实验 LC 条件 系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC HSS C mm,1.8 µm 柱温 : 45 流速 : 350 µl/min 流动相 A: 3 mm 甲酸铵,pH2.9( 甲酸 ) 流动相 B: 含 0.1% 甲酸的乙腈 初始条件

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1 [ 应用纪要 ] 使用 UPLC/MS/MS 对用于增强男性性功能的中草药 / 营养保健品中非法添加的药物进行筛查 确证和定量 Salman Azimi, 1 Nayan S. Mistry, 2 和 Michelle Wood 2 1 卡塔尔多哈, 健康最高委员会, 药物质量控制实验室 2 沃特世公司 ( 英国曼彻斯特 ) 应用优势本实验首次针对已知和未知的勃起功能障碍 (ED) 药物及其类似物, 成功地建立起一种新型分析筛查方法, 此筛选方法由高灵敏度和高选择性的 MS/MS 质谱法进行确证和补充 全扫描 MS 筛选方法可准确检测出已知和未知的 ED 药物及其类似物 本方法单次分析可检测很多的 ED 药物 在数据处理过程中, 可溯源全扫描数据 稳定 高灵敏度和高选择性的 MS/MS 方法可进一步确证 完善分析结果沃特世解决方案 ACQUITY UPLC 系统 ACQUITY TQD ACQUITY UPLC HSS C mm,1.8 µm 色谱柱 MassLynx 软件 ChromaLynx 应用软件 TargetLynx 应用软件 简介据估计, 世界上有 1.5 亿男性患有勃起功能障碍 (ED), 到 2025 年这个数据将翻一番 1 万艾可 ( 枸橼酸西地那非 ) 是美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准的首个男性勃起功能障碍治疗药物 自 1998 年上市以来, 万艾可被称作有史以来最成功的药物之一 迄今为止, 市场中的其它 ED 药物仍相对较少 FDA 批准的药物包括 : 艾力达 ( 盐酸伐地那非 ) 希爱力( 他达拉非 ) Staxyn( 伐地那非口腔崩解片 ) 和 Stendra ( 阿伐那非 ) 在世界的其他地区还批准上市了其它药物, 如在韩国和其他亚洲国家的乌地那非 (Zydena) 这些已获批的药物的疗效 毒性反应和药物间的相互作用已知, 并保留有相关记录 在大多数国家, 这些药物只有在医师处方的指导下才能使用 使用中草药治疗剂和营养保健品治疗 ED 越来越受欢迎 虽然有报道称一些来源于天然产品的化合物如育亨宾 淫羊藿苷具有增强性功能的作用, 但事实上绝大多数所谓的 纯天然 产品都掺入了未申报的 ED 药物或未经批准的 ED 结构类似物 世界范围内均出现过伪劣产品的报道, 而且这个问题日益严重 2 由于未公开的获批处方药和安全性和毒性尚不清楚的未获批的 ED 药物, 这些产品对消费者的健康构成了严重的威胁 对于非法广告中有关提高男性性功能的伪劣产品, 国家每年都会发出无数次警告 所以, 人们对这些产品中 ED 药物及其类似物的鉴别极为关注 关键词 UPLC /MS/MS, 万艾可,ED 类似物, 非法添加剂, 中草药保健品, 营养保健品 1

