[ 应用纪要 ] 实验 UPLC 条件 UPLC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class ( 配备 PC 试剂盒 ) 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C mm x 2.1 mm, 1.7 m 柱温 : 50 C 流速 : 0.3 ml/min 流动相 : 70

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1 [ 应用纪要 ] 使用 UPLC/ 带有离子淌度的质谱检测和鉴定环境样品中的全氟烷基和全氟烷基化合物 (PAS) 1 Michael McCullagh, 1 Mike Hodgkinson, 1 Leonard Dillon, 2 Bert van Bavel, 3 Jennifer A. Burgess, 和 2 Ingrid Ericson Jogsten 1 沃特世公司 ( 英国威姆斯洛 ) 2 MTM Research Centre, Örebro University, Örebro, Sweden 3 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 离子淌度功能, 可以将各种 POS 同分异构体与同分子量色谱共流生物基质干扰物分离出来 通过淌度, 净化谱图, 提高结构解析的效率 离子淌度漂移时间可用作鉴别 POS 异构体的常规筛选工作流程的鉴定信息 仅通过一次分析, 就能完成基于保留时间 母离子精确质量数 具有精确质量数的碎片信息以及离子淌度漂移时间的鉴定 沃特世解决方案 Oasis WAX 固相萃取小柱 ACQUITY UPLC I-Class 系统 ACQUITY UPLC BEH C 18 色谱柱 SYNAPT G2-S High Definition Mass Spectrometry (HDMS ) MassLynx 软件, 配备 UNII 科学数据管理系统 简介全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 是一类人工合成的化合物, 常在生物和环境样品中被检测到 PAS 在各种商业 工业工艺和产品中被广泛应用, 从灭火泡沫 杀虫剂制剂 防水涂层和地板蜡到食品接触类纸类产品的抗油涂层 类似许多人工合成的化合物, 与该化合物接触可导致癌症, 这已引发了人们的关注 全氟辛烷磺酸盐 (POS) 可通过生物或非生物的环境过程产生, 常在生物和环境样品中被检测到 基于 MRM 选择离子检测模式的 LC-MS/MS 分析技术已被用于海洋动物和人类血清中 POS 的研究 据 Benskin 等报道, 常见的基质干扰物 [ 牛磺去氧胆酸盐 (TDCA) 会使 POS 的定量分析变得更为复杂, 因为二者会有相同的 MRM( 离子对 )(m/z 499 m/z 80), 且干扰物质往往会与 POS 共洗脱, 因而导致正偏差 1,2 在该应用纪要中, 我们将采用离子淌度技术的 Waters ACQUITY UPLC I-Class 液质系统作为重要工具, 探索如何利用它们对环境样品中的 POS 异构体进行明确鉴定 3,4,5 该技术已被用于分析一系列的环境提取物 ( 包括水貂和鱼类肌肉 ) 中是否含有 POS 该技术结合了高分辨率质谱和离子淌度的高效检测和分离, 在解析复杂基质时, 具有许多独特的优势 离子淌度光谱法 (IMS) 是一种快速的正交气相分离技术, 能在 LC 分离的同时, 获得另一个维度的分离 它是根据化合物的大小 形状和电荷, 对化合物进行分离 此外, 仅通过一次进样, 就能同时获取所有待分析化合物的母离子和其子离子信息 关键词 POS 异构体, 漂移时间, 离子淌度, 谱图净化,PAS,POS, 碰撞截面, CCS 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 1 [ 7 ]

