实 验 LC 条 件 LC 系 统 : Waters ACQUITY UPLC 系 统 色 谱 柱 : 柱 温 : 5 流 速 : 流 动 相 A: 流 动 相 B: 梯 度 : 进 样 体 积 : 1 µl 强 清 洗 液 : ACQUITY UPLC BEH C 18 色 谱 柱 m
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- 阿话 贺
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1 [ 应 用 纪 要 ] 使 用 UPLC/MS/MS 定 量 分 析 血 清 中 的 21 种 苯 二 氮 卓 类 药 物 唑 吡 坦 和 佐 匹 克 隆 JMark Roberts and Michelle Wood. 沃 特 世 公 司 MS 技 术 中 心 ( 英 国 曼 彻 斯 特 ) 目 的 开 发 一 种 用 于 定 量 分 析 人 血 清 中 21 种 苯 二 氮 卓 类 药 物 唑 吡 坦 和 佐 匹 克 隆 的 U PLC/ MS/MS 方 法 简 介 苯 二 氮 卓 类 药 物 ( 图 1) 是 西 方 国 家 最 常 用 的 处 方 药 这 类 药 物 适 用 于 多 种 病 症, 包 括 焦 虑 失 眠 躁 动 不 安 肌 肉 痉 挛 和 酒 精 戒 断 症 状 它 们 的 药 效 主 要 由 与 GABA A 受 体 之 间 的 相 互 作 用 而 产 生 许 多 苯 二 氮 卓 类 药 物 具 有 潜 在 的 成 瘾 性 1, 长 期 使 用 可 导 致 药 物 依 赖 因 此, 这 类 药 物 的 分 析 对 于 临 床 和 法 医 领 域 都 至 关 重 要 这 些 药 物 的 误 用 2 3 在 老 年 人 或 精 神 病 患 者 等 弱 势 群 体 中 十 分 常 见 老 年 人 因 对 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 敏 感 程 度 随 着 年 龄 而 增 大, 因 此 风 险 更 高, 一 些 自 身 中 毒 事 件 的 报 道 中 常 常 涉 及 此 类 药 物 4-7 此 外 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 娱 乐 用 途 也 会 被 报 道, 它 们 通 常 是 与 其 它 麻 醉 品 合 用, 例 如 增 强 海 洛 因 或 可 卡 因 的 愉 悦 感, 或 用 于 减 轻 LSD 或 安 非 他 命 的 副 作 用 8 因 为 苯 二 氮 卓 类 药 物 具 有 镇 静 和 产 生 失 忆 的 作 用, 所 以 它 们 通 常 与 一 些 药 物 致 使 的 犯 罪 行 为 相 关 9 传 统 的 苯 二 氮 卓 类 药 物 定 量 技 术 包 括 气 相 色 谱 / 质 谱 (GC/MS) 和 高 效 液 相 色 谱 / 质 谱 (HPLC/MS) 前 者 一 般 需 要 增 加 一 个 衍 生 化 处 理 步 骤, 而 此 过 程 中 一 些 分 析 物 的 热 稳 定 性 不 佳 会 导 致 分 析 困 难 相 比 之 下,HPLC/MS 无 需 进 行 衍 生 化 处 理 即 可 分 离 范 围 较 广 的 物 质, 并 且 可 利 用 电 喷 雾 离 子 化 (ESI) 等 软 电 离 技 术 使 质 子 化 分 子 保 持 完 整 UltraPerformance LC (UPLC) 自 24 年 推 出 以 来, 其 相 较 于 HPLC 方 法 的 明 显 优 势 已 多 次 被 证 明, 如 更 高 的 分 辨 率 灵 敏 度 和 通 量 本 文 的 目 的 就 是 利 用 这 项 技 术 进 行 方 法 开 发 本 文 介 绍 了 一 种 基 于 液 / 液 萃 取 (LLE) 和 UPLC 结 合 串 联 质 谱 (MS/MS) 的 定 量 方 法, 并 使 用 真 实 样 品 对 该 方 法 的 性 能 进 行 了 评 估 结 果 数 据 与 经 HPLC/MS/MS 认 证 的 方 法 取 得 的 结 果 进 行 了 比 较 1 图 1. 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 核 心 结 构 1
