实验使用 QuEChERS 盐包提取,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化, 开发了检测谷物样品中 15 种真菌毒素的方法 采用 UPLC 快速分离,Xevo TQ-S 串联四极杆质谱检测, 外标法定量, 测试加标样品 各化合物回收率 重现性均满足定量测试要求 该方法简单 快速 准

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1 [ 应用纪要 ] 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法 黄德凤 高丹怡和王欣玲沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 应用优势 样品处理使用 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱, 成本远低于目前普遍采用的免疫亲和柱 快速, 高灵敏的 UPLC /MSMS 分析方法, 同时测定 15 种真菌毒素, 极大的提高试验室的通量 简介应用背景霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的存在于动物食品或其他人类消费的食品上的有毒化合物, 摄取的食物中即使仅含十亿分之一浓度的霉菌毒素也有可能引发严重疾病 因此, 我们需要灵敏可靠的分析方法来测定食品和饲料中的霉菌毒素 下文简要介绍了一些重要的霉菌毒素种类, 图 1 展示了一些重要霉菌毒素的结构 Quanpedia 数据库里包含的 LC-MS/MS 方 法, 可以直接调用 省去方法开发的成本和 时间 黄曲霉毒素 B1 玉米赤霉烯酮 脱氧雪腐镰刀菌烯 赭曲霉毒素 A 伏马菌素 B2 图 1. 一些重要的真菌毒素 本应用建立了一种基于 QuEChERS 提取 Oasis PRiME HLB 过滤净化样品 LC- MS/MS 测定的玉米及大米中的 15 种霉菌毒素同时检测的方法 测试了玉米粉和大米粉中的以上霉菌毒素的加标回收率 重现性结果, 对于大多数化合物 ( 包括黄曲霉毒素 伏马菌素 赭曲霉毒素 单端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮等 ), 所实验的两种基质均可获得良好乃至出色的回收率 结果表明, 推荐的 Oasis PRiME HLB 能够有效降低样品的基质效应, 获得准确的检出结果 沃特世解决方案配 Xevo TQ-S 串联四极杆质谱 ACQUITY UPLC I-Class 系统 AQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl 色谱柱 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱 关键词谷物 真菌毒素 Oasis PRiME HLB UPLC-MS/MS Quanpedia 1

2 实验使用 QuEChERS 盐包提取,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化, 开发了检测谷物样品中 15 种真菌毒素的方法 采用 UPLC 快速分离,Xevo TQ-S 串联四极杆质谱检测, 外标法定量, 测试加标样品 各化合物回收率 重现性均满足定量测试要求 该方法简单 快速 准确, 适合谷类样品中多种真菌毒素的测试 试验方法创建仪器方法 样品制备方法提取 : 取市购大米粉及玉米粉, 称取 5.00 g 样品加入 50 ml 离心管中 ( 对于加标样品, 加入所需标准溶液 ) 加入 10 ml 水充分浸润之后, 再加入 10 ml 的 10:90 甲酸 / 乙腈, 充分振荡, 旋涡 加入 QuEChERS 盐包 (CEN 的 DisQuE 提取盐包, 部件号 ) 用手大力振荡 1 分钟, 在 转 / 分钟的速度下离心 5 分钟 净化 : 准备 Oasis PRiME HLB 小柱 (6 cc,200 mg 规格, 部件号 : ), 无需活化平衡, 吸取 1 ml 样品提取液直接加入 SPE 小柱, 待流干后加入 0.5 ml 乙腈洗脱, 收集全部流出液 溶剂转换 : 流出液在 40 C 下氮气吹至近干,40% 甲醇水溶液定容到 1 ml, 过 0.2 µm 滤膜, 上 LC-MS/MS 测试 UPLC 条件 系统 : Waters ACQUITY UPLC I-class FTN; 色谱柱 : ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl, 2.1 x 100 mm,1.7 µm; 流动相 A: 水 (0.1% 甲酸 ) 流动相 B: 乙腈 (0.1% 甲酸 ); 方法优化色谱分离 15 种真菌毒素化合物中,3- 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇和 15- 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇是同分异构体, 在 MRM 采集通道中会相互干扰, 因此需要进行色谱分离 本实验采用 ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl 色谱柱能够有效分离各真菌毒素及同分异构体 Wash 溶液 : 50% 甲醇水溶液 ; Purge 溶液 : 10% 甲醇水溶液 ; 流动相梯度洗脱程序 : Time (min) Flow (ml/min) A% B% Curve initial initial test_039 test_039 10:MRM of 2 Channels ES+ TIC(15-DON) 2.06e6 9:MRM of 2 Channels ES+ TIC(3-DON) 2.15e6 色谱柱温度 : 40 C MS 条件系统 : 离子化方式 : 监测方式 : 喷雾电压 : 离子源温度 : Xevo TQ-S 多反应监测 (MRM) 3.0kV 550 C 图 2. 同分异构体 3-DON 和 15-DON 的分离 2 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法

3 15:MRM of 2 Channels ES+ TIC(FB1) 3.27e6 14:MRM of 2 Channels ES+ TIC(FB2) 3.82e6 13:MRM of 2 Channels ES+ TIC(T-2 Toxin) 1.46e5 12:MRM of 2 Channels ES+ TIC(HT-2 Toxin) 2.64e4 11:MRM of 2 Channels ES+ TIC(OTA) 1.83e5 10:MRM of 2 Channels ES+ TIC(15-DON) 3.37e5 9:MRM of 2 Channels ES+ TIC(3-DON) 3.96e5 8:MRM of 2 Channels ES+ TIC(AFG2) 7.06e4 7:MRM of 2 Channels ES+ TIC(AFG1) 1.16e5 6:MRM of 2 Channels ES+ TIC(ST) 1.28e5 5:MRM of 2 Channels ES+ TIC(ZEN) 1.63e5 4:MRM of 2 Channels ES+ TIC(AFB2) 1.49e5 3:MRM of 2 Channels ES+ TIC(Nivalenol) 2.66e4 2:MRM of 2 Channels ES+ TIC(AFB1) 1.58e5 1:MRM of 2 Channels ES+ TIC(DON) 2.67e5 图 种真菌毒素分离色谱图 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法 3