2 [ 应用纪要 ] 实验 UPLC 条件 UPLC 系统 : ACQUITY UPLC I-Class ( 配备 PC 试剂盒 ) 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C mm x 2.1 mm, 1.7 m 柱温 : 50 C 流速 : 0.3 ml/min 流动相 : 70% 2 mm NH 4 Ac 的水溶液 / 30% 2 mm NH 4 Ac 的甲醇溶液 /ACN 80/20 (A) mm NH 4 Ac 的 甲醇溶液 /ACN 80/20 (B) 梯度 : 时间 (min) %A %B Initial MS 条件 MS 系统 : SYNAPT G2-S 电离模式 : ES 脱溶剂气温度 : 550 C 采集模式 : 离子淌度 质量数范围 : 50 至 600 Da 采集速率 : 10 光谱 / 秒 毛细管电压 : 2.3 kv 锥孔电压 : 15V 离子淌度气体 : CO 2 和 N 2 碰撞能量范围 : 35 至 75 ev IMS 波 流速范围 : 400 m/s 和 550 m/s IMS 波高 : 40 V IMS 工作周期 : 10.8 ms 样品制备所有的水貂尸体 ( 未成熟和成熟的雄性 ) 均由持有执照的猎人提供, 在瑞典农业科学大学对其进行尸体剖检前, 冷冻保存 (-20 C) 操作流程与 Kärrman 等报道的方法 7 一致, 仅略作调整 肝脏样品通过 Ultra-Turrax(IKA) 磨成匀浆 取肝脏的子样本 (1 g), 加入 10 ml 乙腈 将混合物反复进行涡旋混合后, 超声处理 30 min 离心后(10,000 x g, 30 min), 取上清液, 对剩下的颗粒, 重复提取流程 将乙腈馏分, 合并后, 浓缩至 10 ml 然后加入 25 ml 水, 混合并离心后, 取上清液 用 4mL 甲醇及 4 ml 水预平衡 Oasis WAX 固相萃取 (SPE) 小柱, 然后, 加载样品上清液 用 4 ml 25 mm 的乙酸钠 (ph 4) 和 4 ml 40% 的甲醇水溶液, 分别清洗 Oasis SPE 小柱, 然后在真空条件下进行干燥 用 8 ml 甲醇对小柱进行最终清洗 最后, 使用 2 ml 2% 的氢氧化铵甲醇溶液, 将全氟化合物提取到装有 50 mg ENVI-Carbith(Supelclean, 120/400 mesh) 和 100 L 乙酸的试管中 将该含碳溶液涡旋混合 30 s, 然后通过 0.2 m 的 GHP 膜过滤, 接着用 N 2 吹 浓缩至 200 L, 再加入 300 L 2 mm 的乙酸铵水溶液和标准品 7HPHpA PAS 2 [ 8 ] 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定

3 当前的研究探讨了使用 Waters SYNAPT G2-S 平台是否能够通过结合 UPLC 与离子淌度的液质技术, 为特定的明确鉴别提供一条途径, 从而实现 POS 异构体的明确鉴别 图 1. 是带有离子淌度质谱的原理示意图 仅为了进一步的研究, 将作为淌度缓冲气的 N 2 替换为 CO 2, 以此提高离子淌度的分离能力 6 使用 CO 2 能够为待分析的 POS 异构体分离提供特征漂移时间 由于 POS 异构体的物理 化学和生物性质会受到全氟甲基支链的影响, 对其进行正确的鉴定就显得尤为重要 因此, 全氟甲基支链形式化合物相关的毒性 环境运输 降解和生物富集已经引发了科学界越来越浓厚的兴趣 1. 灵敏度提高 2. 离子淌度 3. 精确质量数测量 Size Shape Charge 图 1. SYNAPT G2-S 质谱仪的示意图和离子淌度原理示意图 结果与讨论 UNII 科学数据管理系统使得离子淌度分离成为筛查检测的日常使用工具 使用 MassLynx 软件采集数据, 通过 UNII 进行数据处理 采集 POS 异构体混合标准品生成的质谱信息, 可在 UNII 中, 与 POS 异构体的预期保留时间和漂移时间结合, 创建一个科学数据库 这样, 便可通过结合正交离子淌度分离和 UPLC 色谱分离技术, 对环境提取物进行半目标化合物和目标化合物筛查 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 [ 9 ]

4 [ 应用纪要 ] 水貂中 POS 的检测结果很明显地展示出了使用离子淌度的优势 使用该方法能够将 POS 异构体中与同分子量共流干扰物分离开来 精确质量数提取离子色谱图如图 2 所示 干扰物 ( 峰 A 和 B) 与不同的主要 POS 异构体 ( 峰 C-) 重叠 由于 TCDCA( 牛磺鹅去氧胆酸盐 )/TDCA 干扰物和 POS 异构体也会产生同分子量碎片, 使用传统的 MS 技术对这些化合物进行表征和精确定量很困难 POS TDCA 以及其它胆酸具有相似的同分异构特性 保留时间和跃迁 (m/z 499 m/z 80) 将 POS 定为目标, 利用四极杆质谱技术的选择性, 进行 MS/MS 分析时, 其质量数分辨率仅为 1 Da 因此, 我们就很容易理解干扰物如何被误认为 POS 了 POS 异构体 D G C E 同分离量干扰物 A B 图 2. 同分子量生物基质干扰物 ( 峰 A 和 B) 和 POS 异构体 ( 峰 C-G) 的精确质量数提取色谱图 [ 10 ] 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定