2 实 验 LC 条 件 LC 系 统 : Waters ACQUITY UPLC 系 统 色 谱 柱 : 柱 温 : 5 流 速 : 流 动 相 A: 流 动 相 B: 梯 度 : 进 样 体 积 : 1 µl 强 清 洗 液 : ACQUITY UPLC BEH C 18 色 谱 柱 mm,1.7 µm 4 µl/min.1 甲 酸 的 水 溶 液.1 甲 酸 的 甲 醇 溶 液 时 间 (min) A B 曲 线 流 动 相 B (5 µl) 弱 清 洗 液 : 流 动 相 A (15 µl) 选 择 甲 醇 为 该 UPLC 色 谱 方 法 的 有 机 流 动 相, 未 选 择 乙 腈 的 原 因 是 其 在 全 球 范 围 资 源 短 缺 而 较 难 获 得 MS 条 件 MS 系 统 : Waters TQ 检 测 器 (TQD) 电 离 模 式 : ESI+ 毛 细 管 电 压 : 3 kv 脱 溶 剂 气 温 度 : 4 脱 溶 剂 气 : 8 L/h 源 温 度 : 12 采 集 模 式 : 多 反 应 监 测 (MRM) 材 料 样 品 样 品 为 27 个 真 实 血 清 和 血 浆 样 本, 这 些 样 品 此 前 已 通 过 一 种 经 发 表 的 传 统 SPE 1 和 HPLC/MS/MS 方 法 进 行 了 分 析 标 准 品 内 标 和 空 白 血 清 标 准 品 (1 mg/ml) 及 其 氘 代 内 标 (IS)(.1 mg/ml) 均 购 自 LGC Standards( 英 国 特 丁 顿 ) 将 内 标 用 水 配 制 成 5 µg/ml 的 混 合 储 液 空 白 血 清 来 自 Scipac( 英 国 锡 廷 伯 恩 ) 将 药 物 标 准 品 混 合 物 加 入 空 白 血 清, 制 成 血 清 校 准 品 ( 至 1 ng/ml) 样 品 制 备 液 / 液 萃 取 (LLE) 加 标 : 用 1 µl IS 对 3 µl 样 品 / 校 准 品 进 行 加 标, 并 加 入 15µL 硼 酸 盐 缓 冲 液 *, 涡 旋 混 匀 提 取 : 加 入 9 µl 提 取 混 合 液 **, 混 匀 离 心 : 在 3 rpm 下 离 心 5 分 钟 转 移 和 蒸 发 : 将 上 清 液 移 至 洁 净 的 Eppendorf 管 中, 在 4 恒 温 加 热 仪 的 氮 气 气 氛 下 干 燥 复 溶 和 进 样 : 用 5 µl 8 水 和 2 甲 醇 的 混 合 液 对 样 品 进 行 复 溶 (6 x 浓 缩 ), 混 匀 并 进 样 * 硼 酸 盐 缓 冲 液 使 用 十 水 四 硼 酸 钠 饱 和 溶 液 制 备 ** 提 取 混 合 液 使 用 二 氯 甲 烷 / 乙 醚 / 己 烷 (3/5/2) 与.5 异 戊 醇 制 备 结 果 与 讨 论 方 法 验 证 所 有 药 物 及 其 代 谢 物 的 MRM 通 道 和 优 化 条 件 如 表 1 所 示 每 种 分 析 物 都 通 过 两 个 通 道 生 成 的 定 量 和 定 性 离 子 进 行 监 测 内 标 通 过 单 个 通 道 进 行 监 测 为 了 对 所 有 分 析 物 进 行 线 性 研 究, 分 别 平 行 制 备 了 三 份 浓 度 为 和 1 ng/ml 的 加 标 血 清 校 准 品, 并 且 按 上 述 LLE 方 法 进 行 提 取 分 析 完 成 后, 通 过 1/x 加 权 绘 制 校 准 曲 线 r 2 平 均 值 均 大 于.995, 仅 α- 羟 基 三 唑 仑 除 外, 其 在 1-1 ng/ml 范 围 内 为.975 通 过 对 每 种 分 析 物 MRM 谱 线 的 峰 下 方 面 积 进 行 积 分 并 参 照 相 应 的 氘 代 内 标 峰 面 积 进 行 定 量 图 2 列 出 了 1 ng/ml 浓 度 下 所 有 分 析 物 的 定 量 离 子 谱 线 检 测 限 (LOD) 定 义 为 所 得 信 噪 比 (S:N) 大 于 7:1( 对 于 定 性 离 子 和 定 量 离 子 ) 的 浓 度 具 体 数 据 汇 总 于 表 1 中 2
