zh_使用Oasis HLB进行生物分析的简化固相萃取(SPE)方案_review

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惟驻领毕
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1 Xin Zhang, Pamela C Iraneta, Frank J Marszalkowski Jr., Kenneth J Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势采用简单的 3 步 SPE 方案可对多种分析物进行高回收率高重现性和低基质效应的分析, 然而在硅胶 C 18 和其他厂家聚合物型吸附剂上却无法实现在 8 年多来表现出了卓越的批次重现性, 无需针对不同批次进行 SPE 方法再开发利用简化的 3 步 SPE 方案可将样品处理时间降低 4%, 平均溶剂节省 7% 沃特世解决方案 Oasis HLB µelution 板 ( 部件号 :181828BA), Oasis 1 ml 3 mg 小柱 ( 部件号 :181879) ACQUITY UPLC I-Class 系统, Xevo TQ-S 质谱仪 ACQUITY UPLC CSH,C 18 色谱柱 2.1 x 1 mm 1.7 µm ( 部件号 :185297) 简介在生物分析中, 固相萃取 (SPE) 通常被视为从复杂样品中提取目标分析物的最佳选择之一然而, 由于 SPE 耗时昂贵且操作复杂, 因此通常是分析人员的最后一个选择无可否认,SPE 能够为生物分析带来极大的优势, 包括低基质效应高样品清洁度以及低浓度的分析物 / 代谢物标准 SPE 方案包括 5 个步骤, 即活化平衡上样清洗和洗脱, 此过程耗时且操作复杂因此, 亟需一种可用于多种药物化合物及其代谢物的简化 SPE 方案在本应用纪要中, 我们介绍了一种使用 Oasis HLB µelution 板和 1 ml 小柱的简单的 3 步式 SPE 方案该方案平均可节约 4% 的样品制备时间, 7% 的溶剂消耗量, 同时提供了一种适用于多种酸性中性和碱性分析物的简单方法这一简化的 3 步方案包括上样清洗和洗脱, 无需再进行柱活化和平衡步骤实施这一简化方案的关键是使用不会发生疏水塌陷的水可浸润性 Oasis HLB 吸附剂, 这对于 SPE 过程中分析物的回收至关重要为了证明这种独特的能力, 本文将通过药物研发过程中发现的加标至尿液和血浆中的典型化合物, 对 Oasis HLB( 一种水可浸润性吸附剂 ) 与硅胶基质 C 18 和其他厂家聚合物型吸附剂进行对比这些化合物包括抗抑郁药抗逆转录病毒药以及非甾体抗炎药物使用该简化方案就回收率重现性和基质效应对 µelution 和 1 ml 规格的小柱进行了评估此外,5 至 13 年间生产的不同批次吸附剂表明,Oasis HLB 产品具有长期方法稳定性和批次一致性结果表明, 简化的 3 步方案可提供与标准的 5 步 SPE 方案相同的高分析物回收率低差异性和低基质效应, 同时还能缩短制备时间并降低总成本 1 ml 圆形收集板 ( 部件号 :182481) Trueview LCMS 认证样品瓶 ( 部件号 :185662CV) 关键词生物分析,SPE,Oasis,µElution, 血浆, 尿液,HLB 1

实验液相色谱条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱 : ACQUITY UPLC CSH C 18, 2.1 x 1 mm, 1.7 µm ( 部件号 :185297) 流动相 A:.1% 甲酸水溶液流动相 B:.1% 甲酸的乙腈溶液流速 : 5 µl/min 梯度 : 时间设置曲线 (min) %A %B 8.3 8 6 3 7 3 6 6.

