 S P E 提取样品向每份样品, 即 100 µ L 尿液中加入等体积的 4% H 3 PO 4 进行预处理先用 200 µl 甲醇平衡 Oasis MCX µelution96 孔板 ( 部件号 BA) 中的各个孔, 然后用 200 µl MilliQ 水平衡取每份稀释样品 200 µl 加入各孔中, 使得载样量为 100 µl 尿液完成上样后, 依次用 200 µl 2% 甲酸水溶液,200 µl 甲醇清洗各孔然后, 用含 5% 浓 NH 4 OH 溶液 (Fisher, 20%-22%) 的 50 µl 60:40 ACN/IPA 洗脱所有样品, 洗脱两次加 5 µl 浓甲酸中和样品, 并用 100 µl 水进行稀释取 10 µl 注入 LC/MS/MS 系统基质效应按照以下公式计算 : = (( ) 1 ) x 100% 2

3 结果与讨论色谱所有化合物通过 50 ng/ml 校准标准品获得的代表性色谱图如图 1 所示谱峰分配列于表 1 中采用 ACQUITY UPLC BEH C µm, mm 色谱柱在 2 min 内完成所有化合物的分析, 总循环时间为 4 min 乙基酮和丁基酮( 峰 2 和 6) 为一对同分异构体, 其母离子和产物离子相同, 尽管分析时间较短, 二者仍实现了基线分离, 而这种明确的分离结果在两种化合物共流出时是无法实现的所有化合物的峰形良好, 无明显的拖尾或不对称, 且所有峰宽小于 4 s 图种浴盐化合物的 UPLC/MS/MS 色谱图谱峰分配列于表 1 中 3

4 药物替代名称保留时间分子式质量数锥孔电压 MRM 通道碰撞能量 1 甲基酮 3,4- 亚甲二氧基 -N- 甲基卡西酮 0.75 C 11 H 13 NO 乙基酮 MDEC,bk-MDEA 0.83 C 12 H 15 NO 甲氧非君 4- 甲氧基甲基卡西酮 0.84 C 11 H 15 NO α-ppp α- 吡咯烷基苯丙酮 0.86 C 13 H 17 NO MDPPP 3',4'- 亚甲二氧基 -α- 吡咯烷基苯丙酮 0.92 C 14 H 17 NO 丁基酮 Bk-MBDB 0.92 C 12 H 15 NO 甲氧麻黄酮 4- 甲基甲卡西酮,4-MMC 1.02 C 11 H 15 NO α-pvp α- 吡咯烷基苯基戊酮 1.66 C 15 H 21 NO MDPV 亚甲基二氧吡咯戊酮 1.78 C 16 H 21 NO α-pvp Met 1 α- 吡咯烷基苯基戊酮代谢物 C 15 H 23 NO 表 1. 卡西酮化合物的 MS/MS 条件和保留时间 4

5 回收率和基质效应在此应用中, 最初采用含 5% 浓 NH 4 OH 的 60:40 ACN/MeOH 溶液经 Oasis MCX µelution 板进行洗脱大多数化合物的回收率良好, 平均值大约为 80% 但是,α-PV P 羟基代谢物的回收率仅为 40% 此外, 许多被测化合物出现显著的基质效应 ( 以离子抑制的形式为主 ), 尤其是最早洗脱的三种化合物甲基酮乙基酮和甲氧非君用水代替洗脱溶剂甲醇后未发现基质效应降低, 并且 α-pv P 羟基代谢物的回收率降低为 4% 然而, 当使用异丙醇 (IPA) 代替甲醇时,α-PVP 羟基代谢物的回收率增加至 87.4%, 其它 9 种分析物的回收率平均值从 81% 增加至近 98% 此外, 所有化合物的基质效应几乎都被消除图 2 汇总了采用上述提取方法所得到的回收率和基质效应回收率范围为 87.4% 至 100.5%, 基质效应范围为 -3.6% 至 12.4%, 其平均值为 6.2% 被测化合物经上述方法提取后, 几乎得到完全回收, 并且基质效应极小 MCX µelution 用 40% IPA 洗脱回收率基质效应所有基质效应均小于 12.5% 图 2. 使用 MCX µelution 板进行 SPE 操作后从尿液中提取的浴盐化合物的回收率和基质效应图中的条柱和误差条柱分别表示平均值和标准偏差 (N=4) 5

6 线性和灵敏度为了评估分析方法的线性和灵敏度, 我们为所有组分建立了浓度范围为 1 至 500 ng/ml 的校准曲线表 2 汇总了所有化合物的 R 2 值以及与标准值的平均偏差 (N=3) 除 α-pv P 代谢物在 10 ng/ml 的校准点之外, 几乎所有校准点都在其目标值的 15% 范围之内尿液样品提取物浓度为 1 ng/ml 时, 其所有化合物的峰面积至少高于空白时的 5 倍, 且均在额定值的 5% 范围之内浓度 (ng/ml) R 2 甲基酮乙基酮甲氧非君 α-ppp MDPPP 丁基酮甲氧麻黄酮 α-pv P MDPV α-pvp 代谢物表中的值代表与标准值之间的偏差 % 表 2. 浴盐化合物校准曲线的标准曲线点准确度和 R 2 值 6

7 结论参考文献我们采用混合型 SPE 从尿液中提取了一组由 10 种合成卡西酮药物组成的化合物, 并利用 UPLC/MS/MS 进行了分析 Waters MCX µelution 板的使用为所有分析物提供了良好的回收率, 且基质效应极小此外, 提取过程中无需蒸发或复溶步骤, 从而节省了时间并消除了这些步骤所伴随的蒸发或吸附带来的样品损失风险 UPLC 分离方法能够在 2 min 内对所有化合物的同分异构体达到基线分离校准曲线在 1 至 500 ng/ml 的浓度范围内呈线性, 并且所有化合物的定量限为 1 ng/ml 本方法能够快速可靠地提取和分析这类法医毒理学重要化合物 1. Coppola M, Mondola R. Synthetic cathinones: Chemistry, pharmacology and toxicology of a new class of designer drugs of abuse marketed as bath salts or plant food. Toxicology Letters. 2012; 211(2): 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,Oasis,ACQUITY UPLC,Xevo,ACQUITY,UPLC 和 MassLynx 是沃特世公司的注册商标 The Science of What s Possible 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司印制于中国 2013 年 6 月 ZH LL-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

ZH 全血中合成大麻素

ZH 全血中合成大麻素 Xin Zhang, Jonathan P. Danaceau 和 Erin E. Chambers 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势可省略活化和平衡步骤的简单 SPE 方案所有测试化合物均可实现高效回收和低基质效应用于全血中合成大麻素及其代谢物分析的一种快速通用萃取方法与蛋白质沉淀法相比, 磷脂去除率 >95% 针对各种合成大麻素及其代谢物的定量具有出色的准确度和精密度

实验 方法条件 LC 条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C µm, mm ( 部件号 ) 柱温 : 进样体积 : 10 µl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ

实验方法条件 LC 条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C µm, mm ( 部件号 ) 柱温 : 进样体积 : 10 µl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A: 0.1% 甲酸的 MilliQ