检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( $&:0 & "# 抗体的交叉反应与维生素和维生素 $ 的识别结合率不一致的限制其检测的准确性问题一直受到争议而使用液相色谱串联质谱法 2 (1/0,-)0 /-.1+)-,,-. ()/0, )/

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晓边
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1 "! 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & 文章编号!#$!" "! 中图分类号 =! 文献标志码 ' &$! & &!#$!"& & &$ 液相色谱串联质谱法检测血清羟基维生素的方法建立和性能评价宋斌斌秦嘉倩彭颖斐张春燕吴炯王蓓丽郭玮潘柏申复旦大学附属中山医院检验科上海 $ 摘要目的建立定量检测血清羟基维生素的液相色谱串联质谱 76 6 方法并对此方法进行基本分析性能验证方法使用 -) / 0 6 = 6 '7=< ; < 7 液质联用仪 76 6 同时定量检测血清中的和 $ 含量参照美国食品和药品管理局 ' 的生物分析方法验证导则标准对所建方法进行线性检出限精密度和准确性等基本性能的验证结果 76 6 检测和 $ &,0* 和 $ 的定量检出限分别为 & 和 &,0* 批内批间变异系数 / 分别为 B"C B!C 回收率为 &!C 维生素国际室间质量评价计划 =' 室间质评结果偏倚 BC 结论建立的 76 6 基本性能符合评价标准能够灵敏且准确的检测出血清中和 $ 的浓度关键词羟基维生素液相串联质谱性能验证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维生素是一种对骨骼和非骨骼组织都有多效功能的类固醇激素在循环血液中维生素以多种形式存在其中羟基维生素是其储存形式含量最高占维生素总量的 C 而且半衰期最长性质非常稳定因此是衡量体内可利用维生素水平客观评价维生素营养状况的最佳指标近年来许多研究都发现机体维生素水平与肿瘤自身免疫性疾病心血管疾病代谢综合征等存在相关的风险因素 $# 因此维生素的检测在临床上得到大量的应用各种检测方法和商业化的试剂也应运而生但是各种免疫学方法由于受检测基金项目十二五国家科技支撑计划课题资助项目 ' $# 国家临床重点检验专科建设项目资助项目作者简介宋斌斌男 # 年生硕士主管技师主要从事临床免疫检验工作作者简介潘柏申联系电话!"" $#!

2 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & "# 抗体的交叉反应与维生素和维生素 $ 的识别结合率不一致的限制其检测的准确性问题一直受到争议而使用液相色谱串联质谱法 * 2 (1/0,-)0 /-.1+)-,,-. ()/0, )/ 能够有效的避免这些问题被国际公认为检测的金标准 $ 我们建立了一种能快速定量检测血清和 $ 的 76 6 方法并对其进行性能评价材料和方法一仪器和试剂 -) / 0 6 = 6 '7=< ; < 7 液质联用仪色谱柱为 1 +* &#, &,,E,, 美国 -) / 公司保持柱温 $ A 标准品为纯 " &!,0* 和 $ "&!",0* 购自美国 0/0 )0 % -/(1 71, (-* 公司内标品为 $ " &!",0* 美国 0( ( 公司和 $! "!&!#,0* 美国 0/0 )0 % -/(1 71, (-* 公司甲醇色谱纯德国 6 /(? 公司异丙醇色谱纯德国 6 /(? 公司甲酸色谱纯美国 %0 ( ) ( 公司乙酸铵色谱纯美国,-'* / (1 公司硫酸锌色谱纯沃凯公司 - 固相萃取 0*.1-3)/-() 0 柱美国 -) / 公司二方法 & 标准品制备分别将纯和 $ 标准品溶于, 甲醇溶液中得到浓度分别为和, 的母液再将母液用甲醇稀释成 &&& & && 和 &, 的一级标准品每管分装后 > A 保存备用每次实验将各浓度的一级标准品室温复溶后取加入 $ 含 "C 胎牛血清的磷酸盐缓冲液.10.1-) 2 / -* 充分混匀配制成二级标准品浓度分别为 && & && & 和 & " A 保存不能反复使用 & 内标品制备分别将纯 $ 和 $! 溶于, 甲醇溶液中得到浓度为和, 的母液再将母液用甲醇稀释成浓度均为, 的一级内标品每管分装后 > A 保存备用每次实验时将一级内标品室温复溶后取加入 $ 含 "C 胎牛血清的充分混匀配制成二级内标品浓度为 " A 保存不能反复使用 $& 流动相工作液制备流动相 ' 为 &## 乙酸铵甲酸和, 去离子水的混合溶液流动相 ' 为纯去离子水流动相为 &## 乙酸铵甲酸和, 纯甲醇的混合溶液流动相为纯甲醇 "& 样本抽提和萃取取血清样本 &,0* 硫酸锌内标品和纯甲醇溶液! 震荡器充分混匀后 $ E 离心, 取! 上清液进行流速,, 和洗脱流速 $,, 收集洗脱液待测标准品和内标品的处理方式与待测样本一致 & 76 6 取样品洗脱液进行检测质谱调谐参数设置毛细管电压为 $?9 锥孔电压为 $ 9 脱溶剂气温度为 $ A 脱溶剂气流量为! 1 反吹气流量为 1 质谱测量参数设置详见表物质表质谱测定参数设置母离子子离子, 4 锥孔电压?9 碰撞能量 9 "$&$ $ &$!& & $ "!&$ $ &$!& & $ "&$ &!& & $! "#&$ &!& & 三方法学评价参照美国食品和药品管理局 00 - /2 ', )/-) 0 ' 的生物分析方法验证导则标! 准对建立的 76 6 进行基本分析性能验证 & 线性评价将浓度为,0* 的标准品稀释为 # 个浓度 & &! & & &!&,0* 重复检测次取均值各浓度的检测偏倚 B C 且曲线的回归系数 ( & 可判断为呈线性 & 定量检出限系列稀释标准品每个浓度重复检测次将同时满足变异系数 / C 偏倚 B C 信噪比 -* 0 /-) 0 : 的最低浓度值定为定量检出限 $& 精密度评价使用高中低 $ 个浓度的混合血清作为待测样本分别同时检测次评价批内精密度将混合血清分装 > A 保存连续检测每天重复 $ 次评价批间精密度

