ZH_Simul Analysis of Intact Human Insulin

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雍山
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无需消化即可进行定量分析高效利用资产, 允许使用现有 LC/MS 仪器沃特世解决方案基于 2D 技术的 ACQUITY UPLC I-Class 系统 CORTECS UPLC C18 色谱柱 Oasis MAX 96 孔 µelution 板 Xevo TQ-S 质谱仪简介胰岛素可能是最知名的, 同时也是最早应用的多肽治疗药物之一多种长效和速效类似物被开发出来,

1 使用 Elution SPE 和 CORTECS UPLC 色谱柱同时分析人血浆中的完整人胰岛素和五种类似物 Erin E. Chambers 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 CORTECS UPLC 色谱柱可获得前所未有的高灵敏度和极窄的峰宽可进行选择性快速提取, 无需耗费时间进行亲和纯化定量准确 ; 精确度超越传统 LBA 方法高灵敏度高特异性, 能够区分人胰岛素和赖脯胰岛素可对人胰岛素甘精胰岛素赖脯胰岛素门冬胰岛素谷赖胰岛素和地特胰岛素进行同步定量无需消化即可进行定量分析高效利用资产, 允许使用现有 LC/MS 仪器沃特世解决方案基于 2D 技术的 ACQUITY UPLC I-Class 系统 CORTECS UPLC C18 色谱柱 Oasis MAX 96 孔 µelution 板 Xevo TQ-S 质谱仪简介胰岛素可能是最知名的, 同时也是最早应用的多肽治疗药物之一多种长效和速效类似物被开发出来, 作为控制糖尿病的处方用药以往, 胰岛素等生物制剂的定量分析都是通过配体结合试验 (LBAs) 进行, 例如 ELISA 而 LC/MS/MS 相比 LBA 具有一定优势, 例如开发时间更短准确度和精度更高多元用途无交叉反应性, 易于区分高度相似的胰岛素由于离子化效率低质谱灵敏度低, 且由于存在多个稳定二硫键碎片离子少, 所以 LC/MS/MS 分析完整胰岛素尤为困难此外, 胰岛素及其类似物非特性结合和溶解度差的特点均增加了 LC 和样品制备方法开发的难度现有的少数几种 LC/MS/MS 方法中, 大多都需要进行费时的免疫亲和纯化和 / 或纳米流 LC 对于定量分析胰岛素而言, 区分人胰岛素和赖脯胰岛素 ( 优泌乐 ) 是一个非常特殊的挑战, 因为它们之间的区别只是两个氨基酸的位置进行了互换仅有一个低分子量的碎片才能区分两者, 使得选择性的样品制备和色谱分析变得十分关键在本次研究中, 利用混合模式固相萃取 (SPE) 和表面带有少量正电荷的高效实心核颗粒色谱柱, 在消除干扰的同时提高了定量分析的灵敏度此外, 选择性研究结果表明, 较高的人胰岛素水平 ( 例如 II 型糖尿病患者可能出现的情况 ) 并不会干扰赖脯胰岛素或其他任何类似物的定量分析本文提供了一种可以对人血浆中完整人胰岛素和多种胰岛素类似物进行同步直接定量的简便方法 ( 图 1), 可实现 50 到 200pg/mL 的 LOD 标准曲线中各点的平均准确度为 99% 到 % QC 样品的平均日间和日内准确度分别为 98% 和 94% QC 样品的平均日间和日内精度分别为 7.5% 和 5.3% 对所有类似物在六种人血浆源中的基质效应进行了计算, 结果表明变异系数均小于 15%, 进一步证明了该方法的选择性 MassLynx 软件关键词非特异性结合, 大肽段,Oasis, 样品制备, 生物分析, 定量, 胰岛素, 甘精胰岛素, 赖脯胰岛素,UPLC, CORTECS, 血浆 1

