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1 在超高性能液相色谱 / 串联四极杆液质联用仪上利用极性切换及和盒式分析技术进行代谢物稳定性研究应用文摘作者 Anabel S. Fandiño, Edgar aegele Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA USA 摘要本应用介绍了在 90 超高性能液相色谱 /0A 串联四极杆液质联用仪上利用极性切换及和盒式分析技术进行代谢物稳定性研究的方法这种 UHPLC/MS/MS 方法具有以下优点 : 高通量分析 ( 在流动相流速.5 ml/min, 泵压为,00 bar 条件下, 保留时间小于 0.8 min) 快速的 MS/MS 分析, 周期仅为 ms, 在极性切换 ( 极性切换速度是 0 ms) 的模式下可以采集个 MRM transitions 优异的峰面积 [%] 或相对峰面积的相对标准差 (RSD) 精度 [%], 即使对于半峰宽为 0.7 秒的组分峰, 也能得到足够的数据点 ( 至少 9 个数据点 ) 使用内标或外标校准曲线得到的结果精度为 90.7%-07.% 极性切换模式或单极性模式得到的分析结果 ( 残留原药的百分数,%) 接近出色的色谱分离度避免了由于源内碰撞解离将代谢物转化成母体药物而导致的定量分析结果偏高

3 Agilent 90 Infinity 液相色谱分析方法流动相为 : A 相 : 含 0.% 甲酸的水溶液 B 相 : 含 0.% 甲酸的乙腈溶液进样体积 : µl 洗针 : 在洗针座用含 0.% 甲酸的甲醇水 (50/50 v/v) 溶液洗针 0 秒化合物内标母离子 MS 子离子 MS 驻留时间碰撞电压碰撞解离极性 (ISTD) 分辨率分辨率 [ms] [V] 能量 [V] 维拉帕米 55. 单位 5. 单位 5 85 正离子丁螺环酮 8 单位. 单位正离子双氯芬酸 -d X 98 单位 5 单位 5 80 负离子双氯芬酸 9 单位 50 单位负离子右美沙芬 7. 单位 5. 单位 5 90 正离子去甲右美沙芬 -d X. 单位 57. 单位正离子表 : MRM 模式及正 / 负切换模式 UHPLC 方法 : 柱温 : 5 C 或 0 C 流速 :.0 ml/min 梯度 : 5% B 保持 0. min, 在 min 80% B, 在.5 min 80% B, 在. min 5% B, 停止时间 :.8 min 化合物内标母离子 MS 子离子 MS 驻留时间碰撞电压碰撞解离极性 (ISTD) 分辨率分辨率 [ms] [V] 能量 [V] 维拉帕米 55. 单位 5. 单位 85 正离子丁螺环酮 8 单位. 单位 85 8 正离子双氯芬酸 9 单位 50 单位 80 8 正离子右美沙芬 7. 单位 5. 单位 90 正离子去甲右美沙芬 -d X. 单位 57. 单位 5 0 正离子表 : 在正离子模式下的 MRM 采集 UHPLC 方法 : 柱温 : 0 C 流速 :.5 ml/min 梯度 : 5% 保持 0. min, 在 0.7 min 80% B, 在.00 min 80% B, 在.0 min 5% B, 停止时间 :.5 min Agilent 0A 三重串联四极杆液质条件 : 扫描模式 : 多反应监测模式 (MassHunter 优化软件帮助您快速获得最佳的碰撞电压和碰撞解离能量, 已经优化好的质谱参数参见表, 和 ) 化合物内标母离子 MS 子离子 MS 驻留时间碰撞电压碰撞解离极性 (ISTD) 分辨率分辨率 [ms] [V] 能量 [V] Arbitrary 55. 单位 5. 单位 85 负离子 transition Arbitrary 8 单位. 单位 85 8 负离子 transition 双氯芬酸 9 单位 50 单位 95 5 负离子 Arbitrary 7. 单位 5. 单位 90 负离子 transition 双氯芬酸 -d X 98 单位 5 单位 80 负离子表 : 负离子模式下的 MRM 采集极性 : 正 / 负切换模式, 正模式或负模式参数 : 干燥气温度 :50 C, 干燥气流速 : 0 L/min, 鞘流气温度 : 00 C 鞘流气流速 : L/min, 雾化器压力 : 5 psig, 锥口电压 : 0 V (+) 000 V (-), 毛细管电压 :,000 V (+/-) 正负切换速度 : 0 ms

