在制药行业中, 基因毒性杂质通常相对于药品中的 API 剂量进行报告这意味着 10 ng/ml 的定量限 ( 例如 ) 对应于含 1 mg API 产品的限值为 10 ppm 针对不同 API 剂量计算得到的定量限 (ppm) 的示例如表 2 所示定量限 (ng/ml) API 剂量 (mg)

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辅棍来
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[ 应用纪要 ] Margaret Maziarz 和 Mark Wrona 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势紫外和 QDa 质谱检测器联用, 加上稳定快速的 UPLC 方法实现苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的高通量分析采用 ACQUITY QDa 质谱检测器质量数检测功能对组分进行准确鉴定使用 ACQUITY QDa 质谱检测器提高基因毒性杂质监测的灵敏度和选择性

美国 FDA 和国际协调会议 (ICH M7)) 发布了关于药物成分中基因毒性杂质允许限值的指导原则, 以确保药品的安全 2-4 指导原则要求药物或药品中的所有潜在基因毒性杂质(PGI) 均必须低于每日 1.5 µg 的毒理学关注阈值 (TTC)( 基于药物化合物终身暴露的每日最大剂量 ) 对于较短的暴露持续时间而言, 每日摄入量高于 1.

1 [ 应用纪要 ] Margaret Maziarz 和 Mark Wrona 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势紫外和 QDa 质谱检测器联用, 加上稳定快速的 UPLC 方法实现苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的高通量分析采用 ACQUITY QDa 质谱检测器质量数检测功能对组分进行准确鉴定使用 ACQUITY QDa 质谱检测器提高基因毒性杂质监测的灵敏度和选择性简介基因毒性杂质 (GTI) 是药物合成过程中可能形成的中间体或反应产物除工艺杂质之外, 某些药物在配制或储存过程可通过降解产生 GTI 1 基因毒性化合物可能与 DNA 发生反应, 从而导致致癌反应和肿瘤发展因此, 在早期药物开发过程中必须对这些杂质进行鉴定, 因此准确测定药物和药物产品中这些杂质的可靠且高度灵敏的方法就显得至关重要监管机构 ( 包括欧洲药品管理局 (EMEA) 美国 FDA 和国际协调会议 (ICH M7)) 发布了关于药物成分中基因毒性杂质允许限值的指导原则, 以确保药品的安全 2-4 指导原则要求药物或药品中的所有潜在基因毒性杂质(PGI) 均必须低于每日 1.5 µg 的毒理学关注阈值 (TTC)( 基于药物化合物终身暴露的每日最大剂量 ) 对于较短的暴露持续时间而言, 每日摄入量高于 1.5 μg 是可以接受的根据 ICH M7 指导原则的规定, 在短于终身 (LT L) 至终身暴露期间的交错 TTC 可接受限值列于表 1 中 4 治疗持续时间每日摄入量 [μg/ 天 ] 1 个月 > 1-12 个月 > 1-10 年 > 10 年至终身沃特世解决方案 ACQUITY UPLC H-Class 系统表 1. 交错毒理学关注阈值 (TTC) 根据 ICH M7 指导原则的规定, 在短于终身 (LT L) 至终身暴露期间单一杂质的每日可接受摄入量 4 ACQUITY UPLC 色谱柱 ACQUITY QDa 质谱检测器 ACQUITY UPLC PDA 检测器 Empower 3 色谱数据软件 (CDS) 关键词 UPLC,QDa, 基因毒性杂质,PGI, 质谱检测, 亚 2 μm 颗粒色谱柱 1

