[ 应用纪要 ] [ 应用纪要 ] 人血浆中缓激肽的 SPE LC-MS/MS 定量检测方法开发 Mary E. Lame Erin E. Chambers 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势使用 CORTECS UPLC 色谱柱有利于

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告彬元
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pg/ml 选择性高的快速 SPE 提取 (<30 分钟 ) 省去了耗时的免疫亲和纯化步骤 Xevo TQ-S MS 可实现与免疫检测方法相匹配的高灵敏度, 但与后者相比更加省时省力与传统 LBA 方法相比更为准确精密分析速度快, 只需 3.

1 Mary E. Lame Erin E. Chambers 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势使用 CORTECS UPLC 色谱柱有利于获得较窄的峰宽改善灵敏度和分离度, 并消除基质干扰采用 Oasis WCX( 一种混合型吸附剂 ) 的 SPE 方法降低了基质干扰并提高了血浆中缓激肽提取的选择性 Oasis μelution96 孔板可浓缩样品, 并在最大程度上减少肽损失, 使血浆中缓激肽的检测限达到 5 pg/ml 选择性高的快速 SPE 提取 (<30 分钟 ) 省去了耗时的免疫亲和纯化步骤 Xevo TQ-S MS 可实现与免疫检测方法相匹配的高灵敏度, 但与后者相比更加省时省力与传统 LBA 方法相比更为准确精密分析速度快, 只需 3.5 分钟, 大大提高了工作效率沃特世解决方案简介缓激肽是一种含有 9 种氨基酸的生理和药理活性肽, 由蛋白质的激肽基团衍生而来 ( 图 1) 激肽是可以促使血管舒张血管通透性增强一氧化氮释放和花生四烯酸流动的效应因子它是血压肾功能和心脏功能的重要调节因子, 还参与炎症反应 1 缓激肽可引起血管扩张, 从而导致血压降低因此, 对这种激素肽的变化进行高灵敏度高选择性和高准确度地定量, 并将其作为疾病进展或药物治疗的评估指标, 将会极为有利尽管以往都是通过配体结合试验 (LBAs) 对生物制剂进行定量分析, 但在过去几年中利用 LC-MS/MS 分析大分子已成为一种趋势这在某种程度上是因为 LBAs 产生显著的交叉反应问题并且缺乏标准化 LC-MS/MS 具有多种优势, 例如开发时间更短准确度和精度更高可重复进样, 并且容易区分相似度很高的类似物代谢物或内源性干扰物常见的肽通常难以通过 LC-MS/MS 进行分析, 这是因为其不易离子化以及不易产生理想的碎片离子而导致 MS 灵敏度较低, 从而使得 LC 和样品制备方法开发非常困难由于缓激肽在血浆中的浓度低至 pg/ ml 水平且代谢速度快, 在采血和样品制备过程中还可通过蛋白水解人为生成, 因此对其进行准确定量相当困难本研究采用了专门设计的血液收集技术以防止体外缓激肽的形成, 并且利用混合型固相萃取 (SPE) 和高效实心核颗粒色谱柱, 最大限度降低并消除基质干扰的同时提高定量分析的灵敏度 ACQUITY UPLC 系统 Xevo TQ-S 质谱仪 CORTECS UPLC C 18 色谱柱 Oasis WCX 96 孔 µelution 提取板 ACQUITY 96 孔收集板 Bradykinin 缓激肽的氨基酸序列 Amino Acid Sequence: :RPPGFSPFR RPPGFSPFR 图 1. 缓激肽的典型结构和氨基酸序列关键词生物分析,Oasis, 样品制备, 肽定量, 缓激肽,UPLC,CORTECS, 血浆