4 结果与讨论快速极性切换模式下采集速度和数据结果的质量在高流速 (.0 ml/min 或.5 ml/min) 和高压 ( 至,00 bar) 的条件下的超高性能液相色谱分离, 分离时间仅需.5 min, 但组分的半峰宽小于秒 ( 一般是 0. 至.0 sec) 由于质谱分析具有很低的循环时间, 所以针对每个峰能采集到足够的数据点 (> 9 数据点 ), 这样就保证了定量结果的精确度 ( 峰面积 RSD [%] 和相对峰面积 RSD [%] = 目标组分的峰面积 / 内标组分的峰面积, 相对标准偏差 < 0%) 图是流速在.5 和.0 ml/min 条件下,MRM 离子流图, 数据质量和分析时间的结果比较如果要得到好的定量分析结果, 则要求每个峰需要 9-0 个数据点组分峰越窄, 质谱检测器就需要具有越高的采集速度质谱分析的周期被缩短在每个循环周期内, 质谱需要采集在正负切换下的个 MRM transitions 图是 0 ms 的正负切换速度和 ms 的循环时间周期的条件下双氯芬酸的分析结果图中显示组分峰的半峰宽 0.7 sec, 每个峰的数据点是 9 个, 所以峰面积和相对峰面积的精度很好, 分别是.8 和 7.9% x ml/min, 070 bar, 5%B, : 0 C + MRM (55. -> 5.), 0.5 min Avg W / = 0. sec RSD [%] =.0 RSD [%] =.9.0 ml/min, 850 bar, 5%B, : 0 C x0 5 + MRM (55. -> 5.), 0.75 min Avg W / = 0.7 sec 5 RSD [%] =.9 RSD [%] =.9 x0 5 + MRM (8.0 ->.), 0. min x0 + MRM (8.0 ->.) 5 Avg W / = 0.70 sec 0 RSD [%] =. RSD [%] = , 0.0 min Avg W / =. sec 5 RSD [%] =.8 RSD [%] =. x0 + MRM (7. -> 5.), 0.0 min x0 +MRM (7. -> 5.) Avg W / = 0.98 sec 8 RSD [%] =. RSD [%] =., 0.5 min Avg W / =. sec 5 RSD [%] =.7 RSD [%] =.9 x0 - MRM (9.0 -> 50.0) - MRM (9.0 -> 50.0), 0.7 min < 0.8 min x0,.0 min Avg W / = 0.98 sec 9 RSD [%] = 7.9 RSD [%] =.8 Avg W / = 0.5 sec RSD [%] =.5 RSD [%] = 0 <. min (min) 图 : 在流速为.5 和.0 ml/min 下,MRM 的离子流图, 数据质量和分析时间 (min)

5 x0.8 -MRM (9.0 -> 50.0) 在快速极性切换下质谱分析结果的精确度和准确度评价 , narrowest peak Average W / = 0.7 sec 9 RSD [%] = 7.9 RSD [%] = =.5 sec (min) 在流速为.0 ml/min 和色谱柱温为 5 C (UHPLC 方法 ) 的条件下, 使用标准品进行了线性度, 精度和准确度的评价分析本研究模拟了预测范围内原药的残留百分数从内标或外标线性曲线得到的结果表明正负极切换的盒式分析能够提供预期范围内的线性分析结果而且, 各个水平的准确度和精度结果也非常好, 其结果参见表在使用内标定量过程中, 我们发现 5 Cl - 双氯芬酸 -d (m/z 98) 和 7 Cl - 双氯芬酸 (m/z 98) 的质量数一样而无法区分, 因为 7 Cl - 双氯芬酸的 98&5 的响应会影响到内标 5 Cl - 双氯芬酸 -d 的响应其结果是造成内标含量的虚高而导致形成二次曲线要解决这个问题, 可以采用外标定量或者采用专一的 MRM, 比如双氯芬酸 -d 的 98&7 (CE =7) = ms 图 : 是 0ms 的正负切换速度和 ms 的循环时间周期的条件下双氯芬酸的分析结果图中显示组分峰的半峰宽是 0.7 sec, 每个峰的数据点是 9 个 Evaluation of linearity, precision and accuracy using fast polarity switching 丁螺环酮维拉帕米右美沙芬双氯芬酸外标校正同位素稀释外标校正同位素稀释外标校正同位素稀释外标校正同位素稀释类型线性线性线性线性线性线性线性二次方 r 精确度范围 [%] ,9 00. 峰面积相对标准偏差 RSD [%] 相对标准偏差范围 [%] n.a.7.9 n.a...0 n.a n.a 表 : 利用盒式分析和正负极性切换的条件下, 定量校正曲线类型, 相关系数 (r), 精确度范围 [%], 峰面积相对标准偏差 [%] 和相对峰面积相对标准偏差范围 [%] 参考无, 不适用 5