2 在制药行业中, 基因毒性杂质通常相对于药品中的 API 剂量进行报告这意味着 10 ng/ml 的定量限 ( 例如 ) 对应于含 1 mg API 产品的限值为 10 ppm 针对不同 API 剂量计算得到的定量限 (ppm) 的示例如表 2 所示定量限 (ng/ml) API 剂量 (mg) 限值 (ppm) 10 1 mg 10 ppm 10 mg 1 ppm 100 mg 0.1 ppm 1000 mg 0.01 ppm 本应用纪要介绍了一种能够稳定快速分析苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的 UPLC 方法该 UPLC 方法使用 UV 与配备 ACQUITY QDa 质谱检测器的质谱检测系统, 可快速准确地监测基因毒性杂质我们将展示该方法中 UV 和质谱检测均可实现的线性灵敏度和专属性此外, 我们将应用该方法分析苯磺酸氨氯地平原料药总之, 通过采用质谱检测, 我们能够提高方法的灵敏度和选择性, 这对于分析药物样品中的低浓度杂质至关重要表 2. 药品中不同 API 剂量下的定量限计算值 (ppm) 甲磺酸 ( 甲磺酸盐 ) 苯磺酸 ( 苯磺酸盐 ) 和对甲苯磺酸 ( 甲苯磺酸盐 ) 等磺酸常用作 API 的配对离子形成盐这些磺酸可与残留醇类相互作用, 形成的烷基磺酸酯可看作 PGI 1 当前文献中用于分析这些烷基磺酸酯的方法包括液相色谱与质谱联用法以及 GC-MS 1 这两种技术虽然有效, 但是或者操作过于复杂或者需要柱前衍生步骤以提高分析物的可检测性, 不适用于日常常规检测质谱检测器与 UPLC 联用能够直接而准确地分析烷基磺酸酯, 无需柱前衍生方案 UPLC- QDa 方案同时提供了快速分析药品中低浓度潜在基因毒性杂质时所需的选择性和灵敏度 2

3 实验样品描述本研究中所用的材料包括 : 苯磺酸甲酯 (Sigma, 部件号 ) 苯磺酸乙酯 (Sigma, 部件号 S544787) 溶剂 A: 溶剂 B: 分离 : 5 mm 醋酸铵水溶液 ( 分析甲酯时优化为 1 mm 醋酸铵, 以提高 MS 检测的灵敏度 ) 甲醇梯度苯磺酸异丙酯 (Cayman Chemicals, 部件号 17795) 苯磺酸 (Sigma, 部件号 12635) 苯磺酸氨氯地平 API(Sigma, 部件号 A MG) 标准品溶液利用甲醇配制苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的独立储备液, 浓度为 1.0 mg/ml 将等体积的各种储备液移至一个样品瓶中, 并用标准稀释剂 (20:80 甲醇 /5 mm 醋酸铵 ) 进行稀释, 制得各种分析物浓度均为 50 µg/ml 的混合溶液用标准稀释剂 (20:80 甲醇 /5 mm 醋酸铵 ) 连续稀释该混合溶液, 制得线性标准品溶液 UV 检测标准曲线的浓度配制如下 : 和 ng/ml MS 检测的标准曲线浓度包括 : 和 500 ng/ml API 样品将苯磺酸氨氯地平 API 溶解于甲醇中, 得到浓度为 2 mg/ml 的溶液, 然后用稀释剂 (20:80 甲醇 /5 mm 醋酸铵 ) 将其稀释为 1 mg/ml UPLC 方法条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC H-Class 色谱柱 : ACQUITY UPLC CSH C 18, 1.7 µm, 2.1 mm 50 mm( 部件号 ) 柱温 : 40 C 流速 : 0.6 ml/ 进样体积 : 8.0 µl( 分析甲酯时优化为 10 μl, 以提高 MS 检测的灵敏度 ) 步骤时间溶剂 A 溶剂 B 曲线 () (%) (%) 1 初始初始清除清洗液 : 样品清洗液 : 密封清洗液 : UV 检测器 : 50:50 水 / 甲醇 50:50 水 / 甲醇 90:10 水 / 乙腈 ACQUITY UPLC PDA, nm, 在 220 nm 下检测 MS 条件质谱检测器 : ACQUITY QDa( 性能选件 ) 电离模式 : ESI+,ESI- MS 采集时间 : MS 采集范围 : Da SIR(+): 和 Da 采样速率 : 10 pts/s 毛细管电压 : 正 1.4 kv, 负 0.8 kv 锥孔电压 : 6 V 探头温度 : 300 C 数据 : 质心数据管理 Empower 3 CDS 软件 3

结果与讨论苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的化学结构如表 3 所示分离这些化合物得到的 UV 和 MS 色谱数据如图 1 所示 UV 谱图 ( 图 1a) 表明苯磺酸在其甲酯乙酯和异丙酯之前洗脱在质量范围 (100-250 Da) 内采集的 ACQUITY QDa MS 数据 ( 图 1b 和 1c) 称为总离子流色谱图 (TIC), 表明在 ESI+ 模式下可检测出烷基酯, 而在 ESI-

