[ 应用纪要 ] [ 应用纪要 ] 法医实验室对全血中的大麻素进行 UPLC/MS/MS 定量分析 Rob Lee 1 Elodie Saussereau 2 Christian Lacroix 2 and Michelle Wood 1 1 沃特世公司 MS 技术中心 ( 英国曼彻斯特 ) 2 J

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1 Rob Lee 1 Elodie Saussereau 2 Christian Lacroix 2 and Michelle Wood 1 1 沃特世公司 MS 技术中心 ( 英国曼彻斯特 ) 2 J Monod 医院 ( 法国勒阿弗尔 ) 应用优势 减少样品体积 免除分析前的衍生化处理步骤 分析运行时间更短 提高样品通量 简介大麻是世界上使用最为广泛的违禁物质, 长期使用可能导致依赖 因此, 大麻素是最常检测的非法药物之一, 对于法医和常规药物检测而言, 大麻素的分析极其重要 Δ-9 四氢大麻酚 (THC) 是大麻植物中主要的精神活性成分 1 THC 可产生一系列代谢物, 包括具有活性的羟基 -THC (THC-OH) 和非活性的羧基 -THC 2,3 (THC-COOH), 这些成分在在血液中循环个体吸食大麻后会被检出 全血中精神活性组分的定量分析结果是判定是否吸食大麻的一个指标, 并且可提供个体在样品采集时伤病状态的信息 此前发布的文献中介绍了在固相萃取 (SPE) 4 或液液萃取 5, 以及柱前衍生之后, 采用 GC/MS 测定全血中大麻素的应用方案 此外, 最近发表的一篇文献中也介绍了采用柱前衍生结合 HPLC/MS/MS 进行此项分析的方法 6 本研究中报道了一种以 SPE 为基础, 然后进行蛋白质沉淀和 UPLC/ MS/MS 分析的定量方法 本方法已经过验证并利用实际样品对其性能进行了评估 研究数据也与 GC/MS/MS 方法取得的结果进行了对比 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC 系统 Xevo TQ-S 质谱仪 ACQUITY UPLC BEH C 18 色谱柱 Oasis MAX SPE 小柱全回收样品瓶 关键词 大麻素, 全血,UPLC /MS/MS 1

2 实验 样品描述 使用 Oasis MAX 进行固相萃取 THC THC-OH THC-COOH (1 mg/ml) 以及用作内标 (ISTD) 的 0.1 mg/ml 氘代 (d-3) 类似物均购自 LGC Standards( 英国特丁顿 ) 浓度为 50 的合并 ISTD 混合溶液用甲醇配制, 并保存在 -20 下 在空白全血样品中加入已知量的大麻素, 制备全血校准品 45 份经预分析确认含大麻素的匿名样品由 J Monod 医院 ( 法国勒阿弗尔 ) 提供 所收集的样品采用氟化钠或肝素锂作为抗凝剂 活化 : 上样 : 清洗 : 干燥 : 洗脱 : 蒸发 : 依次加入 1 ml 甲醇,1 ml 1% 氢氧化铵制备 1 ml 样品 0.5 ml 50% 乙腈在全真空下干燥 10 min 1.5 ml 己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸 (49:49:2 v/v/v) 在 40 的氮气下将样品复溶于 ml 70% 甲醇水溶液中, 涡旋混合, 然后转移至 Waters 全回收样品瓶中 样品制备在取 20 µl ISTD 加入 0.2 ml 全血 ( 样品或校准品 ) 中, 然后滴入 0.4 ml 乙腈进行沉淀, 同时涡旋混合 然后将样品在 4,4000 g 下离心 10 min 将上清液(0.4 ml) 加入 0.6 ml 1% 氢氧化铵中, 并将所得溶液上样至 Oasis MAX SPE 小柱 ( 部件号 ) UPLC 条件 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C 18, 1.7 µm, mm ( 部件号 ) 柱温 : 30 样品温度 : 10 进样体积 : 15 µl (PLNO) 强清洗液 : 甲醇 / 乙腈 / 2- 丙醇 (1:1:1 v/v/v) 弱清洗液 : 50% 甲醇水溶液 流速 : 400 µl/min 流动相 A: 0.1% 甲酸 流动相 B: 乙腈 梯度 : 流动相 B 在 4 min 内以线 性梯度从 60% 增加至 90% 2

