MS 条件 MS 系统 : Waters TQD 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 0.8 kv 锥孔电压 : 见表 1 脱溶剂气温度 : 400 C 脱溶剂气流量 : 1000 L/h 源温度 : 120 C 采集 : MRM 分析 ( 表 1) 化合物 MRM (m/z) 锥孔能量 (V)

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1 Billy J Molloy, Lisa J Calton PhD, Donald P Cooper PhD 沃特世公司 ( 英国曼彻斯特 ) 实验使用 Waters ACQUITY TQD 系统 ( 沃特世公司, 英国曼彻斯特 ) 进行所有分析 系统配置如图 1 所示 仪器通过 MassLynx 4.1 软件在电喷雾正离子模式下运行, 并采用 TargetLynx 应用软件自动进行数据处理 对化合物依赖的锥孔电压进行优化使得进入离子源的母离子的丰度最大化, 并通过第一级四极杆选择相应的母离子进入碰撞池 利用氩气和碰撞能量促使碰撞诱导解离, 生成特征性产物离子 利用此方法建立的具体多重反应监测 (MRM) 实验如表 1 所示 UPLC 条件 UPLC 系统 : Waters ACQUITY UPLC 系统色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH 苯基色谱柱 2.1 x 50 mm, 1.7 µm 柱温 : 35 C 流速 : 450 µl/min 流动相 A: 含 2 mm 醋酸铵和 0.1% 甲酸的水溶液流动相 B: 含 2 mm 醋酸铵和 0.1% 甲酸的甲醇溶液梯度 : 在 3 min 内流动相 B 从 65% 增加至 85% 简介近年来, 血清中 25- 羟基维生素 D(25OHD) 的分析需求大大增加 维生素 D 除了影响骨骼代谢之外, 如今的一些临床研究还表明维生素 D 缺乏症与某些 1,2 癌症 多发性硬化症和心脏疾病的增发风险有关 25OHD 的浓度被认为是表征维生素 D 水平的临床指标 3, 并且对监测补充治疗具有重要意义, 它具有维生素 D2 和维生素 D3 两种形式 当 25- 羟基维生素 D2(25OHD2) 的抗体交叉反应低于 100% 时, 一些免疫检测方法可能无法测出维生素 D2 补充治疗患者的 25OHD 总浓度 4 因此, 现在许多临床实验室都采用基于 LC/MS/MS 的方法测定 25OHD, 以实现 25OHD2 和 25- 羟基维生素 D3(25OHD3) 的可靠定量 利用 LC/MS/MS 分析 25OHD 需要对样品进行预处理, 使 25OHD 从维生素 D 结合蛋白中释放出来, 最大程度降低基质效应 但是, 这些步骤不仅耗时, 而且在样品转移时易引入人为误差 本应用纪要介绍了一种半自动化样品预处理方案, 可从最初的试管操作到结果处理对样品进行全程追踪, 最后采用 UPLC/MS/MS 分析 25OHD 图 1. 沃特世 ACQUITY TQD 的系统配置 1