2 实验样品制备第 1 步 : 蛋白沉淀 (PPT) 向 250 µl 人血浆中加入 25 µl 牛胰岛素 ( 内标, 最终浓度为 10 ng/ml) 并混合用 250 µl 含有 1% 乙酸的甲醇 / 乙腈 (1:1) 混合液对样品进行沉淀, 然后在 13000rcf 下离心 10 min 将上清液转移至盛有 900 µl 浓度为 5% 的 NH4OH 水溶液 ( 体积比 ) 的 2 ml 96 孔板中, 使其充分混合人胰岛素优泌乐 ( 赖脯胰岛素 ) 胰岛素 A 链胰岛素 B 链胰岛素 A 链胰岛素 B 链第 2 步 : 使用 Oasis MAX µelution 96 孔板进行 SPE 调整 : 200 µl 甲醇平衡 : 200 µl 水上样 : 将稀释后的 PPT 上清液分两次上样, 每次大约 700 µl 清洗 : 200 µl 5% NH4OH 水溶液清洗 : 200 µl 5% 甲醇 +1% 乙酸洗脱 : 2 x 25 µl 60:30:10 甲醇 / 水 / 乙酸稀释 : 50 µl 水进样 : 30 µl 来得时 ( 甘精胰岛素 ) 诺和乐 ( 门冬胰岛素 ) 胰岛素 A 链胰岛素 B 链胰岛素 A 链胰岛素 B 链诺和平 ( 地特胰岛素 ) 胰岛素 A 链胰岛素 B 链艾倍得 ( 谷赖胰岛素 ) 胰岛素 A 链胰岛素 B 链图 1. 本次定量分析应用中人胰岛素和胰岛素类似物的结构 2

3 UPLC 条件系统 : 基于 2D 技术的 ACQUITY UPLC I-Class 系统, 配置为柱上稀释, 捕集和反向洗脱分析柱 : CORTECS UPLC C µm, 2.1 x 50 mm( 部件号 ) 捕集柱 : XBridge C18 IS 3.5 µm, 2.1 x 20 mm( 部件号 ) 洗脱流动相 A: 0.1% HCOOH 水溶液洗脱流动相 B: 0.1% HCOOH 乙腈溶液上样溶剂 : 流动相 A:B 为 85:15; 前 2 分钟为 0.1 ml/min, 反转阀, 然后用从 4 逐渐增加到 9 的流动相 B 清洗捕集柱稀释溶剂 : % 流动相 A,0.3 ml/min( 前 2 分钟 ) 阀位置 : 初始位置 1( 正向加载捕集 ),2 分钟时转至位置 2( 反向洗脱到分析柱上 ), 6.5 分钟时返回位置 1 梯度 : 加载 2 分钟 ; 切换阀, 从捕集柱反向洗脱至分析柱, 流动相在 4 分钟内以线性梯度从 15% 增加至 4 洗脱流速 : 0.25 ml/min 柱温 : 60 C 样品温度 : 15 C 进样体积 : 30 µl 运行时间 : 8.5 min 收集板 : Waters 1-mL ACQUITY 收集板 MS 条件质谱仪 : Xevo TQ-S 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 3.0 kv 脱溶剂气温度 : 600 锥孔气体流速 : 150 L/h 脱溶剂气流速 : 0 L/h 碰撞室压力 : 3.8 X 10 (-3) mbar 碰撞能量 : 按组分优化, 见表 1 锥孔电压 : 按组分优化, 见表 1 特定胰岛素数据管理色谱软件 : 定量软件 : MRM 通道 MassLynx TargetLynx 锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 离子类型甘精胰岛素赖脯胰岛素地特胰岛素 y2 门冬胰岛素 y11 谷赖胰岛素牛胰岛素 (IS) 人胰岛素表 1. 人胰岛素胰岛素类似物和内标牛胰岛素 ( 内标 ) 的 MS 条件 3

4 结果与讨论质谱分析对每种类似物的几种多电荷母离子进行观察, 通常选择其中最丰富的两种进行 CID, 在方法开发过程中对一种或两种诊断碎片进行监测图 2A 和 2B 所示为在选择用于定量的初始通道最佳碰撞能量下的代表性 MS/MS 谱图某些情况下, 会有比最终选择的强度更高的 MRM 通道存在具体来说, 大多数胰岛素都会产生强度很高的亚胺离子碎片例如, 甘精胰岛素会在 136 产生酪氨酸亚胺离子碎片然而, 对萃取血浆进行的试验表明, 使用较高的母离子和其碎片离子 ( 表 1) 显著提高了在基质中的特异性, 这比灵敏度的明显差异更为重要 ( 图 3) 相对之前报告过的纳米级色谱分析 - 亲和纯化方案, 这种情况更适合用分析级 LC- 传统 SPE 方法然而, 人胰岛素和赖脯胰岛素只有 B 链中氨基酸 28 和 29 的位置互换 ( 图 1), 这导致它们的碎片离子几乎完全重叠这两种物质的区别仅在于一个低分子量碎片, 人胰岛素的碎片为 226, 而赖脯胰岛素的碎片为 217 ( 图 2B), 均来自于 B 链末端两个氨基酸由于无法基线分离,MS 定量必须依赖于这些非特异性碎片, 因此选择性的样品制备和高效色谱分析十分关键 % 0 谷赖胰岛素的 MSMS % % 0 % 454 地特胰岛素的 MSMS 门冬胰岛素的 MSMS 甘精胰岛素的 MSMS 图 2A. 谷赖胰岛素门冬胰岛素地特胰岛素和甘精胰岛素的 MS/MS 谱图星号表示选择用于定量的碎片 4