3 MS 条件 质谱仪 : Xevo TQ-S 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 : 2.5 kv 锥孔电压 : 25 V 锥孔补偿 : 50 V 脱溶剂气温度 : 550 脱溶剂气 : 900 L/h 锥孔气 : 150 L/h 采集模式 : 多反应监测 (MRM), 请参见表 1 大麻素 保留时间 (min) 母离子 (m/z) 产物离子 (m/z) 碰撞能量 (ev) THC THC-d THC-OH THC-OH-d THC-COOH THC-COOH-d 表 1. 分析物和 ISTD 的保留时间和 MRM 通道, 定量离子通道以粗体表示 数据管理 MassLynx 软件, 结合 TargetLynx TM 应用软件 3

4 结果与讨论 方法验证所有大麻素和 ISTD 的 MRM 通道如表 1 所示 通过两个通道 ( 定量和定性离子 ) 监测分析物 分析物阳性鉴定结果的可接受条件包括保留时间在预期值 0.2 min 之内以及定量 / 定性离子比率在预期比率的 20% 范围之内, 该比率建立在整个校准浓度范围的比率平均值基础之上 ISTD 通过单个通道监测 图 1 显示了加标浓度为 0.5 的全血校准品的色谱图 为了对所有大麻素含量进行线性研究, 分别制备浓度为 和 50.0 的加标全血校准品 先向样品中加入 ISTD, 然后前文所述对样品进行沉淀和萃取, 之后进行 UPLC/MS/MS 分析 通过对每种分析物的 M RM 峰下方面积进行积分, 并参照相应的 IST D 峰面积进行定量 使用 TargetLynx 应用软件处理数据, 然后通过 1/x 加权绘制校准曲线 每种大麻素的日间回归系数 ( 五日评估值 ) 大于 检测限 (LOD) 定义为加标全血中信噪比大于 10:1( 对于全部两个通道而言 ) 的最低浓度 定量下限 (LLOQ) 定义为信噪比大于 10:1( 对于全部两个通道而言 ) 的最低浓度, 它表明加标全血样品中目标物的平均浓度偏差小于 20%,RSD% 小于 20% 各种大麻素的 LOD 和 LLOQ 汇总于表 2 中 LOD LLOQ THC-OH THC-COOH THC 表 2. 全血中大麻素的 LOD 和 LLOQ 4

5 使用以下浓度研究 6 份不同来源空白全血样品的基质效应和回收率 :0.5 ( 低 ) 5 ( 中 ) 25 ( 高 ) 和 2.5 (ISTD) 在经 SPE 处理的空白全血中加入大麻素后所得的峰面积与加入 70% 甲醇水溶液所得的峰面积进行对比, 以测定基质效应 将提取前加标的全血所得的大麻素峰面积与提取后加标的全血所得的大麻素峰面积进行对比, 以测定回收率 各种大麻素的结果如表 3 所示, 据此得出的 ISTD 基质效应和回收率结果与相关的大麻素一致 THC-OH THC-COOH THC THC-OH-d3 THC-COOH-d3 THC-d3 基质效应 % 回收率 % 低浓度 中浓度 高浓度 低浓度 中浓度 高浓度 (3.0) (6.5) (2.5) (3.9) (5.2) (4.8) (5.4) (4.2) (3.2) (2.6) (3.5) (4.6) (3.3) (4.5) (1.9) (6.6) (3.0) (3.0) (3.3) (2.2) (3.2) (2.6) (3.5) (3.0) 表 3. 低 中和高浓度的大麻素加标全血的平均基质效应 % 和回收率 %(n=6) 括号中的数字为标准偏差 通过分析五个不同日期的三个不同浓度 ( 和 ) 的质量控制 (QC) 样品, 评估 日间准确度和精度 来自五个不同日期 三个浓度水平的质量控制重复样的平均值在目标值的 20% 范围内, 且 RSD% 小于 20%, 如表 4 所示 3.33 日间准确度目标值 % 表 4. 大麻素加标全血样品在 3 个 QC 浓度水平下的日间准确度和精度 (n=20) 3.33 日间精度 RSD% THC-OH THC-COOH THC

6 通过对加标浓度为 2.5 的全血样品反复多次提取, 将提取物合并复溶后保存于 10 的 ACQUITY 自动进样器中, 以评估提取样品的稳定性 在接下来的 24 h 内每 60 min 进样一次 ; 结果 未观察到大麻素或 ISTD 的峰面积发生显著改变 在 100 加标血样的进样结束之后分析大麻素的残留, 观察结果表明大麻素浓度均低于检测限 THC - COOH THC - COOH THC - OH THC - OH THC THC Time 图 1. 全血样品中大麻素加标浓度为 0.5 时的色谱图 (ISTD 未示出 ) 6