2 实验 LC 条件 系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : ACQUITY UPLC HSS C mm,1.8 µm 柱温 : 45 流速 : 350 µl/min 流动相 A: 3 mm 甲酸铵,pH2.9( 甲酸 ) 流动相 B: 含 0.1% 甲酸的乙腈 初始条件 : 80% 流动相 A 梯度 : 流动相 B 梯度上升至 98% 分析时间 : 15 min 弱清洗 : 乙腈 / 水 (20:80) ( 含 0.1% 甲酸 ) 强清洗 : 乙腈 / 水 (80:20) 进样体积 : 10 µl MS 条件 质谱仪 : ACQUITY TQD 电离模式 : ESI+ 和 ESI- 毛细管电压 : 3.0 kv 锥孔电压 : ESI+ 20V-100V ( 增量为 20V) ESI- 105V 脱溶剂气温度 : 375 脱溶剂气 : 700 L/h 源温度 : 150 筛选条件 : UPLC/MS ESI+ m/z ESI- m/z 确证 / 定量 : UPLC/MS/MS 多重反应监测 (MRM), 见表 1 样品描述所搜集的样品为胶囊 片剂 丸剂以及蜂蜜 / 中草药饮品 称取 100 mg 的样品粉末 ( 若为蜂蜜, 则称取 2 g) 置于容量瓶中, 加入甲醇 / 水 (75:25)15 ml 超声提取 20 min, 向容量瓶中加入甲醇 / 水 (75:25) 至 20 ml, 样品震摇 5 min 以 4000 rpm 速率离心 8 min, 然后取上清液并用 PVDF 注射器过滤器进行过滤 分析之前, 先使用流动相 A: 流动相 B(80:20) 的混合溶液对样品进行稀释 稀释 50 倍的样品用作筛选分析, 稀释 倍的样品用作确证分析 结果与讨论筛选步骤 :UPLC/MS 为达到筛选目的, 需准备一个已知 ED 药物及其结构类似物的谱库 根据最近报道 : 集所有功能于一身 / 组合功效 中草药产品, 3 我们的实验对象包括了这些产品中含有的天然产物如淫羊藿苷和育亨宾, 合成物达泊西汀 ( 治疗早泄 ) 及睾酮 根据前述方法创建谱库 4, 通过在多个锥孔电压条件 ( 源内碰撞诱导解离 :CID) 下执行的 UPLC 串联全扫描 MS 分析生成谱图信息和保留时间 (RT), 如图 1 所示 图 1. 5 种药物的质谱图 锥孔电压 100V,ESI+ 模式下的质谱扫描图 ( 右图 ) 和锥孔电压 105V,ESI- 模式下的质谱扫描图 ( 左图 ) 质谱图显示, 西地那非和伐地那非的所有结构类似物中存在共有碎片离子 m/z 282(ESI-) 2

3 使用 ChromaLynx 应用软件进行自动数据处理,ChromaLynx 将检查在各锥孔电压下生成的谱图, 检 测出各组分并计算与谱库之间的平均谱图匹配因子 (MF) 以 ESI 正离子 (ESI+) 和 ESI 负离子 (ESI-) 模式, 在多重锥孔电压条件下结合 RT 进行高置信度识别筛查 物质 保留时间 (min) 母离子 (m/z) 锥孔电压 (V) 定量离子 (m/z) CE (V) 定性离子 (m/z) CE (V) 驻留时间 (ms) LOQ (ng/ml) 育亨宾 乙酰伐地那非 Carbodenafil 羟基伐地那非 羟基红地那非 Nor- 红地那非 伐地那非 红地那非 Piperi 红地那非 淫羊藿苷 羟基蒙莫西地那非 阿伐那非 西地那非 蒙莫西地那非 二甲基西地那非 氨基他达那非 乌地那非 Nor- 他达拉非 他达拉非 Benzamidenafil 达泊西汀 苄基西地那非 羟基硫代蒙莫西地那非 睾酮 硫代西地那非 硫代豪莫西地那非 硫代二甲基西地那非 甲基睾酮 Gendenafil 伪伐地那非 那莫西地那非 N- 丁基诺他达拉非 表 1. ED 化合物的保留时间和最佳 MRM 参数列表 3

4 追踪新出现的 ED 类似物是一项比较困难的工作 因此, 我们计划增加一项额外扫描功能, 该功能可在高能量的 ESI- 模式下同步执行 在这些条件下, 检测得出西地那非 红地那非 伐地那非及其各自类似物的特征性碎片离子图, 如图 1 和图 2 所示 同样, 这些条件表明他达拉非及其各类似物具有共同的碎片离子 m/z 232, 硫代西地那非类似物的共有碎片离子为 m/z 298, 如图 3 所示 因此, 任何这些共有 特征离子的出现都可能暗示一个新的结构类似物 图 2. 未知物 筛选 在 ESI 负离子模式 ( 锥孔电压为 105 V) 下进行 MS 扫描, 产生失去 -CH(-28) 的母离子 [M-H] 和共有的碎片离子 m/z 282( 西地那非 伐地那非和红地那非类似物的共有离子 ) 图 3. 查获的 yunna 胶囊分析结果 上方的色谱图 (ESI-) 显示, 该胶囊中含有硫代西地那非和硫代二甲基西地那非, 同时还发现有少量的西地那非和二甲基西地那非 后者可能是硫代羰基水解为羰基 (C = S C = O) 的产物 下方色谱图显示了相同样品的质谱图 谱图显示生成了西地那非硫代类似物的共有碎片离子 m/z 298 4