5 226 人胰岛素的 MSMS 赖脯胰岛素的 MSMS 图 2B. 人胰岛素和赖脯胰岛素的 5+ 母离子的 MS/MS 谱图星号表示选择用于定量的碎片 > 136 (Lantus) 9.40e ( 酪氨酸亚胺离子 ) 缺乏特异性 : MRM of 4 channels ES+ 867 > 984 (Lantus) 8.97e Time 图 3. 两种不同通道的甘精胰岛素提取离子色谱图使用亚胺离子碎片 ( 上图 ) 与使用较高的母离子和碎片对 ( 下图 ) 相比缺乏特异性 5

6 液相色谱分析较大的肽段和小蛋白 ( 即胰岛素 ) 与小分子不同, 在多孔颗粒中的传质性能较差因此, 使用填充实心核颗粒的色谱柱可以在较高流速下产生生物分析研究需要的更尖锐的峰形 1,2 尤其对胰岛素来说, 有文献报道使用表面带有少量正电荷的颗粒填充的色谱柱得到的峰形和分离度较其他色谱柱更为出色 3 CORTECS C18+ 色谱柱结合实心核颗粒技术和表面少量正电荷, 在此类应用下可以获得新水平的分离性能与目前最先进的全多孔颗粒色谱柱相比, 使用 CORTECS C18+ 获得的胰岛素峰宽度通常为 4.0 到 4.5 秒, 峰面积增大了 2 倍典型色谱图如图 4 所示使用多维色谱有助于通过柱上稀释 (ACD) 技术提高进样体积, 同时利用捕集和反向洗脱策略进一步净化样品结合使用这些色谱系统组件, 可以提高进样体积至 40 µl 而不发生胰岛素流穿在 1D 系统上, 当进样体积 > 10 µl 时就会发生明显的色谱流穿现象 ( 此处不作数据说明 ) 地特胰岛素 RT 5.52 min 谷赖胰岛素 RT 4.29 min 5.26 人胰岛素 RT 4.30 min Time 谷赖胰岛素 RT 4.28 min 甘精胰岛素 RT 4.13 min 门冬胰岛素 RT 4.27 min 牛胰岛素 ( 内标 ) RT 4.23 min Time 表 4. 人胰岛素五种胰岛素类似物和牛胰岛素 ( 内标 ) 的 UPLC/MS/MS 色谱图 6

7 样品制备在 2013 年初发表的一项概念论证性研究中 3, 使用纯反相 SPE 提取四种胰岛素类似物虽然该方法的可行性是显而易见的, 但是人胰岛素和赖脯胰岛素的通道中内源性背景过高, 四种胰岛素的平均 LLOQ 为 200 到 500 pg/ml, 因此不可能对赖脯胰岛素和人胰岛素进行准确的低水平定量和区分本应用介绍了一种选择性显著提高的两步萃取法, 使用蛋白沉淀 (PPT) 预处理步骤和强阴离子交换混合模式 SPE, 有效降低了内源性背景, 同时改善了特异性和检测限在对胰岛素进行蛋白沉淀条件优化的过程中, 对不同的有机溶剂与血浆比例及不同的沉淀溶剂进行了考察采用不同溶剂比 1:1(ACN 或使用下列一种试剂进行改性的 ACN:5% NH4OH, 1% 乙酸或 2% 甲酸 ) 进行蛋白沉淀 (PPT) 时, 六种胰岛素的回收率超过 9, 并且肽自身不沉淀采用更高比例的有机溶剂进行蛋白沉淀时, 由于胰岛素发生沉淀, 导致肽损失 PPT 预处理有效地减少了蛋白质结合, 并降低了来自白蛋白等大分子蛋白的内源性干扰随后, 用浓度为 5% 的 NH4OH 稀释 PPT 上清液, 将 ph 调整为 11 左右在此 ph 值下, 胰岛素及其类似物将带有净负电荷, 这种带电状态使它们在离子交换时可以结合在 Oasis MAX 上年的一项研究表明, 混合模式 SPE( 特别是在离子交换洗脱中 ) 的选择性远远超过纯反相模式具体到本项分析, 对于人胰岛素和赖脯胰岛素, 使用低碎片是必要的, 必须采用选择性最高的样品制备方法将稀释后的上清液加到活化的 SPE 板上, 在碱性 ph 值上样步骤中, 分析物保留在 SPE 吸附剂上为了完全洗脱胰岛素保持溶解性并尽可能减少来自血浆基质的干扰, 必须对洗脱溶液进行优化最佳洗脱溶液是 6 有机溶剂与 1 乙酸最终洗脱液使用等体积的水进行稀释 7