4 结果与讨论苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的化学结构如表 3 所示分离这些化合物得到的 UV 和 MS 色谱数据如图 1 所示 UV 谱图 ( 图 1a) 表明苯磺酸在其甲酯乙酯和异丙酯之前洗脱在质量范围 ( Da) 内采集的 ACQUITY QDa MS 数据 ( 图 1b 和 1c) 称为总离子流色谱图 (TIC), 表明在 ESI+ 模式下可检测出烷基酯, 而在 ESI- 模式下可检测出苯磺酸质谱数据表明酯类形成了铵加合物 [M+NH4] + 参数苯磺酸甲酯 (MBS) 苯磺酸乙酯 (EBS) 苯磺酸异丙酯 (IBS) 苯磺酸结构分子式 C 7 H 8 O 3 S C 8 H 10 O 3 S C 9 H 12 O 3 S C 6 H 6 O 3 S 单同位素质量数 (Da) QDa 检测 (Da) [M+NH 4 ] + = [M+NH 4 ] + = [M+NH 4 ] + = [M-H] - = 表 3. 本研究中考察的基因毒性杂质 : 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯 AU MBS EBS IBS MBS EBS IBS a) 220 nm 7.2x x x10 7 MBS EBS IBS MBS EBS IBS b) MS TIC (+) Da c) MS TIC (-) Da 图 1. 分离苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯得到的 UV 和 MS 色谱数据将苯磺酸用作参比物质以说明所有组分均得到分离 4

UV 检测 UV 数据表明, 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯在 50-10,000 ng/ml 之内的七个浓度水平下具有可接受的线性, 使用线性拟合得到的相关系数 (R 2 ) 0.9991( 图 2) ID 41602 PDA Ch1 220nm@4.8nm 50 10000 ng/ml 50 10000 ng/ml 100 10000 ng/ml MBS; R^2 0.999541; R 1.

5 UV 检测 UV 数据表明, 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯在 50-10,000 ng/ml 之内的七个浓度水平下具有可接受的线性, 使用线性拟合得到的相关系数 (R 2 ) ( 图 2) ID PDA Ch1 220nm@4.8nm ng/ml ng/ml ng/ml MBS; R^ ; R ; Y = 3.26e + 001X e EBS; R^ ; R ; Y = 2.96e + 001X e IBS; R^ ; R ; Y = 1.29e + 001X e 图 2. 采用 UV 在 220 nm 下得到的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的方法线性分别按照 3:1 和 10:1 的信噪比标准来确定检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 对含苯磺酸酯标准品的六次重复进样数据进行评估, 以确定和验证 LOD 和 LOQ 限值下的性能采用 UV 检测得到的烷基磺酸酯的 LOD 和 LOQ 值列于表 4 中苯磺酸甲酯 / 乙酯以及苯磺酸异丙酯的 LOQ 值分别为 50 ng/ml 和 100 ng/ml ID 分析物 LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) 表 4. 采用 UV 在 220 nm 下得到的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的检测限和定量限 RT 的 %RSD (LOQ) 峰面积的 %RSD (LOQ) MBS 苯磺酸甲酯 EBS 苯磺酸乙酯 IBS 苯磺酸异丙酯

MS 检测在醋酸铵流动相条件下, 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯形成铵加合物 [M+NH4] + 使用单离子记录(SIR) 模式测量这些离子, 以测定单个目标离子的强度 ( 图 3) 在靶标分析检测中,SIR 模式提高了方法灵敏度并简化了分析和定量为优化苯磺酸甲酯的灵敏度, 对 1-20 mm 范围内的不同醋酸铵浓度进行了考察结果表明采用 1 mm 醋酸铵可获得最高的 MS 响应此外,

6 MS 检测在醋酸铵流动相条件下, 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯形成铵加合物 [M+NH4] + 使用单离子记录(SIR) 模式测量这些离子, 以测定单个目标离子的强度 ( 图 3) 在靶标分析检测中,SIR 模式提高了方法灵敏度并简化了分析和定量为优化苯磺酸甲酯的灵敏度, 对 1-20 mm 范围内的不同醋酸铵浓度进行了考察结果表明采用 1 mm 醋酸铵可获得最高的 MS 响应此外, 将进样体积从 8 μl 增加至 10 μl 能够进一步提高甲酯的灵敏度 2x10 6 1x DaSIR 8x10 6 4x DaSIR 4x10 6 2x DaSIR 0 图 3. 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的 MS SIR 数据标准品溶液浓度为 1 µg/ml 对采用质谱检测 ng/ml 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的方法线性进行了评估, 所得到的方法线性可接受, 相关系数 (R 2 ) ( 图 4) ng/ml _MS ID QDa 2: SIR Ch ng/ml _MS ID QDa 2: SIR Ch ng/ml _MS ID QDa 2: SIR Ch3 MBS; R^ ; R ; Y = 2.92e + 003X e EBS; R^ ; R ; Y = 8.89e + 003X e IBS; R^ ; R ; Y = 5.28e + 003X e 图 4. 采用质谱检测得到的苯磺酸烷基酯的方法线性使用 MS SIR 采集模式在通道 1:190.0 通道 2:204.0 和通道 3:218.0 Da 下对数据进行处理 6

