[ 应用纪要 ] [ 应用纪要 ] 使用复合模式固相萃取法 (SPE) 去除血浆样本中的 Triton X-100 Jonathan P. Danaceau Erin Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司, 美国马萨诸塞州米尔福德应用优势从血浆中去除 Tr

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樱魏
5 years ago
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1 Jonathan P. Danaceau Erin Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司, 美国马萨诸塞州米尔福德应用优势从血浆中去除 Triton X- 去除早期 PK 研究中与 Triton X- 相关的离子抑制作用无需方法开发, 快捷简易和洁净的样本制备方法引言 Triton X- 等药物赋形剂通常用于制剂药, 以促进其在介质中的溶解度然而, 这些化合物却可引发显著的基质效应, 尤以离子抑制为甚常规药物研发流程中使用的快速 LC 梯度, 又会导致此类化合物和目标分析物的共流出早期药代动力学 (PK) 中, 鉴于这种共流出已被证实是导致离子抑制作用的主要原因, 赋形剂浓度偏高可能会导致严重问题为尽量减小这一问题引发的不良影响, 目前已研究出的 2,3 方法包括 :LC 梯度调节, 分析色谱柱的选择更换 1, 样本制备方法的改变, 样本的稀释 5, 甚至是全新制剂药的开发 4 即便其中部分方法已取得成效, 但每项方法仍存在其局限特性很显然, 分析员通常无法自己选择制剂药赋形剂无论是改变梯度或流动相还是更换不同选择性的色谱柱, 优化 LC 条件能够针对部分分析物解决这一问题, 但它既无法应用到全部分析物, 也需要更多的方法开发作为辅助支持同时, 过多地调节或优化 LC 条件不利于高通量的操作 Oasis 复合模式阳离子交换 (MCX)SPE 法提供了一种快速便捷高效的解决方案碱性分析物通过强阳离子交换作用被吸附在吸附剂中, 而如 Triton 等的非离子型的赋形剂则通过反相机制被吸附, 同时能够在分析物洗脱之前有选择性地被去除沃特世解决方案 Oasis MCX 96 孔板 ACQUITY UPLC BEH C 18 柱关键词赋形剂去除,Triton X- 去除,SPE,LC/MS, ESI, 离子抑制, 基质效应 1

实验结果与讨论样品制备标准品包含醋丁洛尔抗敏安拉贝洛尔美托洛尔咪达挫仑吲哚洛尔这些成分或是在萃取之前加入到血浆样本调整其浓度至 200 ng/ml, 或是后加标至萃取后的空白血浆洗脱液中, 用于回收率的计算萃取前, 在血浆中加入 5mg/mL 浓度的 Triton X-, 也可在萃取后添加至空白血浆洗脱液中, 用于计算回收率 Triton X- 也可后加标至空白血浆洗脱液中,