5 这里使用的方法避免了使用复杂色谱 样品净化和高度特异性的 MS 实验设计 使用离子淌度能够收集样品的淌度分离质谱信息, 其中包括母离子和碎片离子信息以及漂移时间, 有助于进行更深入的特征分析 如图 3 的组分漂移图所示, 由于 POS 异构体的漂移时间与其它物质差异极大, 因此它们能够从干扰组分中分离出来 正交分离的 TDCA 和 TCDCA 与 POS 异构体产生了 2 ms 的漂移时间差异 POS 异构体的漂移时间为它们的鉴定提供了更具决定性的信息 一般来说, 我们通过保留时间和所观察到的子离子间的细微差异, 以及它们的强度对单个异构体进行表征 但在样品浓度较低时, 这种方法很难实现 通过与碰撞截面 (CCS) 直接相关的漂移时间可提供与分子物理性质相关的额外鉴定信息 ( 除了 m/z 和色谱保留时间 ) TDCA/TCDCA 干扰物 A δ= 2ms 离子淌度分离 POS 异构体 B 图 3. 标称的同量干扰物 (A) 与 POS 异构体 (B) 的漂移时间与保留时间的组分漂移图 通过结合正交离子淌度分离与 UPLC 色谱分离, 提高了峰容量, 因此, 可获得单个组分的精确质量数 使用漂移时间 保留时间和精确质量数 ( 表 1) 能够建立 POS 异构体的特征匹配分析 利用母离子和子离子的高度特异性淌度信息, 可将其与复杂基质干扰物分离, 还可用于推断元素组成以及推测碎裂途径 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 [ 11 ]

6 [ 应用纪要 ] 表 1. 主要 POS 异构体和共洗脱生物基质干扰物的漂移时间 保留时间和异构体匹配汇总 POS 异构体 漂移时间 (ms) 质量数测量误差 J 3mPOS ppm C 5mPOS ppm D IsoPOS ppm POS 异构体鉴 E 2,2 全氟甲基 POS ( 初步 ) ppm 1mPOS ppm G npos (2.68 ppm HE) 保留时间 (min) TDCA 干扰物 漂移时间 (ms) 质量数测量误差 A TDCA ppm B TCDCA ppm 保留时间 (min) 图 4. 保留时间在 分钟时, 通过离子淌度从共洗脱的 POS 异构体 C 中得到的较小的 POS(J)(3mPOS) 异构体碎片谱图 [ 12 ] 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定

7 图 5. 结合正交离子淌度分离和 UPLC 色谱分离生成的同量干扰物 TDCA (A) 在保留时间 分钟时的离子淌度分离特征碎片谱图 POS 的异构体和同分子量生物基质共流干扰物各自的离子淌度分离, 子离子谱图示例如图 和 7 所示 图 4 展示了 3mPOS 的子谱图和淌度迹线, 它与 5mPOS(C) 和 TDCA(A) 成功分离, 而这三者是色谱共流物质 离子淌度提高了峰容量, 让我们能够比较不同 POS 异构体的碎片离子谱图而不受共流物 TDCA 和 TCDCA 的干扰 TDCA 在保留时间为 分钟和 分钟时, 与 POS 异构体 C D 共流出 ( 见图 2) 同分子量干扰物 TDCA 的特征碎片谱图如图 5 所示 它们与 POS 异构体碎片的相同之处见图 6 和图 7 在进行靶向筛查时, 生成了九种 POS 异构体的保留时间 漂移时间及母离子 / 碎片谱图 同时也生成了相关基质干扰物的谱图 由此可以看出,POS 异构体 C 和 D 有着不同的碎片特征和漂移时间, 分别为 4.59 和 4.68 ms( 图 6 和图 7) 这些数据说明, 漂移时间信息可以用作 POS 异构体特有的鉴定标准, 并且能够极大地提高异构体鉴定的可靠性 使用漂移时间信息显著降低了进行准确的异构体鉴定时对色谱保留时间的依赖性 经证实, 在研究环境样品中的 POS 时, 复杂基质会导致其保留时间的改变 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 [ 13 ]