6 正负切换和无正负切换模式下的分析混合底物的峰面积响应和结果精度在正负极性切换和非极性切换模式 ( 只是正模式或只是负模式 ) 下 ( 快速极性切换 ) 的组分峰面积响应平均值非常接近峰面积相对标准偏差和相对峰面积相对标准偏差在极性切换模式小于 0.% 而在非极性切换模式下小于 8.% 正 / 负切换与非极性切换分析代谢物稳定性分析 ( 剩余母体药物化合物的百分比 ) 通过样品孵育时间在 5-, 0-, 5-, 5-and 5- min 的母体药物化合物的浓度与样品孵育时间.0 ml/min, 870 bar 5%B, : 5 C x0 + MRM (55. -> 5.) Avg. Switched +/- to + only response = % x0 + MRM (55. -> 5.) x0 + MRM (8.0 ->.) Avg. Switched +/- to + x0 + MRM (8.0 ->.) only response = 0% x0 + MRM (7. -> 5.) Avg. Switched +/- to + only response = 09% x0 5 + MRM (7. -> 5.) x0 - MRM (9.0 -> 50.0) x0 - MRM (9.0 -> 50.0) Avg. Switched +/- to + only response = 70% min MRM transitions ( + ) = 5 ms = ms min 5 MRM transitions ( + ) = ms = 5 ms 丁螺环酮维拉帕米右美沙芬双氯芬酸峰面积标准偏差 RSD [%] 峰面积相对标准偏差 RSD [%] 峰面积相对标准偏差 RSD [%] 峰面积相对标准偏差 RSD [%] 峰面积标准偏差 RSD [%] 时间 [min] 正 / 负正正 / 负正正 / 负正正 / 负正正 / 负正图 : 快速极性切换模式下的 MRM 结果和峰面积响应 ( 左 ) 与非极性模式下的峰面积响应 ( 右 ) 的比较底部的是快速极性切换或非极性切换下的峰面积的精度

7 在 0 min 时母体药物化合物的比较来计算剩余母体药物化合物的 %: 剩余母体药物化合物 % = ( 某个时间点母体药物峰的峰面积 /0 min 时母体药物峰的峰面积 ) x 00 图. 在快速极性切换和非极性切换下维拉帕米的分析结果的相关性对于所有的底物, 其相关性是 r > 色谱图的分离度为盒式分析提供优势对于两个临界峰的分析显示出优异的分离度在代谢物稳定性研究中, 高分离度对于肝 S9 组分的分析是非常重要的如果代谢物热稳定性差并在源内 CID 过程中可能转化成母体药物的剩余母体药物化合物 (%) ( 在快速极性切换和非极性切换下的分析 ) 丁螺环酮维拉帕米右美沙芬双氯芬酸线性方程 y = 0.99 x y = x y = 0.90 x -.88 y =.7 x - 5. r t 5 t 5 t 5 t 0 t 5 y = 0.959x R = 图 : 在流速为.0 ml/min 和色谱柱温为 5 C(UHPLC 方法 ) 的条件下, 快速极性切换和非极性切换模式下剩余母体药物化合物 (%) 的比较 x MRM (0.0 ->.) + MRM (8.0 ->.) 0. min C H 5 (8 &.) 0.57 min 0.57 min - C H 5 (0 &.) (min) 话, 组分的共流出可能导致定量结果偏高图 5 是丁螺环酮 -- 氧化物在源内 CID 区通过去氧化转化成丁螺环酮的例子丁螺环酮与丁螺环酮 -- 氧化物的良好分离度就可以区分母体药物的丁螺环酮 ( 原本存在于孵育液中, 其保留时间是 0. min) 和假阳性的丁螺环酮 ( 由于丁螺环酮 -- 氧化物在源内 CID 过程中产生得到的丁螺环酮, 保留时间是 0.5 min) 图 5: 母体药物和可以在源内 CID 区通过脱氧化产生丁螺环酮的代谢物丁螺环酮 -- 氧化物之间具有良好的分离度 7

8 结论在安捷伦的 UHPLC/MS/MS 系统上利用盒式分析和快速极性切换功能可以获得 : 盒式分析的设计具有很好的灵活性 : 正和负模式下离子化的组分可以混在一起分析高通量分析 ( 在流速为.5 ml/min 和泵压为 00 bar 的条件下, 其分析时间小于 0.8 min) 快速的 MS/MS 分析, 循环时间只有毫秒, 可以在正负极性切换 (0 ms) 模式下检测个 MRM transitions 参考文献. Timothy J. Carlson and Michael B. Fisher, Recent Advances in High Throughput Screening for ADME Properties, Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, Vol, o, March 008, Walter A. Korfmacher, Principles and applications of LC-MS in drug discovery, Drug Discovery Today, Vol 0, o 0, ctober 005, 很好的峰面积和相对峰面积的精度, 相对标准偏差小于 0 %, 即使对半峰宽为 0.7 sec 的组分峰也能得到 9 个数据点在内标或外标定量条件下, 在整个浓度范围内具有良好的精度 ( %) 在极性切换和非极性切换条件下的结果相差无几 ( 母体药物的剩余百分数 ) 良好的分离度避免了由于代谢物在源内 CID 过程中产生母体药物化合物而导致定量结果偏高本研究只适用于研究目的而不用于诊断本文中的信息, 描述和性能指标可能更新和更改而无需提前通知安捷伦不对本文中可能出现的错误及由于本文直接或间接导致的损失承担任何责任安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 9 月 5 日, 中国发行 CHC

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2c_CorporateSig-woHL.eps 应用安捷伦 ZORBAX 超高压快速高分离度 HILIC Plus 色谱柱的 LC/MS/MS 测定不同进样溶剂对维生素 B 分析的影响应用简报食品检测与农业作者 Anne E. Mack 安捷伦科技有限公司摘要 Agilent 29 Infinity 液相色谱与 Agilent 64A 三重四极杆质谱联用系统上, 采用安捷伦 ZORBAX 超高压快速高分离度 HILIC Plus 色谱柱对维生素