2 实验方法条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : CORTECS UPLC C µm,2.1 50mm 流动相 A: 0.1% 甲酸水溶液流动相 B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度 : 见表 1 柱温 : 35 样品温度 : 15 进样体积 : 10 µl 总运行时间 : 3.5 min 收集板 : Waters 1 ml ACQUITY 收集板 MS 条件 MS 系统 : Xevo TQ-S 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 3.0 kv 脱溶剂气温度 : 500 锥孔气流速 : 150 L/h 脱溶剂气流速 : 1000 L/h 碰撞室压力 : (-3)mbar 碰撞能量 : 按组分优化, 见表 2 锥孔电压 : 按组分优化, 见表 2 数据管理色谱软件 : UNIFI 1.6 定量软件 : UNIFI 1.6 样品制备样品预处理将 10 μl 内标 (IS) 赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽 (10 ng/ml) 加入 200 μl 人血浆中并混合然后使用 5% NH 4 OH 水溶液对样品进行 1:1 稀释并混合使用 Oasis WCX 提取样品根据图 2 所示方案提取预处理的血浆样品所有溶液按体积计对 μelution 板上放置样品的孔实施全部提取步骤 Oasis WCX µelution µl MeOH 200 µl 5% NH 4 OH 400 µl µl 5% NH 4 OH µl 10% ACN 2 x 25 µl of 1% TFA 75:25 ACN:H2O 50 µl 图 2. Oasis μelution WCX 提取方案时间流速 (min) (ml/min) A(%) B(%) 曲线初始表 1. UPLC 梯度条件 2

3 结果与讨论质谱分析在 m/z 531 和 m/z 354 观察到缓激肽的 2+ 和 3+ 母离子缓激肽 ( 图 A) 和 IS( 图 B) 的 3+ 母离子的典型 MS/MS 谱图如图 3 所示在方法开发过程中, 记录了一些不同的多电荷母离子和碎片离子最终使用了缓激肽和 IS 的 3+ 母离子, 因为它们在基质中强度最高且选择性最佳选择 m/z y31+ 的碎片离子作为缓激肽定量分析的主要碎片离子选取 3+ 母离子和 m/z b41+ 碎片离子用于确证对于 IS, 选择了 m/z 的 3+ 母离子和 m/z b72+ 碎片离子最佳 MS 条件如图 2 所示尽管许多肽可以生成小于 m/z 200 的较强碎片离子, 但在提取样品中这些离子 ( 通常为亚胺离子 ) 由于缺乏特异性, 会导致高背景噪音在此检测中, 采用 m/z 值大于其母离子的高特异性 b 或 y 碎片离子显著提高了特异性, 便于使用更为简单的 LC 和 SPE 方法化合物母离子 MRM 通道锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 产物离子类型缓激肽赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 舒爱激肽 (IS) [M+3H] > [1H+] 1/y3 [M+3H] > [1H+] 1/b4 [M+3H] > [2H+] 1/b7 表 2. 缓激肽和内标 (IS) 赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽的 MRM 通道碰撞能量和锥孔电压 A [M+3H] * 缓激肽 Bradykinin B * [M+3H] 赖氨酸 [Lys-des-Arg9]-Bradykinin -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽 (IS) (IS) 图 3. 缓激肽 (A) 和赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽 (B) 的 3+ 母离子的 MS/MS 谱图选择用于定量的 MRM 通道以星号 (*) 示出 3

4 UPLC 分离与小分子不同, 肽在全多孔颗粒中的传质性能较差因此, 在生物分析研究常用的较高流速 2,3 下, 使用实心核颗粒填充的色谱柱可获得更清晰的峰形与全多孔颗粒色谱柱相比, 在使用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱时, 缓激肽所得到的峰宽更窄拖尾现象减少峰高和峰面积更大利用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱得到的缓激肽和 IS 的峰宽为秒, 而在全多孔色谱柱中峰宽为 4 秒使用 CORTECS UPLC C 18 色谱柱得到的缓激肽和 IS 的典型色谱图如图 4 所示 Bradykinin 缓激肽 [Lys-des-Arg9]-Bradykinin 赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽 (IS) (IS) 保留时间 [min] 图 4. 使用 mm CORTECS UPLC C 18 色谱柱时空白提取血浆中缓激肽和内标的 UPLC 分离 4