8 [ 14 ] [ 应用纪要 ] 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 S OH O O 图 6. POS(C)(5mPOS) 异构体的离子淌度母离子和特征碎片谱图, 通过离子淌度在保留时间为 分钟时分离同量干扰物 TDCA(A) 图 7. POS(D)(isoPOS) 异构体的母离子和特征碎片离子淌度谱图, 通过离子淌度可将在保留时间为 分钟时的同分子量干扰物 TDCA(A) 分离开 S OH O O

9 Beskin 等此前曾报道过 POS 异构体的洗脱顺序 1 本研究应用了该信息,POS 异构体的分配如表 2 所示 结构解析按照 Langlois 和 Oehme 介绍的方法进行 8 已知在反相条件下, 无支链的 npos 在 分钟时会表现出极强的保留特性 本文提供的数据确证了以上结论, 在所生成的碎片离子的数据中, O 系列和 9 系列的离子发生了结合 从碎片解析的结果可得出结论, 异构体的碎片中没有支链结构 以子离子的构成为基础进行的解析, 实际上是极具挑战性的任务, 因为这意味着必需依赖低强度的离子 同时还需要最佳的灵敏度和碰撞能量 此外, 还必需克服链长增加而导致产物离子强度降低所带来的挑战 目前已生成了九种 POS 异构体的漂移时间信息, 为进行更深入的研究提供了根据, 可扩展离子淌度在特定 POS 异构体鉴定方面的应用 我们的初始研究表明, 与那些在离 POS 端基较远处具有支链的异构体相比, 更具线性结构的 POS 异构体的漂移时间更长 结论 通过离子淌度, 以 N 2 和 CO 2 为淌度缓冲气体, 可以将共洗脱同量生物干扰物 TDCA 和 TCDCA 从 POS 异构体中分离出来 POS 异构体不同的漂移时间提高了检测的可信度, 它们还可作为一个额外的鉴定点使用, 降低检测对色谱保留时间依赖性 通过使用 UPLC IMS-MS, 能够为为 POS 异构体和 TDCA/ TCDCA 异构体生成单组分母离子和碎片谱图 通过实现特定异构体的分析,UPLC IMS-MS 为检测和鉴定环境中的 POS 提供了一种无可比拟的独特方法 UPLC IMS-MS 与靶向筛选相结合, 为 POS 特定异构体的鉴定提供了一条高效的途径 总共检测了九种 POS 异构体的漂移时间, 并且都获得了足够的响应, 此外, 它们的鉴定结果都通过检测其碎片谱图得到了确证 POS 异构体的漂移时间被证明 : 随着线性链长增加而增加, 这一变化趋势可用于未来研究中的结构解析应用 本文提供的数据表明, 离子淌度在分析环境样品中的 POS 特定异构体方面具有适用性, 可实施该应用在这一领域的深入研究 软件增强功能将实现更深入的研究, 让该方法能够直接检测 POS 异构体的碰撞截面 参考文献 1. Benskin et al., Anal. Chem. (2007), 79, The ESA Journal (2008) 653, K Giles, JL Wildgoose, DJ Langridge, I Campuzano. Int Journal of Mass Spectrometry. 298, 1 3:10 16, 1 December K Giles, JP Williams, and I Campuzano. Commun. Mass Spectrom. (2011) 25: TW Knapman, JT Berryman, I Campuzano, SA Harris, AE Ashcroft. Int Journal of Mass Spectrometry. 298, 1 3: 17 23, 1 December MN Eberlin, et al., SYNAPT HDMS: Improving Ion Mobility Separation by Increasing Drift-Gas Polarizability. Waters Technical Note No EN, A Kärrman, JL Domingo, M Nadal, B van Bavel, G Lindström, G. Environ Poll Res. (2009);doi: /s I Langlois, M Oehme., M. Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006)20: , 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, Oasis, ACQUITY UPLC, SYNAPT, High Definition Mass Spectrometry, HDMS, UNII, Triwave, UPLC 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 StepWave, QuanTof 和 T-Wave 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 2014 沃特世公司中国印刷 2014 年 6 月 ZH AG-PD 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400) 环境样品中全氟烷基和多氟烷基化合物 (PAS) 的检测和鉴定 [ 15 ]

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