MS 条件 MS 系统 : Waters ACQUITY TQD 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 2.5 kv 锥孔电压 : 24 V 脱溶剂气温度 : 400 C 脱溶剂气流量 : 900 L/h 源温度 : 120 C 碰撞气流速 : 7.10 x 10-3 mbar 化合物 MRM 驻

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1 Lisa J Calton, Scott D Gillingwater, Gareth W Hammond, Donald P Cooper 沃特世公司临床业务部 ( 英国曼彻斯特阿特拉斯商业园 ) 实验将 Waters ACQUITY 串联四极杆检测器 (TQD) 与 ACQUITY UPLC 联用以进行各项分析 完整的系统配置如图 1 所示 仪器通过 MassLynx 4.1 软件在电喷雾正离子模式下运行, 并采用 QuanLynx 应用软件自动进行数据处理 对锥孔电压进行优化, 使得进入离子源的母离子的丰度最大化, 并通过第一级四极杆选择相应的母离子进入碰撞池 利用氩气和碰撞能量促使碰撞诱导解离, 生成特征性产物离子 利用此方法建立特异的多重反应监测 (MRM), 实验如表 1 所示 LC 条件 LC 系统 : Waters ACQUITY UPLC 系统色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C 8, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm 柱温 : 45 C 流速 : 400 μl/min 流动相 A: 2 mm 醋酸铵 + 0.1% 甲酸的水溶液流动相 B: 2 mm 醋酸铵 + 0.1% 甲酸的甲醇溶液梯度 : 流动相 B 在 7 3% 保持 2 min, 在 1.5 min 内从 73% 增加至 98% 简介临床研究表明 : 维生素 D 缺乏症在世界许多地区的成人和儿童中非常普遍 除了众所周知的影响 ( 例如与钙吸收障碍相关的佝偻病 骨质疏松症和骨软化症 ) 外, 现在越来越多的证据表明维生素 D 缺乏症还会增加罹患某些 1,2 癌症的风险, 并对许多其它疾病有一定的影响 维生素 D 具有两种存在形式, 一种是皮肤暴露于日光下所产生的维生素 D 3 (D3), 另一种则是存在于多种补品中的植物衍生物 维生素 D 2 (D2) 维生素 D 在肝脏中代谢形成 25- 羟基维生素 D [25OHD], 后者在肾脏中进一步代谢形成活性代谢物 1,25- 二羟基维生素 D 25OHD 的水平被认为是评价体内维生素 D 水平的最佳临床指标 3 维生素 D 水平的评估对于维生素 D 缺乏症的诊断和补充治疗的监测非常重要 最近, 相对于竞争性结合检测 免疫检测和 HPLC 法等其它方法, 利用 LC/MS/MS 方法定量分析 25OHD2 和 25OHD3 在提高检测质量和降低成本方面, 更加受到人们的青睐 免疫检测的主要问题是无法区分 25OHD2 和 25OHD3, 还需依靠抗体与 25OHD2 的交叉反应才能测定 25OHD 的总浓度 如果该交叉反应低于 100%, 那么 D2 治疗可能无法得到准确监测 4 图 1. 沃特世 ACQUITY UPLC/TQD 的系统配置 1

2 MS 条件 MS 系统 : Waters ACQUITY TQD 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 2.5 kv 锥孔电压 : 24 V 脱溶剂气温度 : 400 C 脱溶剂气流量 : 900 L/h 源温度 : 120 C 碰撞气流速 : 7.10 x 10-3 mbar 化合物 MRM 驻留时间 (s) 碰撞电压 (V) 锥孔能量 (ev) 25OHD > OHD* > d6-25ohd > D > D2* > 表 1. 监测 25OHD2 25OHD3 和内标时使用的调谐参数 * 表示可选的定性离子 校准品和 QC 标准品 按照各个生产厂家的说明制备单一浓度的校准品和双浓度水平的 QC 标准 品 (Chromsystem, 德国慕尼黑 ) 通过混合人血清并加入已知浓度的 25OHD2 和 25OHD3, 制备低浓度 QC 标准品溶液 低 中和高浓度 QC 样品中 25OHD2 的最终浓度分别为 和 84 ng/ml,25ohd3 的最终浓度则分别为 和 89 ng/ml 使用哺乳动物血清制备校准品用以线性评估, 其中 25OHD2 和 25OHD3 的浓度范围为 ng/ml 在 264 nm 下检测储备液, 然后将其调整 至最终浓度 样品制备吸取血清 (150 μl) 至 2 ml 微量离心管 (Anachem) 中, 加入 10 μl 内标 (250 ng/ml 六氘代 25OHD3, 合成 AS, 以 80% 甲醇 / 20% IPA 为溶剂 ), 涡旋混合 ( 10 s) 加入 0.2 M ZnSO 4 溶液 (150 μl) 并涡旋混合 (10 s) 以增强反应 加入甲醇 ( 300 μl) 并混合 (10 s), 以沉淀血清中存在的蛋白质 加入己烷 (750 μl), 用以提取 25OHD 混合 30 s, 然后将样品在 rpm 下离心 5 min 移取己烷层并将其置于沃特世最大回收样品瓶中, 在 50 C 的氮气下蒸发至干 将样品复溶于 75 μl 70% 甲醇水溶液中, 借助 ACQUITY 样品管理器的预加载功能将 20 μl 样品注入 UPLC/MS/MS 系统中, 进样间隔时间为 6 min 离子抑制 将人血清样品混合低浓度的 25OHD2 和 25OHD3 并使用柱后添加对其进行分 析, 以 100 ng/ml 浓度和 10 μl/min 流速通过 ACQUITY TQD 集成式样品流路 2

