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- 慕浦 虞
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1 Dominic Foley Michelle Wills 和 Lisa Calton 沃特世公司 ( 英国威姆斯洛 ) 应用优势 优化分析灵敏度, 准确定量低生理浓度的类固醇 通过去除干扰物有效提升分析选择性, 进而改善重现性 利用多孔板实现自动化, 提高 LC-MS/MS 分析的样品通量 简介睾酮 雄烯二酮和硫酸脱氢表雄酮 (DHEAS) 是属于雄激素的类固醇激素, 与性别特征的调节有关 通过 LC-MS/MS 分析这些结构相似的类固醇激素时, 可以从三个层面提升分析的选择性 : 样品制备过程 液相色谱分离和采用多反应监测 (MRM) 进行的质谱检测 我们之前已经开发了一种采用 Oasis MAX µelution SPE 板的高选择性样品制备方法, 该方法能够使睾酮和雄烯二酮分析达到出色的灵敏度 1 然而, 随着目标分析物 DHEAS 的加入, 这种 SPE 方法不再适用, 因为它会通过阴离子交换机制不可逆地键合 DHEAS 因此, 我们需要更适用于该组类固醇的样品制备方案 本文介绍了一种使用 Oasis PRiME HLB µelution 板技术从血清中提取睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的临床研究方法, 且该方法已在 Tecan Freedom Evo /4 液体处理器上实现了自动化 该方法使用配备 ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard 预柱和 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱的 ACQUITY UPLC I-Class 系统进行色谱分离, 然后在 Xevo TQD 质谱仪上进行检测 ( 图 1) 此外, 我们还评估了睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的外部质量评估 (EQA) 样品, 目的是评估在临床研究中采用该方法分析睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的偏差与适用性 沃特世解决方案 Oasis PRiME HLB µelution 板 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard 预柱 ACQUITY UPLC I-Class 系统 (FTN) Xevo TQD MassLynx 软件 TargetLynx 应用软件 关键词睾酮, 雄烯二酮,DHEAS,SPE, LC-MS/MS 图 1. Waters ACQUITY UPLC I-Class 系统和 Xevo TQD 1
2 实验 LC 条件 系统 : 进样针 : 3 µl 色谱柱 : ACQUITY UPLC I-Class (FTN) ACQUITY UPLC HSS T3 2.1 x mm, 1.8 µm ( 沃特世部件号 ) 预柱 : ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard 2.1 x mm 1.8 µm ( 沃特世部件号 ) 流动相 A: 水 + 2 mm 醋酸铵 +.1 甲酸 流动相 B: 甲醇 + 2 mm 醋酸铵 +.1 甲酸 洗针液 : 8 甲醇 ( 水溶液 ) 灌注溶剂 : 4 甲醇 ( 水溶液 ) 柱温 : C 进样体积 : 1 µl 流速 :.6 ml/min 梯度 : 见表 1 运行时间 : MS 条件系统 : 分辨率 : 4.7 min Xevo TQD MS1 (.7 FWHM) MS2 (.7 FWHM) 采集模式 : 多反应监测 (MRM) ( 详见表 2) 极性 : 毛细管电压 : ESI 正离子 / 负离子模式.4 kv 离子源温度 : 1 C 脱溶剂气温度 : 4 C 扫描间延迟时间 : 通道间延迟时间 :.1 s.2 s 数据管理带 Targetlynx 应用软件的 MassLynx 软件 4.1 版 样品制备 睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 认证参比溶液及其稳定标记内标购自 Sigma Aldrich( 英国普尔 ) 使用购自 Golden West Biologicals( 加利福尼亚州特曼库拉 ) 的替代基质 MSG4( 经处理的人血清 ) 制备校准品 制备浓度范围为 nmol/l 的睾酮和雄烯二酮校准品, 以及浓度为.2 nmol/l.2 nmol/l 和 3 nmol/l 的质量控制样品 (QC) 制备浓度范围为.14 4 µmol/l 的 DHEAS 校准品, 以及浓度为.41 µmol/l 4.1 µmol/l 和 27 µmol/l 的质量控制样品 睾酮数据除以 3.47(nmol/L 转换为 ng/ml) 雄烯二酮数据除以 3.494(nmol/L 转换为 ng/ml) DHEAS 数据除以 2.716(µmol/L 转换为 µg/ml) 可以将 SI 单位转换为传统的质量单位 样品提取 使用 Tecan Freedom Evo /4 液体处理器提取样品 向 µl 样品中添加 2 µl 28 nmol/l 的睾酮 - 13 C 3 / 雄烯二酮 - 13 C 3 和 1.4 µmol/l 的 DHEAS- 2 H, 并添加 2 µl 甲醇和 µl 水 每次添加试剂之后充分混合样品 在 4 g 下离心样品 min 从每份预处理样品中取 6 µl 上样至 Oasis PRiME HLB µelution 板 ( 沃特世部件号 18682) 的各个孔中, 并在低真空下 ( mbar) 缓慢抽滤样品 接下来, 分别使用 2 µl.1 (v/v) 甲酸的 3 (v/v) 甲醇溶液 ( 水溶液 ) 2 µl.1 (v/v) 氨水的 3 (v/v) 甲醇溶液 ( 水溶液 ) 进行连续清洗 然后, 先后使用 4 µl 甲醇和 µl 水洗脱分析物 方法条件 时间流速 (min) (ml/min) A B 曲线初始.6 4 初始 表 1. 