7 使用含苯磺酸酯标准品的六次重复进样所生成的信噪比数据测定 LOD 和 LOQ MS 检测的 LOQ 和 LOD 值列于表 5 中发现苯磺酸甲酯 / 乙酯以及苯磺酸异丙酯的 LOQ 分别为 7.5 ng/ml 和 1.5 ng/ml 对于所有三种苯磺酸酯而言,LOQ 溶液六次重复进样所得的保留时间和峰面积重现性较高,RT 和峰面积的 %RSD 分别小于 0.05% 和 7.67% ID 分析物 SIR (Da) LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) RT 的 %RSD (LOQ) 峰面积的 %RSD (LOQ) MBS 苯磺酸甲酯 EBS 苯磺酸乙酯 IBS 苯磺酸异丙酯表 5. 使用 MS SIR 数据测得的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的检测限和定量限苯磺酸氨氯地平 API 的分析苯磺酸氨氯地平 API 是氨氯地平的苯磺酸盐形式, 用于治疗血压偏高 ( 高血压 ) 胸痛 ( 心绞痛 ) 及冠状动脉疾病引起的其他病症 5 其常见形式为口服片剂, 每片含 2.5 mg 5 mg 和 10 mg 药物, 推荐的最大剂量为每日 10 mg 在苯磺酸氨氯地平 API 成盐的过程中, 苯磺酸可能与残留醇类反应, 形成具有潜在基因毒性的烷基酯 ( 图 5) 因此, 监测该药物中是否存在这些酯类化合物对于确保药品的安全性至关重要 Da Da Da + (ROH) + H 2 O R = 图 5. 苯磺酸氨氯地平 API 的成盐途径和苯磺酸潜在基因毒性醇酯的形成 7

8 在低浓度或痕量分析中, 需要在存在样品基质的情况下对杂质进行分离与准确测量为证明本文所用 MS 方法的专属性, 我们在苯磺酸氨氯地平 API 中加标了 LOQ 浓度的三种苯磺酸烷基酯在含有 1 mg/ml API 的样品中分别加标 7.5 ng/ml 苯磺酸甲酯以及 1.5 ng/ml 苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯 LOQ 标准品未加标 API 样品和加标烷基酯的 API 样品的 MS 色谱数据分别如图 6 图 7 和图 8 所示数据表明, 未加标的苯磺酸氨氯地平样品中不含在烷基酯保留时间处洗脱的任何峰数据还表明 LOQ 标准品和加标药物样品中烷基酯的信噪比相当此外, 在加标浓度为 LOQ 的 API 样品中, 分析物的平均回收率为 90% - 110%, 六次样品进样回收率的 %RSD 为 ( 图 9) 结果证明在存在苯磺酸氨氯地平 API 的情况下, 苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯可准确测量 (MBS) Da SIR MBS 7.5 ng/ml S/N: 15 MBS LOQ 7.5 ng/ml S/N: mg/ml 图 6. 分析苯磺酸甲酯得到的 MS SIR 数据 LOQ 标准品 ( 浓度为 1 mg/ml 的未加标 API 样品 ) 以及加标 7.5 ng/ml 苯磺酸甲酯的 API 样品 MBS (EBS) Da SIR 1.5 ng/ml S/N: EBS mg/ml LOQ 1.5 ng/ml S/N = 14 EBS 0.0 图 7. 分析苯磺酸乙酯得到的 MS SIR 数据 LOQ 标准品 ( 浓度为 1 mg/ml 的未加标 API 样品 ) 以及加标 1.5 ng/ml 苯磺酸乙酯的 API 样品 (IBS) Da SIR ng/ml S/N: 13 IBS mg/ml LOQ 1.5 ng/ml S/N: 15 IBS 图 8. 分析苯磺酸异丙酯得到的 MS SIR 数据 LOQ 标准品 ( 浓度为 1 mg/ml 的未加标 API 样品 ) 以及加标 1.5 ng/ml 苯磺酸异丙酯的 API 样品 8

SIR @ 190.1 Da % QDa 2: SIR Ch1 SIR @ 204.0 Da % QDa 2: SIR Ch2 SIR @ 218.0 Da % QDa 2: SIR Ch3 API w/ 7.