3 结果线性使用 QuanLynx 定量软件和 ApexTrack 积分算法进行数据处理 以 ng/ml 的浓度范围内向血清中加入已知浓度的 25OHD2 和 25OHD3, 对分析方法的线性进行考察 25OHD3 的确定系数 (R2)>0.999( 图 2), 计算所得的校准品浓度均在指定值的 ±4% 范围之内 25OHD2 的确定系数 (R2)>0.997( 图 3), 计算所得的校准品浓度均在指定值的 ±10% 范围之内 7.00 化合物名称 :25OHD3 相关系数 :r = ,r2 = 校准曲线 : * x 曲线类型 : 线性, 原点 : 排除, 加权 :1/x, 轴转 : 无 响应 ng/ml 图 2. 血清中 25OHD3 的校准曲线 18.0 化合物名称 :25OHD2 相关系数 :r = ,r2 = 校准曲线 : * x 曲线类型 : 线性, 原点 : 排除, 加权 :1/x, 轴转 : 无 响应 ng/ml 图 3. 血清中 D2 的校准曲线 3

4 准确度通过分析购自 DEQAS( 的外部质量控制样品考察分析方法的准确性 利用 Chromsystem 单点校准品绘制出一条过零点的校准曲线, 用以计算 DEQAS 样品浓度 采用 Passing-Bablok 线性回归 (Microsoft Office Excel 2003, 带 Analyse-It 插件 1.73 版 ) 将 Waters 25OHD3 的结果与通过 DEQAS LC/MS 方法所得的结果平均值进行对比 所有结果均在预期值的 ±11.5% 偏差范围之内 ( 图 4) 45 Passing & Bablok 拟合散点图 Waters D 鉴别 Passing & Bablok (I) 拟 ( x) 95% CI bands DEQAS D3 图 4. 将 Waters 25OHD3 结果与 DEQAS LC/MS 方法所得的结果平均值进行对比的 Passing- Bablok 线性回归分析 精度 通过提取低 中和高浓度的 QC 样品并重复分析 5 次以测定批内精度 根据这三个浓度水平计算 25OHD 的变异系数 (CV) 对低 中和高浓度的 QC 样品进行连续 5 天的分析, 测定批间精度 结果如表 2 所示 批内精度 CV% 批间精度 CV% D2 低浓度 QC 中浓度 QC 高浓度 QC D3 D2 D3 D2 D 表 2. 检测的批内和批间精度汇总 4

5 % Time 灵敏度提取所得的最低浓度内部血清校准品的色谱图如图 5 所示 各色谱图标记了化合物名称 峰间信噪比 (SNR) 和浓度 所有响应均高于检测限 (SNR 5:1), 因此, 本方法可检出维生素 D 严重缺乏症患者的维生素 D 水平 (<6 ng/ml) S/N:PtP= > e4 D2 8ng/mL % % S/N:PtP= > e3 D3 4ng/mL Time 图 5. 色谱图显示了最低浓度校 准品和各个分析物的信噪比 测定结果 离子抑制 离子抑制研究表明 25OHD3 在离子抑制区域部分洗脱, 如图 6 所示 100 D3 D2 D3 D % 图 6.25OHD 离子抑制分析, 通 Time 过放大视图显示了 25OHD2 和 25OHD3 的洗脱分析结果 需使用一种稳定同位素标记内标物来补偿所观测到的各个分析物之间的基质效应差异 5 5

6 讨论本文中开发了一种利用 UPLC/MS/MS 分析血清中 25OHD2 和 25OHD3 的方法 该方法通过从血清中进行液 - 液萃取以及利用定性和定量离子进行各个分析物定量检测 此外, 通过监测定性离子比率提高了准确识别分析物的可靠性 测定结果表明, 本方法具有良好的灵敏度以及批内和批间精密度 采用本方法, 可以每天分析多达 100 个样品 结论本文中开发的分析血清中 25OHD2 和 25OHD3 的方法具有良好的线性 灵敏度和精度 本方法与传统的免疫测定法相比, 可提供更加可靠的结果 UPLC/MS/MS 能够准确可靠地测定血清中的 25OHD2 和 25OHD3, 防止误报接受 D2 补充治疗的患者体内的维生素 D 总体浓度 参考文献 1. Gorham ED, Garland CF, Garland FC, Grant WB, Mohr SB, Lipkin M, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32: Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol 2007;103: Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press, Washington, DC; Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, July 2004, 89(7): Viswanathan CT. et al. Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. Pharmaceutical Research 2007; 24(10): Waters ACQUITY UPLC ACQUITY UPLC MassLynx 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 TargetLynx 和 QuanLynx 是是沃特世公司的商标, 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2008 年沃特世公司 2008 年 10 月 ZH KK-PDF 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 沃特斯中国有限公司香港 : 免费售后服务热线 : 800 (400)

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