2 MS 条件 MS 系统 : Waters TQD 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 0.8 kv 锥孔电压 : 见表 1 脱溶剂气温度 : 400 C 脱溶剂气流量 : 1000 L/h 源温度 : 120 C 采集 : MRM 分析 ( 表 1) 化合物 MRM (m/z) 锥孔能量 (V) 碰撞能量 (ev) 25OHD > OHD3* > d 6-25OHD > OHD > OHD2* > d 3-25OHD > 表 1. 监测 25OHD2 或 25OHD3 和内标物时使用的调谐参数 * 表示可选的定性离子, 用于提高 化合物鉴别的可靠性 临床样品 校准品和质量控制标准品用于测定血清样品中 25OHD2 或 25OHD3 浓度的校准品和质量控制标准品 (QC) 得自市售产品 (Chromsystems, 德国 ) 决定检测精度所用的高浓度和中浓度 QC 样品来自市售产品 (UTAK, 美国 ), 低浓度 QC 样品通过混合 25OHD 缺乏症患者血清并加入已知浓度的 25OHD2 而制备 低 中和高浓度 QC 样品的 25OHD2 最终浓度分别为 和 81.4 ng/ml,25ohd3 最终浓度分别为 和 71.3 ng/ml 将本方法所得结果与之前在布里斯托尔皇家医院 (BRI) 临床生物化学部门通过己烷提取鉴定物并进行 (LC/MS/MS) 检测分析的 30 个临床血清样品的结果进行对比 依从英国国家研究道德服务规范, 对样品进行了匿名处理 半自动化样品制备将血清样品 校准品和 QC 标准品置于自动化液体处理系统 (LHS;Tecan Freedom EVO, 瑞士 图 2), 并利用条形码进行识别, 以追踪整个提取过程 使用甲醇沉淀蛋白质之前, 通过 LHS 将样品 (150 µl) 等分注入 96 深孔板中, 并加入内标溶液 (20 µl, 含 250 ng/ml d 6-25OHD3 或 d 3-25OHD2) 然后进行离心 ( 离线 ),LHS 将上清液转移至经调节的 Oasis µelution 固相萃取 (SPE) 板中, 并用甲醇水溶液清洗 按照与初始色谱条件的有机溶剂强度匹配的两步洗脱方案将保留的分析物用 LHS 洗脱 手动密封洗脱板并转移至 ACQUITY 自动进样器, 然后利用 ACQUITY 样品管理器的预加载功能, 取 20 µl 样品直接注入 UPLC/MS/MS 系统 这样, 进样之间的时间大约为 4.9 min 2

3 ACQUITY 自动进样器, 然后利用 ACQUITY 样品管理器的预加载功能, 取 20 µl 样品直接注入 UPLC/MS/MS 系统 这样, 进样之间的时间大约为 4.9 min 图 2. Tecan Freedom EVO 100 的系统配置 96 个样品的样品制备时间大约为 2 h, 其中仅涉及极少的手动操作 在典型实验室中,LHS 的工作流程 如下所述 工作流程 t=0: 实验室技术人员准备好患者样品 校准品 QC 标准品和试剂并手动加载至 LHS t=+30 分钟 : 实验室技术人员启动 LHS 预处理方案 t=+1 小时 15 分钟 : 实验室技术人员移去蛋白质沉淀板, 进行离线离心 t=+1 小时 20 分钟 : 实验室技术人员将板重新置于 LHS 并再次启动自动化 SPE 方案 t=+2 小时 15 分钟 : 实验室技术人员密封收集板并转移至 UPLC 自动进样器 3

4 结果线性在 ng/ml 的浓度范围内向马血清 ( 西格玛奥德里奇公司 ) 中加入已知浓度的 25OHD2 和 25OHD3, 测定检测方法的线性 对分析物每天测定一次, 连续测定 5 天, 所得的分析物浓度和响应值 ( 分析物峰面积 /IS 峰面积 ) 之间的相关性呈线性 25OHD3 的确定系数 (r2)>0.998( 图 3),25OHD2 的确定系数 >0.997 计算所得的校准品浓度均在指定值的 10% 范围之内, 偏差在额定值的 ±15% 范围之内, 被认为符合各个分析物的定量限要求 6 化合物名称 :25OHD3 相关系数 :r = ,r2 = 校准曲线 : * x 曲线类型 : 线性, 原点 : 排除, 加权 :1/x, 轴转 : 无 5 4 响应 ng/ml 图 3. 马血清中 25OHD3 的校准 曲线 精度 通过提取低 中和高浓度的 QC 样品并重复分析 5 次以测定批内精度 根据这三个浓度水平计算 25OHD 的变异系数 (CV) 对低 中和高浓度的 QC 样品进行连续 5 天的分析, 测定批间精度 结果如表 2 所示 批内精度 CV% 批间精度 CV% 低浓度 QC 中浓度 QC 高浓度 QC 250HD2 250HD3 250HD2 250HD3 250HD2 250HD 准确度通过对来自国际维生素 D 的外部质量评估计划 (DEQAS; 的 16 份外部质量控制样品进行分析, 以考察 25OHD3 检测方法的准确度 使用 Chromsystems 校准曲线计算 DEQAS 样品浓度 所有结果均在 25OHD3 的 LC/MS 方法所得结果平均值的 10.8% 偏差范围之内 4