从加标浓度为 LOQ 的 1 mg/ml 苯磺酸氨氯地平 API 样品中获得的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的回收率结果在 MS SIR 采集模式下处理数据如简介中所述, 基因毒性杂质通常相对于药品中 API 剂量的 ppm

5 ppm 该值低于之前设定的 15 ng/ml 的值, 而 15 ng/ml 在 50 mg/ml 的 API 样品浓度下报告为 0.

9 Da % QDa 2: SIR Ch Da % QDa 2: SIR Ch Da % QDa 2: SIR Ch3 API w/ 7.5 ng/ml API w/ 1.5 ng/ml API w/ 1.5 ng/ml % % % 图 9. 从加标浓度为 LOQ 的 1 mg/ml 苯磺酸氨氯地平 API 样品中获得的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的回收率结果在 MS SIR 采集模式下处理数据如简介中所述, 基因毒性杂质通常相对于药品中 API 剂量的 ppm 浓度进行报告这意味着在我们的方法中,7.5 ng/ml 的苯磺酸甲酯 MS 定量限对应于 1 mg/ml API 溶液中的 7.5 ppm 溶液中存在 5 mg/ml API 时这一限值也可得到准确测量, 其对应于 1.5 ppm 该值低于之前设定的 15 ng/ml 的值, 而 15 ng/ml 在 50 mg/ml 的 API 样品浓度下报告为 0.33 ppm 6 表 6 展示了由含有 1 mg/ml 和 5 mg/ml API 的样品溶液计算得到的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的定量限 (ppm) API 浓度 (mg/ml) 苯磺酸甲酯苯磺酸乙酯苯磺酸异丙酯 ng/ml ppm ng/ml ppm ng/ml ppm 表 6. 相对于溶液中的 API 浓度计算得到的苯磺酸甲酯乙酯和异丙酯的 MS 方法定量限 (ppm) 9

10 结论 ACQUITY UPLC H-Class 系统与 ACQUITY UPLC PDA 检测器和 ACQUITY QDa 质谱检测器联用为检测潜在基因毒性杂质提供了一种优异的解决方案, 可实现准确的确证和定量 ACQUITY QDa 能够通过质量数快速准确地确证色谱峰使用质谱检测器和单离子扫描 (SIR) 提高了分析样品中低浓度杂质专属性和灵敏度 MS 方法在定量限水平上的良好的重现性和准确性, 证明质谱检测器适用于药品中基因毒性杂质的常规监测此外,UPLC 与质谱检测器联用的结果表明,1-5 mg/ml API 时对应的定量限满足有关基因毒性杂质分析的法规要求总的来说,ACQUITY QDa 质谱检测器是一款性能稳定且简单易用的检测器, 可作为正交检测技术对 UV 检测进行补充它可以提供准确可靠的结果, 是 QC 实验室进行药品常规检测的理想技术参考文献 1. Liu D.Q., Sun M., Kord A.S. Recent Advances in Trance Analysis of Pharmaceutical Genetoxic Analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis The European Medicines Evaluation Agency (EMEA), Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP), Guidelines on the limits of Genotoxic Impurities, CPMP/SW P/5199/02, 28 June U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Adistration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry, Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches. December ICH M7, Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. International Conference on Harmonization. 23 June cfm?archiveid= Taylor G.E., Gosling M., Pearce A. Low Level Deteration of p-toluenesulfonate and Benzenesulfonate Esters in Drug Substance by High Performance Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry. Journal of Chromatography A : 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters The Science of What s Possible UPLC ACQUITY Empower QDa 和 ACQUITY UPLC 是沃特世公司的注册商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 2016 年沃特世公司中国印刷 2016 年 4 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

在制药行业中, 基因毒性杂质通常相对于药品中的 API 剂量 进行报告 这意味着 10 ng/ml 的定量限 ( 例如 ) 对应于含 1 mg API 产品的限值为 10 ppm 针对不同 API 剂量计算得到的定量限 (ppm) 的示例如表 2 所示 定量限 (ng/ml) API 剂量 (mg)

在制药行业中, 基因毒性杂质通常相对于药品中的 API 剂量进行报告这意味着 10 ng/ml 的定量限 ( 例如 ) 对应于含 1 mg API 产品的限值为 10 ppm 针对不同 API 剂量计算得到的定量限 (ppm) 的示例如表 2 所示定量限 (ng/ml) API 剂量 (mg)