5 样品制备将人血浆收集到含有 EDTA 和蛋白酶抑制剂的试管中, 以防止体外形成缓激肽使用 Oasis WCX ( 一种混合型吸附剂 ) 进行 SPE 提取, 提高提取的选择性此吸附剂依靠反相和离子交换保留机制将复杂血浆样品中的缓激肽与其它高丰度多肽选择性地分离开来 Oasis μelution96 孔提取板可在无需蒸发和复溶的条件下富集样品这不仅节省了时间, 还减少了由于蒸发过程中收集板壁的吸附而导致的肽损失预处理和清洗步骤的优化对于在样品预处理和 SPE 提取中完全回收缓激肽至关重要使用酸或碱对样品进行预处理可降低粘度并增加与吸附剂的接触时间, 有利于抑制蛋白质结合, 还可以通过离子交换功能使肽在 SPE 设备中得到更好的保留在最初的方法开发中, 通过用酸预处理血浆获得了约 80% 的回收率由于缓激肽是一种碱性的极性肽, 其 PI 值为 12.0,HPLC 指数为 47.8, 因此怀疑它在最初的上样步骤中发生了部分洗脱当使用碱进行预处理时, 回收率增加至约 90%, 这有利于在上样步骤中通过离子交换改善缓激肽的初始保留性能将清洗步骤 2 中的乙腈溶液由 20% 变为 10%, 消除了清洗过程中缓激肽的穿透现象, 并使回收率提升至 100% 在上样前对血浆进行碱预处理的优化 SPE 方案与采用 10% 乙腈溶液的优化清洗步骤相结合, 实现了缓激肽的完全回收, 且基质效应小于 10% 此外, 由于 UPLC 分离在反相色谱进行, 因此利用离子交换实现的肽分离为整个方法赋予了正交性线性准确度和精度为了生成标准曲线, 用以下最终浓度的缓激肽对人血浆进行强化 : 和 pg/ml 在人血浆中制备以下浓度的质量控制(QC) 样品 : 和 5000 pg/ml 使用赖氨酸 -( 脱 - 精氨酸 9)- 缓激肽 ( 最终浓度为 0.5 ng/ml) 作为缓激肽的内标 (IS) 计算分析物峰面积与 IS 峰之间的峰面积比 (PAR) 使用校准样品的 PAR 并应用单一浓度 (1/x) 加权线性回归模型构建人血浆样品的校准曲线然后根据校准曲线, 通过 PAR 值计算出所有 QC 样品的浓度由于存在内源性缓激肽, 因此采用标准品加入法通过计算 x 轴截距确定对照血浆样品中缓激肽的平均基底浓度然后, 将缓激肽的基底浓度加入到所有标曲浓度和 QC 浓度, 以实现准确定量使用 1/x 回归, 缓激肽所得曲线呈线性,R 2 值 >0.99 表 3 所示为标准曲线性能汇总 QC 分析结果示于表 4 中, 内源性缓激肽和 QC 的典型色谱图如图 5 所示所有浓度的 QC 样品都表现出极好的准确度和精密度, 满足了有关 LC-MS/MS 检测的生物分析方法验 4,5 证最佳实践白皮书中建议的 FDA 可接受标准人血浆中缓激肽的平均内源性基底浓度测得为 79 pg/ml,sd 和 CV% 分别为 4.4 和 5.5 以上数据证实了这是一种稳定且可重现的方法 5

6 缓激肽加标浓度缓激肽浓度峰面积 IS 峰面积响应计算所得的缓激肽浓度平均准确度表 3. 从人血浆中提取的缓激肽在 pg/ml 范围内的标准曲线汇总和统计峰面积 Area Blank/Basal 空白 / 基底浓度 Level 79 pg/ml QC 25 pg/ml 104 pg/ml QC 80 pg/ml 159 pg/ml QC 250 pg/ml 329 pg/ml QC 800 pg/ml 879pg/mL 保留时间 [min] 图 5. 与提取的空白血浆相比, 人血浆中 QC 浓度为和 800 pg/ml 的缓激肽的典型色谱图 6