用于分离睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的梯度表 初始条件下的操作背压约为 8 psi 2
3 分析物 ESI 模式 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 驻留时间 (s) 锥孔电压 (kv) 碰撞能量 (ev) 睾酮 ( 定量离子 ) 睾酮 ( 定性离子 ) 睾酮 - 13 C 雄烯二酮 ( 定量离子 ) 雄烯二酮 ( 定性离子 ) 雄烯二酮 - 13 C DHEAS DHEAS- 2 H 表 2. 睾酮 雄烯二酮 DHEAS 及其内标的 MRM 参数 DHEAS 的扫描窗口为 min 睾酮和雄烯二酮的扫描窗口为 min 其它所有时间流动相进入废液 结果 本研究检测了目标分析物本身和八种结构相关化合物 (11- 脱氧皮质醇 21- 脱氧皮质醇 21- 羟基孕酮 17- 羟基孕酮 皮质酮 皮质醇 DHEA 和二氢睾酮 ), 而在睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的保留时间处未观察到干扰物 睾酮及其差向异构体表睾酮实现了基线分离, 证明此色谱柱具有良好的色谱选择性 ( 图 2) 此外, 雄烯二酮 17- 羟基孕酮和 DHEA 与睾酮实现色谱分离十分必要, 因为在 >1 µmol/l 的浓度下, 睾酮的 MRM 谱图中检测到了这些分析物或其同位素 分析高浓度样品之后, 未在后续的空白进样中观察到系统残留污染 高浓度样品中睾酮和雄烯二酮的浓度为 17 nmol/l,dheas 的浓度为 13 µmol/l 通过 1: 稀释成功测定了高浓度样品, 且睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的平均准确度分别为 和 96 皮质醇 m/z > DHEAS m/z > 皮质酮 脱氧皮质醇 雄烯二酮 脱氧皮质醇 m/z > OHP 17- OH P m/z > 97. m/z > 97. m/z > 睾酮表睾酮 m/z > DHEA m/z > DHT m/z > 时间 图 2. ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱对几种类固醇激素 ( 包括睾酮 雄烯二酮和 DHEAS) 的色谱选择性 3
4 分析灵敏度研究结果表明, 该方法可以精确定量 (RSD < 2).17 nmol/l 的睾酮和雄烯二酮, 以及.14 µmol/l 的 DHEAS 在 1 次独立分析中, 所有分析物最低浓度校准标准品的信噪比 (S/N) 均大于 1:1 我们在五天内每天两次提取和定量分析三个浓度的 QC 样品 ( 每个浓度三个重复样,n = 3), 以此确定该方法的总精密度 每个 QC 水平设置三个重复样, 以评估方法的重复性 睾酮和雄烯二酮的低 中 高 QC 浓度分别为.2.2 和 3 nmol/l DHEAS 的低 中 高 QC 浓度分别为 和 27 µmol/l 使用 Tecan Freedom Evo 液体处理器时, 所有分析物的总精密度和重复性均 6.3( 表 3) 分析物 总 QC 精密度 QC 重复性 低 中 高 低 中 高 睾酮 雄烯二酮 DHEAS 表 3. 睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 分析的总精密度和重复性 将不同比例的高浓度和低浓度分析物混合样品进行分析的结果表明, 该方法在.1~76 nmol/l 睾酮.1~74 nmol/l 雄烯二酮和.13~8 µmol/l DHEAS 的浓度范围内呈线性 此外, 在 1 次独立分析中, 加标血清样品的校准曲线呈线性, 且决定系数 (r 2 ) >.998 我们使用来自个人捐献者的血清样品进行了基质效应研究, 对内源性化合物峰面积进行单独定量分析 使用平均内源性峰面积调整后加标样品的结果, 然后将其与溶剂加标样品的结果进行比较 基质因子计算结果如表 4 所示 基于分析物 : 内标响应比率计算的归一化基质因子值与基于峰面积计算的基质因子值相近 分析物 基于分析物峰面积计算的平均基质因子 ( 范围 ) RSD 睾酮 1.2 ( ).9 雄烯二酮 1.2 ( ) 4.6 DHEAS.93 ( ) 6.8 表 4. 基于睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的峰面积计算的平均 ( 范围 ) 基质因子和 RSD 我们选用一组样品 (n = ), 将该方法与专为睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 开发的 LC-MS/MS 方法进行了对比 使用 Analyse-it 2.3 版处理比较数据 Altman-Bland 一致性表明, 睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的平均偏差分别为 和