3 化 合 物 母 离 子 (m/z) CV(V) 产 物 离 子 1 (m/z) 表 种 分 析 物 的 MRM 通 道 锥 孔 电 压 (CV) 和 碰 撞 能 量 (CE), 其 中 产 物 离 子 1 为 定 量 离 子, 产 物 离 子 2 为 定 性 离 子 CE (V) 产 物 离 子 2 (m/z) 7- 氨 基 氯 硝 西 泮 氨 基 氟 硝 西 泮 α- 羟 基 阿 普 唑 仑 CE (V) 内 标 (IS) 7- 氨 基 氯 硝 西 泮 d4 7- 氨 基 氟 硝 西 泮 d7 α- 羟 基 阿 普 唑 仑 d5 LOD (ng/ml) 基 质 效 应 RSD 回 收 率 α- 羟 基 咪 达 唑 仑 硝 西 泮 d α- 羟 基 三 唑 仑 α- 羟 基 三 唑 仑 d 阿 普 唑 仑 阿 普 唑 仑 d 溴 西 泮 硝 西 泮 d 氯 氮 卓 硝 西 泮 d 氯 硝 西 泮 氯 硝 西 泮 d 地 西 泮 地 西 泮 d 艾 司 唑 仑 艾 司 唑 仑 d 氟 硝 西 泮 氟 硝 西 泮 d 劳 拉 西 泮 奥 沙 西 泮 d 氯 甲 西 泮 去 甲 地 西 泮 d 咪 达 唑 仑 氨 基 氟 硝 西 泮 d 硝 西 泮 硝 西 泮 d 去 甲 地 西 泮 去 甲 地 西 泮 d 奥 沙 西 泮 奥 沙 西 泮 d 普 拉 西 泮 普 拉 西 泮 d 替 马 西 泮 去 甲 地 西 泮 d 三 唑 仑 三 唑 仑 d 唑 吡 坦 唑 吡 坦 d 佐 匹 克 隆 氨 基 氯 硝 西 泮 d 使 用 6 个 不 同 来 源 的 空 白 血 清 评 估 回 收 率 和 基 质 效 应 ( 图 1) 加 标 前 后 的 5 ng/ml 血 清 回 收 率 的 结 果 在 62 至 89 范 围 内 将 加 标 到 提 取 空 白 血 清 的 分 析 物 与 加 标 到 流 动 相 的 分 析 物 的 响 应 进 行 对 比 以 确 定 基 质 效 应 结 果 总 体 令 人 满 意, 范 围 在 -28 抑 制 到 +6 增 强 之 间 ( 表 示 没 有 基 质 效 应 ) 通 过 按 前 述 步 骤 对 16 个 加 标 浓 度 为 5 ng/ml 的 空 白 血 清 样 品 进 行 LLE 提 取, 以 评 估 提 取 样 品 的 稳 定 性 将 复 溶 后 的 提 取 物 收 集 到 一 个 样 品 瓶 中, 在 5 下 置 于 ACQUITY 自 动 进 样 器 中 保 存 11 小 时, 每 45 分 钟 进 样 一 次 在 研 究 过 程 中, 标 准 品 或 IS 都 未 观 察 到 明 显 的 峰 面 积 损 失 3
4 样 品 分 析 对 全 部 27 个 真 实 血 清 和 血 浆 样 品 匿 名 处 理 后 进 行 LLE 提 取, 然 后 使 用 上 述 方 法 进 行 分 析 阳 性 结 果 的 鉴 定 标 准 如 下 : 分 析 物 的 保 留 时 间 必 须 在 预 期 保 留 时 间 的.2 min 误 差 范 围 内, 且 离 子 比 率 在 预 计 比 率 的 15 误 差 范 围 内 这 些 分 析 物 的 预 期 离 子 比 率 分 别 定 义 为 1 1 和 1 ng/ml 下 的 校 准 品 比 率 平 均 值 使 用 TargetLynx TM 应 用 软 件 对 这 些 样 品 的 数 据 进 行 处 理, 将 保 留 时 间 或 比 率 超 出 上 述 设 定 值 的 任 何 分 析 物 设 为 自 动 标 记 这 在 最 大 程 度 上 缩 短 了 用 户 分 析 处 理 数 据 所 需 的 时 间 然 后 将 数 据 与 使 用 之 前 的 方 法 ( 在 其 它 实 验 室 使 用 已 发 表 并 验 证 的 方 法 ) 对 一 小 组 化 合 物 (13 种 苯 二 氮 卓 类 药 物 ) 进 行 分 析 所 取 得 的 结 果 进 行 对 比 这 些 数 据 如 图 3 和 图 4 所 示 总 的 来 说, 新 开 发 的 方 法 与 已 发 表 方 法 之 间 有 着 极 好 的 相 关 性 (r 2 值 大 于.98) 图 5 显 示 了 一 个 阳 性 真 实 样 本 的 示 例, 同 时 还 给 出 一 个 阴 性 对 照 以 便 对 比 12 1 R 2 =.9884 UPLC/MS/MS 图 3. 