5 确认步骤 :UPLC/MS/MS 为便于以后对三种备选基质 ( 包括胶囊 片剂 丸剂 ) 以及蜂蜜和中草药饮料进行定量分析, 本实验开发了 MRM 方法开发并用于验证 在 ng/ml 的浓度范围内建立校准曲线 本研究中所有化合物的确定系数 (R 2 ) 均 向中草药基质中添加混合标准品进行精密度实验, 浓度为 2 ng/ml 时,26 种化合物的变异系数 <11%, 浓度为 10 ng/ml 和 100 ng/ml 时所有化合物的变异系数 <10% 定量离子和定性离子的信噪比 10:1 时,29 种化合物的定量限 (LOQ) 1.0 ng/ml, 见表 1 实际样品检测 本实验对多哈药物控制实验室在 2010 年 10 月至 2011 年 8 月期间收集的 43 种可疑样品进行了全扫描分析, 结果表明其中 18 种样品掺假, 含有未获得批准的物质 如表 2 所示 样品 候选物 R T 样品 表 种掺假中草药 / 保健品的检测综合结果 除后续验证分析的定量数据外, 筛选检测结果包括谱图匹配因子 保留时间数据和最终筛选结果 (+ 代表阳性,- 代表阴性 ) * 匹配因子是用于确定是 / 否的判定数据 R T 实际 R T 匹配 平均匹配因子 * 硫代西地那非 mg/ 包 Royal Honey( 皇家蜂蜜 ) [7] 硫代二甲基西地那非 mg/ 包 硫代蒙莫西地那非 X 硫代西地那非 mg/ 粒 [7] Yunna 500 mg 胶囊 硫代二甲基西地那非 mg/ 粒 硫代蒙莫西地那非 X 中药丸 西地那非 mg/ 丸 希爱力 20 mg( 仿冒品 ) 西地那非 mg/ 片他达拉非 mg/ 片 未知的蓝色药片 蒙莫西地那非 X 二甲基西地那非 mg/ 片 SATIBO( 三便宝 ) 西地那非 mg/ 粒 Russian Viagra( 俄罗斯万艾可, 黑色 ) 西地那非 mg/ 片 未知的片剂 氨基他达那非 mg/ 片 韩国蜂王浆 西地那非 mg/g MAXMAN 胶囊 西地那非 mg/ 粒 状态 含量 5

6 结论本实验首次展示了一种新型的筛选方法, 该方法可以在单次分析过程中同时检测已知和目前未知的 ED 药物及其类似物 全扫描数据可同时在 ESI+ 和 ESI- 模式下采集, 利用多重能量条件获得综合质谱数据 这些数据可与已知药物谱库进行自动对比 高能量 ESI- 数据可用于帮助鉴别目前未知的 ED 类似物 此外, 本实验还对 32 种 ED 药物 / 类似物的定量确证方法进行了开发和验证 结果表明,UPLC/MS/MS 方法灵敏 准确 线性良好 参考文献 1. European markets for erectile dysfunction drugs, devices and therapies. lifescienceintelligence.com/market-reports-page.php?id=a452, last accessed 2012 September. 2. Tainted sexual enhancement products. Drugs/ ResourcesForYou/Consumers/BuyingUsingMedicine Safely/MedicationHealthFraud/ucm htm, last accessed 2012 June. 3. Dean J, Klep R, Aquilina J. Counterfeit dapoxetine sold on the internet contains undisclosed sildenafil.int J Clin Pract. 2010; 64(9): Lee R, Roberts M, Paccou A, Wood M. Development of a new UPLC /MS method for systematic toxicological analysis.waters Application Note en 本实验还使用这些方法对多哈药物控制实验室在 2010 年 10 月至 2011 年 8 月期间收集的 43 种样品进行了分析, 分析 结果显示其中 18 种样品中掺入了未经批准的 ED 物质 实验室在应用本方法之前, 用户有必要对本方法进行一 次完整的验证 Waters ACQUITY UPLC ACQUITY 和 UPLC 是沃特世公司的注册商标 MassLynx ChromaLynx TargetLynx 和 T he Science of W hat's Possible 是沃特世公司的商标 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2012 年沃特世公司 印制于中国 2012 年 12 月 ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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