8 线性准确度和精度为了生成标准曲线, 用以下最终浓度的胰岛素混合物对人血浆进行增浓 : 和 00 pg/ml 在人血浆中制备以下浓度的质量控制(QC) 样品 : 和 7500 pg/ml 使用牛胰岛素 ( 最终浓度 10 ng/ml) 作为所有胰岛素的内标 (IS) 对分析物峰面积与 IS 峰之间的峰面积比 (PAR) 进行计算校准曲线在人血浆中制备, 使用标准品的 PAR, 应用单一浓度加权线性回归模型进行构建然后根据 PAR 值对比各自的校准曲线, 计算出所有 QC 样品的浓度所有曲线均为采用 1/x 线性回归表 2 所示为所有胰岛素的标准曲线性能汇总通过 x 轴截距计算确定合并血浆或单个血浆中人胰岛素的本底浓度然后, 将人胰岛素的本底浓度 ( 平均值为 1937 pg/ml) 加上所有标曲和 QC 样品的加标浓度, 以实现准确定量赖脯胰岛素的典型标准曲线如图 5 所示分析物标准曲线浓度范围 pg/ml 标准曲线浓度范围 fmol/ml r 2, 线性拟合, 1/x 加权所有点的平均准确赖脯胰岛素 50-10, 甘精胰岛素 50-10, 人胰岛素 50-10, 地特胰岛素 , 谷赖胰岛素 50-10, 门冬胰岛素 - 10, 表 2. 所有化合物的标准曲线浓度范围 r 2 值和曲线点平均准确度 Compound name: Humalog Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: x Response type: Internal std ( Ref 2 ), Area ( IS conc. / IS area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 10.0 残差浓度 2.00 响应 ,000 浓度图 5. 赖脯胰岛素的典型标准曲线 8

9 对所有 QC 样品的日间 / 日内准确度和精度进行了计算表 3 4 和 5 列出了甘精胰岛素赖脯胰岛素和人胰岛素的典型汇总统计所有其他类似物都表现出相似的数据甘精胰岛素日间 n= 日内 n= 表 3. 甘精胰岛素 QC 样品的日间 / 日内准确度和精度赖脯胰岛素日间 n= 日内 n= 人胰岛素日间 n=9 ( 平均本底浓度为 1937 pg/ml 日内 n=3( 本底浓度为 1872 pg/ml) , 表 4. 赖脯胰岛素 QC 样品的日间 / 日内准确度和精度表 5. 人胰岛素 QC 样品的日间 / 日内准确度和精度 9

