Dev of Quantitative UPLC_MS_MS_ en中文

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1 Mary E. Lame Erin E. Chambers 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 CORTECS UPLC HILIC 色谱柱的分离度可实现对 ACh HA 及其代谢产物的同时定量总运行时间仅 2.5 min, 符合高通量筛查需求 96 孔板的应用简化了样品制备 ( 小于 15 min) 较之先前的报道方法, 高灵敏度的 Xevo TQ-S MS 允许所用样品体积更小, 稀释倍数更高简介在药物研发中, 来自体液的生化标记物常被用作诊断疾病和评估药物疗效的有效方式乙酰胆碱 (Acetylcholine, ACh) 和组胺 (Histamine, HA) 是强极性神经递质, 存在于几乎所有哺乳动物组织中它们在睡眠调 1-3 节记忆学习和免疫反应中发挥着一定作用大脑中 ACh 水平下降会导致记忆功能障碍, 尤其是阿尔茨海默氏症患者的 ACh 供应明显不足 1 因此, 在这类认知障碍的治疗中对于如何促进 ACh 的释放进行了广泛的研究组胺由组氨酸的脱羧作用生成组胺或是被储存起来, 或是被其主要的降解酶组胺 -N- 甲基转移酶或二胺氧化酶迅速灭活并代谢为两种主要代谢产物 t - 甲基组胺 (t-mha) 和 τ- 甲基咪唑醋酸 (t-miaa) 脑内组胺参与广泛的生理功能, 例如睡眠 - 觉醒周期调节唤醒食欲控制认知学习和记忆 2,3 据了解, 在精神分裂症患者脑脊液中组胺的代谢产物增多 4,5 因此, 脑脊液 (CSF) 中 HA t-mha 和 t-miaa 的浓度可以作为脑组胺活性的指标鉴于 ACh HA 及其各自的代谢产物具沃特世解决方案 ACQUITY UPLC 系统 Xevo TQ-S 质谱仪 CORTECS UPLC HILIC 色谱柱乙酰胆碱 (ACh) 胆碱 (Ch) ACQUITY 收集板关键词生物分析, 生物标记物, 脑脊液, 定量, 神经递质, 乙酰胆碱, 胆碱, 组胺,t- 甲基组胺,t- 甲基咪唑醋酸, UPLC,HILIC,CORTECS 组胺 (HA) t- 甲基组胺 (t-mha) t- 甲基咪唑醋酸 (t -MIAA) 图 1. ACh HA 及其各自代谢产物的结构式 1

2 有重要的生理学作用, 其生理浓度变化的测量可作为疾病进展或药物治疗的评估指标, 这一功能使得这类物质成为药物研发中非常重要的生化标记物开发 ACh HA 及其代谢产物的靶向分析方法是人们一直以来面临的挑战, 因为它不仅需要具备高灵敏度和高选择性, 还需要具有较快的样品分析速度此外,ACh HA 及其各自代谢产物之间的内源性循环浓度存在极大差异, 使得同时测定这些物质需要较宽的定量动态范围虽然目前有多种用于定量这类分析物分析方法 (GC/MS,HPLC-EC 和 LC/MS) 6-8, 但很少有方法能够同时测定啮齿动物脑微透析液或 CSF 基质中的 ACh HA 及其各自代谢产物 9 在含较高水相的洗脱条件下, 分析物与基质抑制组分可能会共流出并且 MS 电离能力较差, 使得反相 (RP) 液相色谱法结合 MS 检测的方法因灵敏度较低而受到限制 10 亲水作用液相色谱(HILIC) 能够提高极性物质的色谱保留性能, 可与反相色谱进行正交实验用于极性和可电离化合物的分离, 并能改善质谱响应, 正日益成为应对这些极性分析物分离挑战的不二之选本文中介绍的方法展示了在 96 孔板中同时定量人 CSF 中的 ACh HA 及其各自代谢产物利用一步法样品制备技术制备样品, 取 20 µl 样品进行稀释, 再执行 HILIC UPLC/MS/MS 分析采用亚 2 µm 颗粒的高效 CORTECS UPLC HILIC 色谱柱能够实现分析物与内源性基质的分离, 提高分析灵敏度, 分析时间只需 2.5 min, 因此本方法快速灵敏准确且选择性好, 符合药物开发的高通量生物分析需求 2