4 UPLC-MS/MS 方法 图 种真菌毒素 MS 方法来自 Quanpedia 数据库 Quanpedia 库是一个包含了真菌毒素在内的定量方法数据库 通过 Run Sample 的方式,Quanpedia 库可以 自动生成真菌毒素的数据采集方法 (MS 方法 ) 液相方法 (UPLC 方法 ) 和数据处理方法 ( 定量方法 ) 每种化合 物选取两对离子 化合物名称 缩写 母离子 (m/z) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 黄曲霉毒素 B 1 AFB 雪腐镰刀菌烯醇 NIV 黄曲霉毒素 B 2 AFB 玉米赤霉烯酮 ZEN 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇 3-ADON 杂色曲霉素 ST 黄曲霉毒素 G 1 AFG 黄曲霉毒素 G 2 AFG 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇 15-ADON 赭曲霉毒素 A OTA HT2 毒素 HT T2 毒素 T 伏马菌素 B 2 FB 伏马菌素 B 1 FB 锥孔电压 (v) 子离子 (m/z) 碰撞能量 (v) 离子化模式 表 1. 各真菌毒素化合物 MRM 条件 4 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法

5 样品制备提取 本实验采用 QuEChERS 盐包提取 (CEN 的 DisQuE 提取盐包, 部件号 ), 为了平衡各种真菌毒素的提取效率, 萃取溶液选择了 10:90 的甲酸 / 乙腈溶液 样品是谷物类的干燥粉末, 在萃取之前需要加水完全浸润 同时, 基于 QuEChERS 方法的萃取原理, 样品需要加入和萃取试剂等量的水 因此, 本方法在称取样品之后, 需要加入 10 ml 的水充分浸润样品 净化 采用 Oasis PRiME HLB 通过式策略净化样品, 目标物无保留的通过 SPE, 基质干扰物被保留在 SPE 小柱上 通过对比测试 SPE 净化前后样品中的基质干扰代表物质 磷脂的含量, 可以清楚的看出 Oasis PRiME HLB 具有非常好的净化效果 test_181 样品通过 Oasis PRiME HLB 净化 Parents of 184 ES+ TIC 2.95e7 test_161 Parents of 184 ES+ TIC 4.41e7 QuEChERS 提取液直接进样 图 5. PRiME HLB 净化前后磷脂含量 因为 SPE 小柱有一定的滞留体积, 因此需要在样品流干之后, 加入 0.5mL 的乙腈溶液将滞留在 Oasis PRiME HLB 小柱中的滞留溶液洗脱下来 复溶净化后的样品溶液中含有高比例乙腈, 直接上 LC 测试会出现比较大的溶剂效应 因此需要对样品净化液进行溶剂转换 将洗脱下来的样品溶液置于氮气下吹干, 注意控制温度应不高于 40 C, 流量应不得将液面吹的飞溅 选取不同的溶剂来复溶样品对回收率的影响很大, 特别是极性较小的真菌毒素如 :ZEN ST OTA 等, 需要较高比例的有机相才能完全溶解 实验中比较了不同比例的甲醇水溶液及乙腈水溶液来复溶样品 通过对比回收率数据, 最终选取了溶剂效应最小, 溶解性最好的 40% 甲醇水溶液作为复溶溶剂 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法 5

6 图 6. 不同溶剂进行复溶时的回收率对比 方法回收率及稳定性 取市售大米粉及玉米粉进行添加回收率测定 分别添加高 中 低 3 个浓度水平, 按所建立的方法进行样品处 理及测定, 每个浓度水平进行 3 次重复测定 外标法定量, 空白基质溶液配制标准曲线 6 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法

7 化合物名称 缩写 保留时间 ( 分钟 ) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 1.63 黄曲霉毒素 B 1 AFB 雪腐镰刀菌烯醇 NIV 1.14 黄曲霉毒素 B 2 AFB 玉米赤霉烯酮 ZEN 6.92 杂色曲霉素 ST 3.4 黄曲霉毒素 G 1 AFG 黄曲霉毒素 G 2 AFG 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇 3-ADON 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇 15-ADON 3.28 赭曲霉毒素 A OTA 7.62 HT2 毒素 HT T2 毒素 T 伏马菌素 B 2 FB 伏马菌素 B 1 FB 1 4. 加标浓度 (µg/kg) 回收率平均值 (%) 大米 RSD(%) n= 回收率平均值 (%) 玉米 RSD(%) n= 表 2. 样品加标回收率和精密度 谷物中多种霉菌毒素残留 UPLC-MSMS 测定方法 7

8 结论 QuEChers 提取后经过 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱净化, 可以在有效去 除基质中的磷脂等干扰物的同时又能保证待测物较高的回收率 本实验尝试了多款色谱柱, 最终选择使用能够有效分离 15 种真菌毒素尤其是 同分异构体 3- 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇和 15- 乙酰脱氧瓜萎镰菌醇的 ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl 色谱柱 快速的前处理结合高灵敏的 UPLC/MSMS 分析方法同时测定 15 种真菌毒素, 极大的降低了实验室的成本, 而且还可以大大提高通量 Quanpedia 数据库里包含的 LC-MS/MS 方法, 可以直接调用 省去方法开发 的成本和时间 扫一扫, 关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 沃特世公司 Waters 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 2016 年 10 月 免费售后服务热线 :800 (400)

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