2 实验液相色谱条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱 : ACQUITY UPLC CSH C 18, 2.1 x 1 mm, 1.7 µm ( 部件号 :185297) 流动相 A:.1% 甲酸水溶液流动相 B:.1% 甲酸的乙腈溶液流速 : 5 µl/min 梯度 : 时间设置曲线 (min) %A %B 柱温 : 4 C 样品温度 : 1 C 强洗针液 : ACN/ 水 (7/3), 含 2% 甲酸弱洗针液 : ACN/ 水 (7/3), 含 2% 甲酸进样模式 : 带针溢出的部分定量环进样体积 : 1 µl MS 条件 MS 系统 : Xevo TQ-S 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 2.5 kv 去溶剂气温度 :5 C 锥孔气体流速 :15 L/h 去溶剂气流速 :1 L/h 监测的 MRM 跃迁 : 见表 2 表 1 列出了被测化合物的酸性 (A) 碱性 (B) 或中性 (N) 属性 logp( 疏水常数 ) 和化合物描述使用 75% 的乙腈配制储备溶液, 使用 4% 的乙腈配制含分析物混合物的工作溶液工作溶液的浓度均为.2 g/ml, 而叠氮胸苷 (AZT) 的浓度为 3 µg/ml 取每种工作溶液 1 µl 加标至 24 µl 血浆中, 在将加标血浆上样到 SPE 设备上之前, 使用 4% 的 H 3 PO 4 以 1:1 的比率对其进行稀释对于空白血浆样品, 使用 4% 的乙腈溶液替代工作溶液作为加标物质尿液样品上样前也进行类似的样品前处理名称属性 Log P 化合物描述叠氮胸苷 (AZT) A.5 抗逆转录病毒药用于 HIV/AIDS 7- 羟基香豆素 A 1.6 在防晒霜中梯度使用, 吸收 UV 非那西汀 A 1.6 镇痛退烧倍他米松 N 1.1 抗炎和免疫抑制普罗替林 B 4.4 抗抑郁阿普唑仑 B 4.9 治疗恐慌和焦虑症阿米替林 B 4.8 抗抑郁萘普生 A 3.2 镇痛退烧表 1. 被测药物化合物的属性分析物叠氮胸苷 7- 羟基香豆素非那西汀倍他米松普罗替林阿普唑仑阿米替林萘普生普萘洛尔母离子 m/z 子离子 m/z 锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 表 2. 被测药物化合物的 MRM 跃迁碰撞能量以及锥孔电压 2

3 样品制备方案对于 Oasis HLB µelution 板 ( 部件号 :181828BA), 标准样品制备方案包括 5 个步骤, 即活化平衡上样清洗和洗脱活化和平衡步骤分别用于清洗和平衡填料, 从而使分析物能够与吸附剂发生相互作用这些步骤是非水可浸润性吸附剂 ( 例如硅胶基质 C 18 和疏水性聚合物型吸附剂 ) 的必要步骤 Oasis HLB 是水可浸润性吸附剂, 分析物可直接与其发生相互作用, 即使直接上样含水样品溶液也能被保留, 因此不需要活化和平衡步骤, 从而将处理步骤从 5 步简化至 3 步这样可平均降低 7% 的溶剂消耗量并节约 4% 的样品制备时间这些优势得益于亲水 / 亲脂填料的平衡特性 ( 图 1) 例如, 使用标准的 5 步 SPE 方案时, 处理一个 96 孔板需要 1 h 使用本应用纪要所述的简化 3 步方案, 处理相同的 96 孔板仅需 36 min 在八小时工作日中, 使用该简化方案可轻松处理 13 个板, 而非 8 个板图 2 显示了 µelution 板 5 步方案和 3 步方案的比较结果对于 1 ml,3 mg 小柱 ( 部件号 :181879), 除了上样清洗和洗脱体积为 1 ml 外, 每个方案的所有步骤都相同亲水 - 亲脂平衡共聚物亲水单体亲脂单体极性保留性能反相保留性能水可浸润性一种极清洁的吸附剂无需活化 / 平衡! 图 1. Oasis HLB 吸附剂 : 一种亲水 - 亲脂平衡共聚物标准 (5 步 ) 标准 (3 步 ) µl 甲醇 (MeOH) L H 2 O 活化 µl 加标稀释血浆 (1 µl 血浆 + 1 µl 4% H 3 PO 4 ) µl 5% 甲醇水溶液 25 µl*2 ACN:MeOH 平衡上样清洗 µl 加标稀释血浆 (1 µl 血浆 + 1 µl 4% H 3 PO 4 ) µl 5% 甲醇水溶液 25 µl*2 ACN:MeOH 洗脱图 2. Oasis HLB µelution 板的标准 (5 步 ) 和简化的 (3 步 ) SPE 方案 3

4 结果与讨论 Oasis HLB 吸附剂的水可浸润特性让科学家们能够省去活化和平衡步骤而进行生物分析, 简化了 SPE 方案然而, 使用大部分类型的 SPE 吸附剂都不能省去这些步骤为了证明这一点, 在微量洗脱板上使用大鼠血浆样品对 Oasis HLB 硅胶基质 C 18 吸附剂和竞争性聚合物型吸附剂的回收率进行了比较使用简化方案时, 硅胶基质 C 18 和竞争性吸附剂的回收率极低 ( 图 3) 相反, 使用这种 3 步方案时 Oasis HLB 吸附剂表现优异, 表明非水可浸润性或部分水可浸润性吸附剂不能用于生物分析研究中的简单样品制备 HLB Elution 板聚合物型板 tc 18 Elution 板图 3. 简化方案在 Oasis HLB 其他厂家聚合物型吸附剂和硅胶基质 C18 上获得的回收率所有的板都在微量板中进行评估接着, 分别计算了在 µelution 和 1 ml 规格小柱中使用 Oasis HLB 的标准和简化 SPE 方案时, 大鼠血浆样品和人尿液样品的回收率和基质效应回收率百分比是预加标提取样品的峰面积与后加标提取样品的峰面积的比率基质效应的计算方法为存在基质时的峰面积 ( 通过分析提取分析物后加标的空白基质测得 ) 与无基质时的峰面积 ( 分析物的溶剂标准品溶液 ) 的比率 4