3 " 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & "& 回收实验在份已知浓度的混合血清中同时加入不同浓度的和 $ 标准品作为待测样本每份样本重复检测 $ 次取均值并与理论值进行比较计算回收率回收率在 C 之间判断为可接受 & 准确度评价检测维生素国际室间质量评价计划 9 )-, 3) / -* =2-* )+ ', ) =' 份样本的总重复次取均值与回报结果的组均值做偏倚比较偏倚在 C 之间判断为可接收四统计学分析使用 6 (/0 0 ) ( 3( * $ 版计算均值 4 标准差 / 偏倚和回收率曲线回归系数采用 -/ 0 相关分析结果一标准曲线和线性评价 76 6 检测血清和 $ 的色谱图和定标曲线见图 &,0* 见表注分别为 $ 内标 $! 和内标 $ 的色谱图分别为和 $ 的标准曲线图 76 6 检测血清和 $ 的色谱图和标准曲线

4 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & " 二定量检出限 76 6 定量检测血清和 $ 的检出限分别为 & 和 &,0* 见表 $ 三精密度评价采用 76 6 分别检测和 $ 并将两者结果相加得总结果总的批内批间 / 分别 B"C 和 B!C 见表 " 四准确度评价回收实验的回收率结果最低为 $&!C 最高为 &!C 准确度符合要求见表 =' 检测结果的偏倚为 >& &$C 符合准确度评价标准见表! 表 76 6 检测血清 $ 的线性评价,0* 分析物水平理论值测定值测定值 4 /C 偏倚 C & " "& & & & "&" & & "#& "&# " &!$ & &! >&! $ & & "&!&# $& $& &" "! &!&#! &!"& "&"!& $& & & &# & & & > &! & &# $& &$ & #& >& #!&!& #&!&# &$ & & $ & "& & &$ #& &$ & & "& "$& " &$ & " & >$& $ &!& & "& & $ &$ >& "! &!&! &#!&$ &" $& >& &!& & &# &$ &" $&! & &# $&# &# &" & & #!&!& & #&$ & " #&" "& 表 76 6 的定量检出限评估结果,0* 项目期望值实测值实测值实测值 $ 实测值 " 实测值 4 /C 偏倚 C : & & &# & & &# &" &$$ $&$ > & #"$ & & & & & &# & & "& & "" &!$ & & & &# & &# & $$&$$ & $ $ & &# &# $& $& & & &$" & #!& " & &# & & & & &$ &!&! & # &!$ & & & & & & & &!! & "# 表 76 6 的精密度评估结果总样本批内 4,0*,0* /C 批间 4,0*,0* /C 样本 $& & $& " &# &!# & 样本 & $&# $& &$!& & 样本 $ $$"&" #&#" &$ $$& & $&$"