2 实验结果与讨论样品制备标准品包含醋丁洛尔抗敏安拉贝洛尔美托洛尔咪达挫仑吲哚洛尔这些成分或是在萃取之前加入到血浆样本调整其浓度至 200 ng/ml, 或是后加标至萃取后的空白血浆洗脱液中, 用于回收率的计算萃取前, 在血浆中加入 5mg/mL 浓度的 Triton X-, 也可在萃取后添加至空白血浆洗脱液中, 用于计算回收率 Triton X- 也可后加标至空白血浆洗脱液中, 用于计算赋形剂的基质效应因子样品依照 Oasis MCX 的基本操作流程进行萃取简单来说, 在 0.5 ml 兔血浆中加入 0.5 ml 4% H 3 PO 4 进行酸化 ( 注意 : 本研究中采用的是 0.5 ml 血浆, 采用更小剂量亦可 ) MCX 板在经过 1.0 ml MeOH 和 1.0 ml H 2 O 活化平衡之后, 经酸化的样品被上样到吸附剂上上样后用 1.0 ml 2% 甲酸和 ml MeOH 清洗样品随后用 μl 含 5% NH 4 OH 的 MeOH 溶液进行洗脱后加标 (PS) 样品是在空白兔血浆洗脱液中加入标准品或标准品与 Triton X- 的混合物经萃取的样品则以以下方式制备 : 在未经萃取的血浆中加入 200 ng/ml 标准品或在其基础上再加入 5 mg/ mltriton X- 六种测试化合物的色谱图如图 1 所示标准品 ( 醋丁洛尔抗敏安拉贝洛尔美托洛尔咪达挫仑吲哚洛尔 ) 提取 MH+ 离子的 SIR 如图所示, 除咪达挫仑, 它的 MH+ 离子与 (MH-35)+ 离子合并成一个峰图 2 为 Triton X- 的两个色谱图图中 Triton X- 峰是丰度较大的 Triton 分子离子峰的综合 TIC, 包括以下分子量的 Triton 单峰 : 和 795 A 图显示未经过 SPE 处理的血浆样本中 Triton 含量情况它是将 Triton 后加标至萃取的最终血浆洗脱液中得到的 B 图则为含有 5 mg/mltriton 的血浆样本经标准 MCX 流程萃取得到的, 该图表明血浆样品中几乎全部 Triton X- 都得以去除图 3 显示为实验所用样品组的平均 Triton 峰面积, 如图所示, 采用 MCX 萃取, 超过 99% 的 Triton 得以去除 1.85 Doxylamine 抗敏安 Acebutolol 醋丁洛尔 2.21 Labetalol 拉贝洛尔 Pindolol 吲哚洛尔 2.08 Metoprolol 美托洛尔 2.32 Midazolam 咪达挫仑 min 图 1. 碱性药剂混合物色谱图 Triton X- 去除的回收率依据以下算式得出 : a. 萃取后的血浆样品 Extracted plasma 萃取后添加 Triton Triton added post-extraction % 回收率 =( 萃取样品峰面积 / 后加标样品峰面积 ) % 为进行 Triton X- 去除的相关分析, 样品按照 1:200 的比例在流动相中进行稀释, 以避免高浓度 Triton X- 给质谱仪带来的污染 b. 萃取后的血浆样品 Extracted plasma 萃取前添加 Triton Triton added pre-extraction min 图 2. 5 mg/ml Triton X-- 后加标色谱图和加标样品萃取色谱图 2

3 方法条件 SPE 条件 SPE 板 : Oasis MCX 96 孔板 30 μm(30 mg) 部件号 : 液相色谱条件 Peak 峰面积 Area Average Triton Peak 平均峰面积 Area for Triton N=4 液相色谱系统 : Waters ACQUITY UPLC 系统检测器 : Waters SQD 样品瓶 : 2 ml 96 孔收集板部件号 : 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C μm, mm 色谱柱部件号 : 柱温 : 30 样品温度 : 10 进样量 : 10 μl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A(MPA): 0.1% HCOOH 流动相 B(MPB): 0.1% HCOOH 乙腈初始流动相条件为 95:5 MPA:MPB 持续 0.5 分钟,MPB 在 2.5 分钟之后增至 95% MPB 比例随后降回 5%, 并持续 2 分钟, 重新平衡色谱柱总运行时间 6.0 分钟质谱条件质谱系统 : 电离模式 : 采集模式 : 毛细管电压 : 锥孔电压 : 脱溶剂气体 : 锥孔气流 : Waters SQD (+)ESI SIR 2.5 kv 根据化合物有所区别 ( 针对不同分析物进行优化 ) 700 L/min. 0 L/min. 0 Post 后加标血浆样本 Spike Plasma Samples Triton 萃取前添加 added Pre- Extraction Triton 图 3. 使用 MCX 从血浆中去除 Triton 按照前文方法的方程式计算分析物回收率如图 4 所示, 采用标准 MCX 流程后, 每种分析物的回收率都达到 % 而对这六种分析物而言, 平均回收率则达到 102% 血浆中含有的 5 mg/ml Triton X- 对于分析物回收率并无影响在含有 Triton 的情况下, 平均回收率为 96% Peak 峰面积 Area Average Triton Peak 平均峰面积 Area for Triton 12 N=4 咪达挫仑 Midazolam % 拉贝洛尔 Labetolol 醋丁洛尔 Acebutolol 8 美托洛尔 Metoprolol 6 吲哚洛尔 Pindolol 抗敏安 Doxylamine 4 2 Recovery 不含 Triton in the 的回收率结果 absense of Triton Recovery 含有 Triton in the 的回收率结果 presense of Triton 图 4. 使用 MCX 去除血浆中的 Triton 将 Triton X- 从血浆中去除的主要目的就是为了清除可能引发的离子抑制效应根据 APPS 最新论文 6, 在含有 Triton 的情况下, 使用下列算式计算的所有分析物的基质效应都接近 ( ; 平均值 =0.96) 原因在于, 采用这种方法, 分析物不会与 Triton 发生共流出, 而赋形剂引发的基质效应多半发生于共流出过程中基质效应 =( 含 Triton 的峰响应值 / 不含 Triton 的峰响应值 ) 数据管理软件系统 : MassLynx V4.1 SCN714 和 MS 软件 3