新 开 发 的 UPLC/MS/MS 方 法 与 已 发 表 方 法 的 数 据 对 比 图 中 的 39 个 结 果 包 含 了 所 有 检 出 分 析 物, 浓 度 以 ng/ml 表 示 12 R 2 = UPLC/MS/MS 图 4. 新 开 发 的 UPLC/MS/MS 方 法 与 已 发 表 方 法 的 数 据 对 比 图 中 仅 绘 出 了 去 甲 地 西 泮 的 9 个 结 果, 浓 度 以 ng/ml 表 示 e e e e e e min min 图 2. 提 取 的 1 ng/ml 血 清 校 准 品 中 所 有 分 析 物 的 定 量 离 子 图 谱 注 : 劳 拉 西 泮 去 甲 地 西 泮 奥 沙 西 泮 和 替 马 西 泮 的 含 量 均 低 于 该 UPLC/MS/MS 方 法 的 检 测 限 图 5. 4 ng/ml 氯 硝 西 泮 的 阳 性 结 果 A 为 空 白 血 清 校 准 品,B 为 真 实 样 品 上 方 谱 线 为 内 标, 中 间 谱 线 为 316>214( 定 性 离 子 ), 下 方 谱 线 为 316>27( 定 量 离 子 ) 峰 上 方 的 数 字 表 示 峰 面 积, 峰 右 侧 的 数 字 表 示 峰 强 度 4
5 结 论 法 医 和 临 床 实 验 室 都 需 要 对 苯 二 氮 卓 类 药 物 进 行 监 测, 因 此 需 要 一 种 准 确 可 靠 且 稳 定 的 方 法 对 生 物 样 品 中 的 这 些 药 物 进 行 定 量 分 析 为 此, 我 们 开 发 了 一 种 快 速 灵 敏 的 UPLC/MS/MS 方 法, 以 分 析 各 种 常 用 苯 二 氮 卓 类 药 物 与 GC/MS 不 同, 这 种 技 术 不 需 要 进 行 衍 生 化 处 理, 并 且 由 于 采 用 了 软 电 离, 可 以 监 测 分 析 物 的 质 子 化 分 子 特 定 碎 片 与 HPLC 方 法 相 比, 基 于 UPLC 的 方 法 可 提 供 卓 越 的 色 谱 分 离 度 更 高 的 灵 敏 度 和 更 短 的 运 行 时 间 本 纪 要 中, 使 用 LLE-UPLC/MS/MS 方 法 对 27 种 真 实 血 清 和 血 浆 样 品 进 行 分 析 后, 将 所 得 结 果 与 之 前 使 用 已 认 证 方 法 取 得 的 结 果 进 行 了 比 较 ; 数 据 显 示 出 良 好 的 一 致 性 本 应 用 是 使 用 沃 特 世 系 统 进 行 的 检 测 示 例 完 整 的 验 证 方 法 还 需 用 户 进 一 步 开 发 致 谢 感 谢 Stephanie Marin( 美 国 犹 他 州 盐 湖 城 ARUP 实 验 室 ) 提 供 的 含 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 预 分 析 真 实 样 品 参 考 文 献 1. Longo LP and Johnson B. American Academy of Family Physicians afp/241/2121.html (2)61(7) Bogunovic O and Greenfield S. Pyschiatric Services (24)55 (3): Brunette M et al. Pyschiatric Services (23)54(1): McLoone P and Crombie IK. The British Journal of Psychiatry (1996)169: Prescott LF and Highley MS. British Medical Journal (1985)29: Stern TA et al. Annals of Clinical Psychiatry (1991)3(3): Wang H et al. Zhonghua Nei Ke Za Zhi/Chinese Journal of Internal Medicine(22)41 (6) Wood M et al. Journal of Analytical Toxicology(23)27: Dorandeu A et al. Journal of Clinical Forensic Medicine(26)13: Marin SJ et al. Journal of Analytical Toxicology(28)32: 本 方 法 是 本 文 所 述 仪 器 软 件 和 消 耗 品 的 一 个 应 用 示 例 沃 特 世 尚 未 确 认 该 方 法 是 否 可 转 换 到 其 它 仪 器 软 件 或 消 耗 品 应 用 纪 要 作 为 对 概 念 的 验 证, 可 为 最 终 用 户 在 开 发 和 验 证 各 自 的 实 验 室 开 发 测 试 (LDT) 时 提 供 参 考 最 终 用 户 须 自 行 完 成 此 类 LDT 的 方 法 开 发 和 验 证 本 方 法 尚 未 经 任 何 监 管 实 体 许 可 用 于 诊 断 目 的 沃 特 斯 中 国 有 限 公 司 沃 特 世 科 技 ( 上 海 ) 有 限 公 司 Waters,ACQUITY UPLC,UltraPerformance LC 和 The Science of What s Possible 是 沃 特 世 公 司 的 注 册 商 标 Targetlynx 是 沃 特 世 公 司 的 商 标 其 他 所 有 商 标 均 归 各 自 的 拥 有 者 所 有 21 年 沃 特 世 公 司 印 制 于 中 国 21 年 6 月 ZH VW-PDF 北 京 : 上 海 : 广 州 : 成 都 : 香 港 : 免 费 售 后 服 务 热 线 :8 (4)
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苏 州 科 技 学 院 天 平 学 院 2015 年 本 科 招 生 专 业 介 绍 环 境 设 计 专 业 性 质 : 艺 术 ( 以 下 各 专 业 学 制 均 为 4 年 ) 本 专 业 培 养 适 应 社 会 主 义 建 设 需 要, 具 有 扎 实 的 理 论 基 础 较 高 艺 术 修 养 人 文 素 质 设 计 组 织 和 协 调 能 力 并 全 方 位 掌 握 环 境 设 计 专 业
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贵 州 大 学 文 件 贵 大 发 2015 40 号 贵 州 大 学 关 于 2015 年 申 报 专 业 技 术 三 级 岗 位 的 通 知 各 学 院 校 直 各 单 位 : 根 据 省 教 育 厅 省 人 力 资 源 和 社 会 保 障 厅 关 于 做 好 2015 年 省 属 高 等 学 校 专 业 技 术 三 级 岗 位 聘 用 评 议 工 作 的 通 知 ( 黔 教 师 发 2015
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第 六 章 灰 分 及 几 种 重 要 矿 物 元 素 含 量 的 测 定 第 一 节 灰 分 的 测 定 一 概 述 食 品 的 组 成 十 分 复 杂, 除 含 有 大 量 有 机 物 质 外, 还 含 有 丰 富 的 无 机 成 分, 这 些 无 机 成 分 包 括 人 体 必 须 的 无 机 盐 ( 或 称 矿 物 质 ), 其 中 含 量 较 多 的 有 Ca Mg K Na S P C1
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