5 % 回收率 25OHD2 和 25OHD3 在检测分析范围内的回收率大于 80%( 以空白加标马血清在提取前和提取后的分析物响应百分比表示 ) 灵敏度和特异性 25OHD3 计算浓度为 4.7 ng/ml 的患者样品的色谱图如图 4 所示 定量离子跃迁 ( m/z >159.1) 不受干扰, 峰积分可重现, 可见本方法能够检测来自维生素 D 严重缺乏症患者的样品中的 25OHD OHD3 内标 > 峰面积 患者样品 [25OHD3] 4.7 ng/ml > 峰面积 0% min 254 图 4. 低浓度 25OHD3 患者样品的色谱图 离子抑制我们在色谱条件开发过程中对离子抑制进行了研究 将源于实验室器皿和血液收集装置的磷脂, 增塑剂和脱模剂的影响最小化 样品分析对来自 BRI 的 30 份匿名患者样品进行分析并测定了 25OHD 的总浓度 运用 Passing-Bablok 方法进行回归分 5,6 析, 并采用 Bland Altman 方法 (Microsoft Office Excel2003, 带 Analyse-It 插件 1.73 版 ) 对方案进行评估 当运用 Bland Altman 差异图进行分析时, 两种分析方法 (Waters=BRI+1.3ng/mL) 之间几无差别 比较两种方法的总体回归曲线,Waters=0.98(BRI)+1.47 (r2 =0.96), 如图 5 所示 Waters [ 总 25OHD] ng/ml 鉴别 Passing & Bablok (I) 拟合 ( x) 95% CI bands BRI [ 总 25OHD] ng/ml 图 5. 散点图和 Passing-Bablok 拟合 5

6 讨论如今,LC/MS/MS 在许多实验室中被广泛用于维生素 D 的测定, 但是通常这些方法大多需要经验丰富的实验员手动进行样品处理, 才能实现成功的实施 对血清中 25OHD2 或 25OHD3 的分析表明本方法的线性良好 (r2>0.997), 连续 5 天分析所得的准确度和精度良好 此外, 本方法体现了与常规临床 LC/MS/MS 检测的良好一致性 半自动化方法运用了 Tecan Freedom EVO 100 的液体处理和样品追踪功能 LHS 极大地减少了手动操作步骤和操作变异性, 进一步确保了结果的一致性和重现性 此外,Oasis µelution 提取板技术的使用省去了耗时的溶剂蒸发和复溶步骤, 使每个工作班次可至少分析 192 个样品 本文介绍的半自动化方法克服了当前 LC/MS/MS 方法的诸多局限性 尤其是省去了一些耗时耗力的手动样品预处理步骤 这将使更多的实验室可以利用 UPLC/MS/MS 方法进行 25OHD 分析 沃特世公司致谢英国布里斯托尔皇家医院临床生物化学系的独立临床研究员 Ann Bowron 在本应用纪要制作中所提供的临床研究样品, 以及她提供的宝贵帮助和建议 参考文献 1. Gorham ED, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32: Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol 2007;103: Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary reference Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press, Washington, DC; Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating 25- Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, 2004;89(7): Passing H, Bablok W. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part 1. J Clin Chem Biochem 1983;21: Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 1986;1: MassTrak 系统和试剂盒是符合欧盟指令 98/79/EC 美国食品药品监督管理质量体系规范和现行的药品良好生产规范的体外诊断设备 沃特世公司已通过 ISO 13485:2003 认证 Waters ACQUITY ACQUITY UPLC UltraPerformance LC UPLC MassLynx Oasis 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 TargetLynx 是沃特世公司的商标 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2009 年沃特世公司中国印制 2009 年 7 月 ZH VW-PDF 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 沃特斯中国有限公司香港 : 免费售后服务热线 : 800 (400)

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