4 因此, 为能鉴定分析物与 Triton 发生共流出时的基质效应, 我们进行了柱后注入标准品的研究简单来说, 将药物混合物与色谱柱洗脱液一同注入 MS 对比每种化合物的目标离子通道, 我们就能评估 Triton X- 对分析物信号强度的影响图 5 所示为该实验范例图 A 显示三种吲哚洛尔的 MH+ 离子通道, 以 10 μl/min 的速度向洗脱液注入浓度为 500 ng/ml 的分析物绿色通道显示萃取前加入药物混合物的血浆样本紫色通道显示萃取前加入药物混合物和 5 mg/mltriton X- 的血浆样本红色通道显示萃取后在样本洗脱液中加入 Triton X- 的样品图 B 显示含有 Triton X- 的后加标样品色谱图以供比对如图所示, 若 Triton 未从样本中去除, 吲哚洛尔 ( 红色通道 ) 显示 80-9 的信号减弱而当使用 MCX 去除 Triton 时 ( 紫色通道 ), 该抑制作用得以去除其他分析物的分析结果相似与 Triton 有关的 50-85% 离子抑制作用都通过 MCX 萃取去除最重要的是, 图 2 和 3 所示的数据, 显示 MCX 不仅能够从血浆样本中去除 99% 的 Triton, 也能在含有 Triton 的情况下完全去除其离子抑制作用 a. 萃取后加入 Triton added Triton post extraction 萃取前加入 Triton added Triton pre-extraction 未加入 No Triton Triton( added 纯血浆 (plasma ) only) b. Triton X- Significant 显著信号抑制 signal suppression min 图 5. 去除 Triton 的离子抑制作用 ( 吲哚洛尔 ) 4

5 结论 Oasis MCX 96 孔板提供了一种用于去除血浆样品中高浓度 Triton X- 的简便快捷高效的方法, 从而消除早期药代动力学研究中常见的基质效应 ( 通常是离子抑制效应 ) 此外, 该解决方案无需进行色谱分析方法的再开发样品的稀释及其他费时费力的流程即可成功解决上述问题, 这使得整个解决方案广泛适用于高通量分析的应用参考文献 1. Tong X, Wang J, Zheng S, Pivnichny J, Griffin P, Shen X, Donnelly M, Vakerich K, Nunes C, and Fenyk-Melody J., Effect of signal interference from dosing excipients on pharmacokinetic screening of drug candidates by liquid chromatography/mass spectrometry, Anal Chem : Weaver R and Riley R., Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400, Rapid Comm Mass Spec : Shou W and Naidong W., Post-column infusion stude of the dosing vehicle effect in the liquid chromatography/tandem mass spectrometric analysis of discovery pharmacokinetic samples, Rapid Comm. Mass Spec : Temesi D, Law B, and Howe N., Synthesis and evaluation of PEG414, a novel formulating agent that avoids analytical problems associated with polydispersive vehicles such as PEG400, J. Pharmaceutical Sciences (12): Larger P, Breda M, Fraier D, Hughes H, and James C., Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis, J. Pharm. Biomed. Anal : Bansal S and DeStefano A., Key elements of bioanalytical method development validation for small molecules, The AAPS Journal (1):E109-E114. Waters The Science of What s Possible Oasis ACQUITY UPLC 和 MssLynx 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2011 年沃特世公司印制于中国 2011 年 10 月 ZH LS-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ [ 应用纪要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝刚苏州市食品药品检验所, 苏州 15104 关键词超高效液相色谱 - 质谱, 多反应监测, 减肥类保健食品非法添加, 快速定性定量

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