5 我们分析了 EQA 样品中的睾酮 (n=3) 雄烯二酮和 DHEAS (n=), 然后将所得数据与样品的质谱方法结果进行比较, 并进行 Deming 回归分析 睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的相关性如表 所示, 与 EQA 方案 MS 方法之间表现出优异的一致性 分析所有样品 (~4 µmol/l) 时, 观察到 DHEAS 结果存在比例偏差和常值偏差, 不过,1.2~14.9 µmol/l 范围内的偏差 6.9 Altman-Bland 一致性表明, 睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的平均偏差分别为 -..4 和.8 分析物 Deming 回归方程 比例偏差? 常值偏差? 线性拟合 (r) 睾酮 y =1.1x.2 N N.999 雄烯二酮 y =1.3x.1 Y N.999 DHEAS ( 4 µmol/l) y =1.1x.48 Y Y.996 DHEAS ( 1 µmol/l) y =1.x.9 Y N.996 表. Deming 回归分析, 对比了采用 Waters LC-MS/MS 方法和 EQA 方案 MS 方法分析睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的结果 7 A 4 B 睾酮 (nmol/l)- 沃特世方法 ( x)a 9 CI 带 雄烯二酮 (nmol/l)- 沃特世方法 ( x) 9 CI 带 睾酮 (nmol/l)-eqa 方案 雄烯二酮 (nmol/l)-eqa 方案 4 C 16 D 3 14 DHEAS (µmol/l)- 沃特世方法 ( x) 9 CI 带 DHEAS (µmol/l)- 沃特世方法 ( x) 9 CI 带 DHEAS (µmol/l)-eqa 方案 DHEAS (µmol/l)-eqa 方案 图 3.Deming 回归分析, 对比了采用 Waters LC-MS/MS 方法和 EQA 方案 MS 方法分析 A) 睾酮 B) 雄烯二酮 C)~4 µmol/l DHEAS 和 D) ~1 µmol/l DHEAS 的结果
6 结论本研究为血清样品中睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 的分析开发了一种高灵敏度 高选择性的临床研究方法 此方法仅使用 µl 样品即可在低生理浓度的睾酮 雄烯二酮和 DHEAS 分析中达到足够的分析灵敏度 分析方法的自动化与样品追踪功能相结合, 改进了实验室工作流程并减少了样品处理, 从而有效避免了潜在的操作人员错误 致谢感谢南曼彻斯特大学医院 ( 英国威森肖 ) 临床生物化学系的 Brian Keevil 教授及其同事提供匿名血清样品 参考文献 1. Foley D. and Calton L. A Clinical Research Method for the Analysis of Serum Testosterone and Androstenedione. Waters application note. 21. 部件号 72274EN. 仅供研究使用 不适用于诊断 Waters The Science of What's Possible ACQUITY UPLC Xevo MassLynx 和 Oasis 是沃特世公司的注册商标 TargetLynx 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 21 年沃特世公司 中国印刷 21 年 12 月 724ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 (4)
Dominic Foley 和 Lisa Calton 沃特世公司 ( 英国威姆斯洛 ) 应用优势 通过去除干扰物有效提升分析选择性, 进而改善重现性 优化分析灵敏度, 准确定量低生理浓度的 利用多孔板规格的自动化操作实现高样品通量 简介是一种属于盐皮质激素的类固醇激素, 在调节血压方面发挥着重要作用 过去, 人们一直采用放射免疫分析法来分析 然而, 此类方法需要使用危险的放射性同位素 此外, 由于结构相似的类固醇激素和代谢物会发生交叉反应,
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[ 应用纪要 ] Margaret Maziarz 和 Mark Wrona 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 紫外和 QDa 质谱检测器联用, 加上稳定 快速的 UPLC 方法实现苯磺酸甲酯 乙 酯和异丙酯的高通量分析 采用 ACQUITY QDa 质谱检测器质量数 检测功能对组分进行准确鉴定 使用 ACQUITY QDa 质谱检测器提高基因 毒性杂质监测的灵敏度和选择性 简介
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使用 UPLC-PDA 和 SQD 质谱检测器分析保健食品中的大豆异黄酮 Antonietta Gledhill 沃特世公司, 曼彻斯特, 英国 前言 大豆异黄酮被称为是植物性雌激素, 许多研究表明食用含大豆异黄酮的保健食品如豆奶和豆粉可以预防乳腺癌和前列腺癌, 预防心血管疾病和降低糖尿病和绝经后骨质疏松的发生 已经发现的十二种大豆异黄酮分别为大豆甙元 (De), 黄豆黄素 (Gle), 染料木素
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