5 我们获得了具有可比性的大鼠血浆和人尿液样品的回收率结果, 其平均回收率大于 8%, 且标准偏差小于 5% 使用两种方案均获得了结果相当的两种生物样品 ( 大鼠血浆和人类尿液 ) 的基质效应使用简化方案获得的基质效应为 1.±.15 图 4 总结了回收率和基质效应这些数据表明, 无论使用哪种设备形式, 使用 Oasis HLB 的简化的 3 步方案都能成功地用于常规生物分析研究中广泛的分析物我们强烈推荐将 µelution 板用于可提供的样品体积有限或需要对分析物进行浓缩 ( 浓缩高达 15 倍 ) 的分析, 无需进行蒸发和复溶小柱可单独使用, 建议在提取无需浓缩或仅需有限浓缩的少量样品时使用大鼠血浆样品回收率大鼠血浆样品的回收率 µelution 板,5 步方案 µelution 板,3 步方案大鼠血浆样品的回收率 1cc, 3 mg, 5 步方案 cc, 3 mg, 3 步方案大鼠血浆样品基质效应大鼠血浆样品的基质效应 µelution 板,5 步方案 µelution 板,3 步方案大鼠血浆样品的基质效应 1cc, 3 mg, 5 步方案 /8 1cc, 3 mg, 3 步方案.. 人类尿液样品回收率尿液样品的回收率 µelution 板,5 步方案 µelution 板,3 步方案尿液样品的回收率 1cc, 3 mg, 5 步方案 1cc, 3 mg, 3 步方案图 4. 使用 Oasis HLB µelution 板和 1 ml 小柱分别以大鼠血浆和人类尿液为基质测得的分析物回收率和基质效应 5

6 使用简化方案的潜在问题可能是上样为了证明 3 步方案可用于生物分析的常用体积, 我们使用体积在 25 至 375 µl 之间的血浆样品对简化方案进行了测试 ( 采用 µelution 板 ) 如图 5 所示, 简化方案可提供 8 11% 的回收率, 且标准偏差小于 5%, 进一步确证了该方案具有可接受的上样量且不需要活化和平衡 1 大鼠血浆样品的不同上样量 AZT 1 Propra 8 7HC 4 25µL 5µL 1µL 25µL 375µL Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz 图 5. 使用简化的 3 步方案且大鼠血浆作为基质时 Oasis HLB µelution 板的上样量各种 SPE 方法在生物分析中的重要属性是能够在较长的周期 ( 药物生命周期 ) 内获得相同结果因此, 评估 SPE 方法的批次重现性至关重要为了证明 SPE 方法在 Oasis HLB 上的长期可行性, 使用 5 至 13 年之间生产的四个不同批次的 µelution 板进行了实验结果表明, 回收率在 8 1 % 之间, 且标准偏差小于 6%(n = 4)( 图 6) 这些数据表明, 简化的 3 步 SPE 方案具有良好的重现性, 能满足跨越药物生命周期的生物分析的需求, 与 5 步方案相比, 可节约 4% 的时间和 7% 的溶剂批次重现性 5 年 9 年 11 年 13 年图 6. 在 Oasis HLB µelution 上使用简化的 3 步方案获得的批次重现性 6

7 结论一种采用 Oasis HLB 的用于生物分析的简化 3 步 SPE 方案, 具有以下优势 : 减少 4% 的样品处理时间 ( 更高的提取通量 ), 同时节约 7% 的溶剂既可使用 96 孔板也可使用小柱形式分析物回收率高批次差异性小且基质效应低适用于大鼠血浆和人尿液样品该简化方案不适用于非水可浸润性吸附剂 ( 例如硅胶基质 C 18 ) 和部分水可浸润性的疏水性聚合物型吸附剂沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, The Science of What s Possible, Oasis, Xevo 和 ACQUITY UPLC 是沃特世公司的注册商标 CSH 和 TruView 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 14 年沃特世公司印制于中国 14 年 9 月 7514ZH AG-PDF 北京 : 上海广州成都香港免费售后服务热线 8 (4)

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