10 特异性对所有类似物在六种人血浆源中的基质效应与其变异系数进行了计算,2007 AAPS 白皮书中对此进行了概述 5 地特胰岛素甘精胰岛素门冬胰岛素谷赖胰岛素和赖脯胰岛素的基质效应变异系数分别为和 7.7, 全部符合建议标准, 即变异系数小于 15% 此外, 我们还进行了一项研究来评估高水平人胰岛素 ( 对于 II 型糖尿病患者可能出现的情况 ) 对分析特异性的影响这项研究极为重要, 其原因有两个首先, 并非所有分析物都能通过色谱得到分离其次, 由于使用的是单位分辨率的仪器 ( 三重四级杆 ), 而且类似物自身之间及其与人胰岛素之间具有高度序列同源性, 可能会出现 MS 重叠这项试验中, 血浆样品配制为所有类似物的最终浓度 5 ng/ml 此外, 将这些样品的子集用 200 倍浓度的人胰岛素加标至人胰岛素的最终浓度为 1 µg/ml 然后对所有样品进行预处理萃取和定量人胰岛素浓度较高时, 所有类似物的峰面积都没有发生明显变化结论本方法采用分析级色谱和简单的 96 孔 SPE 样品制备, 获得的完整胰岛素检测限与之前采用免疫沉淀和纳米级色谱的检测限相当 6-11 由于高度的非特异性结合 (NSB) 蛋白结合, 并且在整个 SPE 萃取和洗脱过程中维持肽可溶性也比较困难, 因此该分析方法的开发难度相当高结果证实,SPE 前的样品预处理在提高回收率和特异性方面起到了关键作用使用 1% 乙酸 1:1 乙腈 / 甲醇进行蛋白沉淀的回收率达到 8 到 %, 并且肽本身没有发生沉淀混合模式强阴离子 SPE 增加了一层选择性, 有利于低 MS 碎片的使用, 后者对于区分人胰岛素和赖脯胰岛素是必不可少的与表面带电全多孔色谱柱和传统 C18 实心色谱柱相比, 使用 CORTECS C18+ 色谱柱可以显著改善胰岛素及其类似物的灵敏度和峰形结合正确的 MS 碎片选择, 可以使检测限提高大约两倍而选择性的 SPE 净化可以使六种胰岛素的定量限达到 50 至 200 pg/ml 该方法符合所有有关准确度和精度的 FDA 标准 12 标准曲线点和 QC 样品的平均准确度均大于 92%, 其中大多数接近 99% 所有 QC 样品的日间和日内精度均高于 7.5% 全部六种人血浆的基质效应变异系数均小于 15%, 进一步证明了该方法的选择性 10

11 参考文献 1. Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, Kirkland JJ. Superficially porous silica particles with wide pores for biomacromolecular separations. Journal of Chromatography A. 2012; 1264(0): Kirkland JJ, Schuster SA, Johnson WL, Boyes BE. Fused-Core Particle Technology in High-Performance Liquid Chromatography: An Overview. Journal of Pharmaceutical Analysis Chambers E, Legido-Quigley C, Smith N, Fountain KJ. Development of a fast method for direct analysis of intact synthetic insulins in human plasma: the large peptide challenge. Bioanalysis. 2012; 5(1): Chambers E, Wagrowski-Diehl DM, Lu Z, Mazzeo JR. Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses. Journal of Chromatography B. 2007; 852(1-2): Bansal S, Destefano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. The AAPS Journal. 2007; 9(1):E109-E Thevis M, Thomas A, Delahaut P, Bosseloir A, Schänzer W. Doping Control Analysis of Intact Rapid-Acting Insulin Analogues in Human Urine by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2006; 78(6): Thevis M, Thomas A, Schänzer W. Mass spectrometric determination of insulins and their degradation products in sports drug testing. Mass Spectrometry Reviews. 2008; 27(1): Thevis M, Thomas A, Schänzer W, Östman P, Ojanperä I. Measuring insulin in human vitreous humour using LC-MS/MS. Drug Testing and Analysis. 2012; 4(1): Thomas A, Schänzer W, Delahaut P, Thevis M. Sensitive and fast identification of urinary human, synthetic and animal insulin by means of nano-uplc coupled with high-resolution/high-accuracy mass spectrometry. Drug Testing and Analysis. 2009; 1(5): Thomas A, Schänzer W, Delahaut P, Thevis M. Immunoaffinity purification of peptide hormones prior to liquid chromatography-mass spectrometry in doping controls. Methods. 2012; 56(2): Thomas A, Thevis M, Delahaut P, Bosseloir A, Schänzer W. Mass Spectrometric Identification of Degradation Products of Insulin and Its Long-Acting Analogues in Human Urine for Doping Control Purposes. Analytical Chemistry. 2007; 79(6): Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation Waters ACQUITY UPLC Oasis UPLC ACQUITY Xevo XBridge MassLynx 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 CORTECS IS 和 TargetLynx 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 沃特世公司中国印刷 2013 年 6 月 ZH LL-PDF 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 沃特斯中国有限公司香港 : 免费售后服务热线 : 800 (400)

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材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ [ 应用纪要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝刚苏州市食品药品检验所, 苏州 15104 关键词超高效液相色谱 - 质谱, 多反应监测, 减肥类保健食品非法添加, 快速定性定量