7 实际全血样品的分析制备共计 45 份实际全血样品进行 UPLC/MS/MS 分析并计算检出的大麻素浓度 在 45 份样品中,35 份样品检出的大麻素含量符合可接受标准 图 2 显示了一份大麻素阳性的全血样品, 以及用于对比的大麻素阴性样品的谱图 在所有大麻素阳性样品中均存在 THC-COOH, 此外, 检测发现其中 35 个阳性样品的 THC 浓度高于 LLOQ, 其中 29 个阳性样品的 THC-OH 浓度高于 LLOQ 将这些值与其他实验室利用 GC/MS/MS 方法取得的结果进行对比 两组数据之间的相关系数 (r 2 ) 范围为 = (THC-COOH) 至 (THC-OH), 如图 3 所示 2.0e6 THC-COOH 6.0e4 THC-OH 1.0e6 UPLC/MS/MS () THC y = x r = GC/MS/MS () THC 2.0e6 THC-COOH 2.0e4 THC-OH UPLC/MS/MS () THC-OH y = x r = GC/MS/MS () 1.0e6 THC Time 图 2. 含 1.22 THC 8.25 THC-COOH 和 0.44 HC-OH 的阳性全血样品 ( 下方图谱 ) 此外, 提供了阴性样品用于对比 ( 上方图谱 ) 图中仅显示了分析物的定量离子谱线 (ISTD 未示出 ) UPLC/MS/MS () THC-COOH y = x r = GC/MS/MS () 图 3. UPLC/MS/MS 和 GC/MS/MS 分析全血中大麻素的结果对比 7

8 结论法医和常规药物检测实验室都需要对大麻素进行监测, 因此, 用于生物样品中此类化合物的定量分析方法必须准确 可靠且稳定 本研究中建立的方法符合上述要求, 并且与用于分析人全血样品中大麻素的 GC/MS/MS 方法具有良好的相关性 该方法与 GC/MS/MS 方法相比有许多突出的优点, 具体包括 : 利用 UPLC 而非 GC 进行分离, 可免除 GC 所需的耗时的提取后衍生化处理步骤, 并将分析运行时间从 20 min 缩减至 6.5 min, 节省了 3 倍时间 在这些因素的共同作用下, 样品通量得到显著提高 此外, 具有超高灵敏度的 Xevo TQ-S 可满足低浓度大麻素检测的要求, 即使在血样体积非常小的情况下, 例如当其它方法报道需要 1 ml 血样时, 本方法 4,5&7 仅需 0.2 ml, 甚至无需在提取后执行浓缩步骤 因全血样品检测体积大大减小而带来的优势十分明显, 并且足以用于多种类别药物的检测 实验室在采用本应用方法之前, 有必要对方法进行一次完整的验证 致谢 感谢 J Monod 医院 ( 法国勒阿弗尔 ) 提供匿名的真实全血 样品 参考文献 1. Dewey WL. Cannabinoid pharmacology. Pharacological Review. 1986; 38: Mushoff F, Madea B. Review of biologic matrices(urine, blood, hair)as indicators of recent or ongoing cannabis use. Therapeutic Drug Monitoring. 2006; 28: Huestis M, et al. Blood Cannabinoids. 1. Absorption of THC and formation of 11-OH- THC and THCCOOH during and after smoking marijuana. J. Analytical Toxicology. 1992; 16: Scurlock R, et al. The Detection of delta-9 Tetrahydrocannabinol(THC)and 11-nor-9- Carboxy-delta-9 Tetrahydrocannabinol(THCA)in Whole Blood Using Two-Dimensional Gas Chromatography and EI-Mass Spectrometry. J. Analytical Toxicology. 2006; 30: Chu M, Drummer O. Determination of delta-9 THC in Whole Blood using Gas Chromatography Mass Spectrometry. J. Analytical Toxicology. 2002; 26: Lacroix C, Saussereau E. Fast liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of cannabinoids in micro volume blood samples after dabsyl derivatization. J. Chromatography B. 2012; 905: Jamey C, et al. Determination of Cannabinoids in Whole Blood by UPLC-MS-MS. J. Analytical Toxicology. 2008; 32: 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,ACQUITY UPLC,UPLC,Xevo,Oasis,MassLynx 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 Targetlynx 和 IntelliStart 是沃特世公司的商标 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司 印制于中国 2013 年 7 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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