7 缓激肽加标浓度缓激肽 QC 浓度平均 (N=4) 计算浓度 SD CV% 平均准确度表 4. 从人血浆中提取的缓激肽的 QC 统计预分析收集和处理的重要性对血浆中的缓激肽进行准确定量十分困难, 因为缓激肽可以在采血和样品制备中经蛋白水解 1,6,7 过程而生成本研究特别注重血液收集方案, 通过添加蛋白酶抑制剂以防止体外缓激肽的形成在图 6 中,A 图和 B 图显示出, 如果采用同一供体和相同的收集方案, 将血液收集到分别添加和未添加蛋白酶抑制剂的 EDTA 试管中, 缓激肽的浓度从 90 pg/ml 升至 250 pg/ml 通过使用来自供应商的另外两个供体的未指定样品收集方案, 缓激肽的人为形成得到进一步证实, 如图 6 ( 图 C 和图 D) 所示在上述情况下, 将血液样品收集到不含蛋白酶抑制剂的 EDTA 试管中, 浓度达到了较高的 ng/ml 水平这些结果进一步证明了合适的样品收集方式对于准确定量内源性缓激肽血浆浓度的必要性 A 峰面积 Area 血浆供体 Plasma Donor 1 EDTA 含蛋白酶 #1 EDTA 抑制剂 With Protease 90 pg/ml Inhibitor 90 pg/ml B Plasma Donor #1 EDTA 血浆供体 No Protease 1 EDTA 不含蛋白 Inhibitor 250 酶抑制剂 pg/ml 250 pg/ml C Plasma Donor #2 EDTA No 血浆供体 Protease 2 EDTA Inhibitor 不含蛋白酶抑制剂 Unknown 未指定样品收集方案的样品 Sample Collection 4,300 and pg/ml Protocol 4,300 pg/ml D Plasma Donor #3 EDTA No 血浆供体 Protease 3 EDTA Inhibitor 不含蛋白酶抑制剂 Unknown 未指定样品收集方案的样品 Sample Collection 3,100 and pg/ml Protocol 3,100 pg/ml 保留时间 [min] 图 6. 在添加和不添加蛋白酶抑制剂的情况下, 来自多个供体的不同内源性浓度人血浆提取缓激肽的典型色谱图 7

8 结论本研究开发了一种用于提取人血浆中缓激肽的混合模式 SPE 提取方法 μelution SPE 提取板消除了蒸发操作需求, 并且利用非特异性结合和样品浓缩而大大降低了损失的可能性通过一种快速简单分析级的 LC 方法将缓激肽与相似度很高的内源性干扰物分离开来,LC 总运行时间仅为 3.5 分钟与传统的 C 18 全多孔色谱柱相比,CORTECS UPLC C 18 实心核颗粒色谱柱改善了峰形, 提高了缓激肽检测的灵敏度 CORTECS UPLC C 18 色谱柱混合型弱阳离子交换 SPE 以及 m/z 较高的 b 或 y MS 碎片离子的联合使用提供了理想的选择性和灵敏度水平, 从而实现了准确定量并从 200 μl 血浆中区分缓激肽浓度细微差异标准曲线在 pg/ml 的范围内准确精密在高于基底浓度的情况下可精确定量的缓激肽最低浓度为 5 pg/ml 所有浓度的 QC 样品均符合 FDA 法 4,5 规标准, 平均准确度范围为 , 平均 CV% 为以上数据证实了这是一种准确且可重现的方法本研究还证实了采用合适的蛋白酶抑制剂样品收集方式对于准确测定缓激肽内源性浓度的重要性此外, 如果需要执行进一步验证, 本方法在通过 LC-MS/MS 对 PK 和临床研究的患者样品进行高灵敏度的缓激肽定量方面也表现出巨大的潜力参考文献 1. Murphey LJ, Hachey DL, JA. Oates JA, Morrow JD, and Brown NJ. Metabolism of Bradykinin In Vivo in Humans: Identification of BK1-5 as a Stable Plasma Peptide Metabolite J Pharmacol Exp Ther July 1, : Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, Kirkland JJ. Superficially porous silica particles with wide pores for biomacromolecular separations. Journal of Chromatography A. 2012; 1264(0): Kirkland JJ, Schuster SA, Johnson WL, boyes BE. Fused-Core Particle Technology in High-Performance Liquid Chromatography; An Overview. Journal of Pharmaceutical Analysis. 4. Viswanathan CT, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, Shah VP, Skelly JP, Swann PG, Weiner R, Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays, Pharm. Res., 24 (2007) Bansal S, DeStefano A, Key elements of bioanalytical method validation for small molecules, AAPS J., 9 (2007) E Cugno M, Agostoni P, Brunner HR, Gardinali M, Agostoni A, Nussberger. Plasma bradykinin levels in human chronic congestive heart failure J. Clin Sci. (Lond) Nov; 99(5): Nussberger J, Cugno M, Amstutz C, Cicardi M, Pellacani A, Agostoni A. Plasma bradykinin in angio-oedema. Lancet Jun 6; 351(9117): 致谢感谢 Jeffrey Widdos 和 Biological Specialty Corporation 为本研究所用人血浆的收集提供的服务和协助 Waters ACQUITY UPLC ACQUITY Oasis UNIFI Xevo 和 T he Science of W hat s Possible 是沃特世公司的注册商标 CORT ECS 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司印制于中国 2013 年 11 月 ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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