5 " 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & 表回收实验 $,0* 加入量样本浓度 $ 理论浓度实测值实测值实测值 $ 实测 4 回收率 C $& & " & " &"" "& $#& "& $& $&! & & " " &"" ""&# ""& "$& "$& $&" &! #&" $& "& & $& & &$! #&" &! $&!& & & "&!# &!!$&$ $&$ "&!& # & & & & $&# "& $&$!& #!&# $& $&!&# &"!&# &$! #&""!& #$&!& #$&!# & &$!!&# #&"" #& $&# & &# &! 表 76 6 检测 =' 样本总的结果样本编号测定值,0* 测定值,0* 4,0* 同方法组 4,0* 偏倚 C "$! #$&# # & #!&$ & > & "$# $"& & $& $ & >& "$!&! &!& &" &$ "$ ""& "$&! "$& "$& &# "" "#&" &! "& &! >$& 讨论准确检测一直是临床实验室面临的挑战 # 学者们均希望能够找到一种快速灵敏特异且重复性好的高通量方法自 " 年第次报道使用 76 6 检测以来质谱技术有了飞速的发展并且使用这种方法建立了检测的参考测量程序 " 质谱法有许多优点如灵敏度高准确性好可以通过变换不同的流动相和内标物质同时检测多种维生素代谢物质本研究建立的 76 6 方法能够独立的同时检测出血清和 $ 浓度 76 6 检测的过程中涉及两个关键的步骤样本前处理和质谱分析本研究使用 -) / - + /0.1 * (.0.1 * ( -*- ( 小柱对血清样本中的进行这种小柱具有亲水亲脂的特性. 值适用范围广. 使用非常方便且使用! 孔微孔板可以批量处理每批次可以同时处理! 个标本总共耗时 $ 1 其中试剂平衡 1 平均每个样本的检测时间是 "&!, 可以满足高通量的检测要求在质谱分析方面本研究使用的是 6 检测器多反应监测法,2*) / -() 0,0 )0/ 6%6 将待测物质先离子化电喷雾电离 * ()/0./ ) 0 之后进入三重四级杆离子进入第一道四级杆时检测到母离子的质荷比接着母离子进入第二道四级杆即碰撞池可以施加电压将母离子撞碎形成许多具有不同质荷比的子离子母离子碎片子离子进入第三道四级杆选择性地检测所需要的子离子一般选用和待测物质的内标物质质荷比相近的子离子作为待测物此方法通过同时检测母离子和子离子保证了及内标物质检测的特异性参照美国 ' 的生物分析方法验证导则标准对建立的 76 6 进行基本性能验证 &,0* 和 $ 的定量检出限分别为 & 和 &,0* 此灵敏度和线性检测范围足够满足日常临床评估个体维生素状态的需要与其它文献报道的线性性能类似精密度评价结果显示本方法的批间精密度为 B!C 批内精密度 B"C 优于一些免疫学检测方法与 %%6':: 等的研究结果基本一致回收率为 &!C 符合准确度的性能验证要求 ' 等报道 7$., / 会影响质谱法的检测结果但此类维生素的代谢产物只存在于儿童体内不会对成人样本造成影响因此本研究未对其进行验证 =' 是目前全球最具影响力的维生素检测的实验室室间质量评价计划参加的实验室数已经超过家通过

6 检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & " 检测该组织发放的血清样本并与同方法组结果进行比较能够很好的反映检测方法的准确性本研究结果也证实了所建方法的准确性总之本研究建立的 76 6 可以准确精密地检测实现实验室大通量样本检测并且能同时检测和 $ 通过性能验证表明所建方法性能优异适合临床应用参考文献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收稿日期 ""$ 本文编辑龚晓霖

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据

检验医学 年 月第 $ 卷第 期 - 0/-)0/+6 ( *$&:0 & "# 抗体的交叉反应 与维生素 和维生素 $ 的识别结合率不一致的限制 其检测的准确性问题一直受到争议 而使用液相色谱 串联质谱法 * 2 (1/0,-)0 /-.1+)-,,-. ()/0, )/

检验医学年月第 $ 卷第期 - 0/-)0/+6 ( $&:0 & "# 抗体的交叉反应与维生素和维生素 $ 的识别结合率不一致的限制其检测的准确性问题一直受到争议而使用液相色谱串联质谱法 2 (1/0,-)0 /-.1+)-,,-. ()/0, )/