实验样品制备 20 µl 人工脑脊液 (acsf) 标准品 acsf 质量控制 (QC) 样品或人脑脊液 ( 含 4 mm 毒扁豆碱 ) 将 QC 样品转移至 1 ml 的 96 孔板中向样品中加入含有浓度分别为 1 ng/ml 的 d4- 乙酰胆碱 d4- 组胺 d3- t - 甲基组胺和 d3- t - 甲基咪唑醋酸 ( 用作内标 (ISTD)) 的乙腈 100 µl 盖上 96 孔板,

3 实验样品制备 20 µl 人工脑脊液 (acsf) 标准品 acsf 质量控制 (QC) 样品或人脑脊液 ( 含 4 mm 毒扁豆碱 ) 将 QC 样品转移至 1 ml 的 96 孔板中向样品中加入含有浓度分别为 1 ng/ml 的 d4- 乙酰胆碱 d4- 组胺 d3- t - 甲基组胺和 d3- t - 甲基咪唑醋酸 ( 用作内标 (ISTD)) 的乙腈 100 µl 盖上 96 孔板, 并进行涡旋混合然后, 将样品在 4000 rpm 下离心 5 min, 取 10 µl 样品进行 UPLC/MS/MS 分析 UPLC 条件系统 : ACQUITY UPLC 色谱柱 : CORTECS UPLC HILIC 1.6 µm,2.1 mm X 100 mm( 部件号 ) 流动相 A: 100 mm 甲酸铵,pH 3 流动相 B: 梯度 : 流速 : 乙腈初始为 90% 的流动相 B, 在 0.75min 内线性增加至 60%, 保持 0.25 min, 然后在 0.25 min 内线性减少至 30%, 并保持 0.65 min 最后在 1.9 min 内返回至初始条件 0.5 ml/min 柱温 : 45 样品温度 : 6 进样体积 : 10 µl 运行时间 : 收集板 : 2.5 min Waters ACQUITY 1 ml 收集板 MS 条件质谱仪 : 电离模式 : 毛细管电压 : Xevo TQ-S ESI+ 3.0 kv 脱溶剂气温度 : 550 锥孔气体流速 : 150 L/h 脱溶剂气流速 : 900 L/h 碰撞室压力 : 3.58 X 10 (-3) mbar 碰撞能量 : 按组分优化, 见表 1 锥孔电压 : 按组分优化, 见表 1 数据管理色谱分析 : 定量 : MassLynx 软件 TargetLynx 软件 3

4 结果与讨论质谱分析利用沃特世 Xevo TQ-S 质谱仪在 ESI-MS/MS 正离子模式下对 ACh HA 及其各自代谢产物进行检测和定量使用 MassLynx IntelliStart 软件自动优化针对 ACh HA 及其各自代谢产物和相应的氘代稳定同位素标记形式 ( 作为内标 ) 所选择的多重反应监测 (MRM) 通道, 如表 1 所示每个 MRM 通道驻留时间短至 25 ms, 以及 MS 系统的快速扫描时间, 使其能够同时采集所有化合物峰并达到每峰数据点 >/= 10 化合物 MRM 通道锥孔电压 (V) 碰撞能量 (ev) 乙酰胆碱 > d4- 乙酰胆碱 > 胆碱 > 组胺 > d4- 组胺 > t - 甲基组胺 > d3-t - 甲基组胺 > t - 甲基咪唑醋酸 > d3 t - 甲基咪唑醋酸 > 表 1. ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 及其各自的氘代稳定同位素标记内标的 MS 条件 4

5 UPLC 分离 ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 是以相对较低浓度存在的强极性小分子化合物, 这使其难以通过常规的反相色谱进行检测此外, 由于共流出的相关分子 ( 如盐类或其它低分子量内源性组分 ) 的基质诱导干扰和离子抑制作用, 导致对生物基质中的这些内源性分析物进行定量分析常常较为困难 9 在本应用纪要中, 我们利用亚 2 µm CORTECS UPLC HILIC 色谱柱和 ACQUITY UPLC 系统实现了 ACh HA 及其各自代谢产物的色谱分离确定最适宜的甲酸铵浓度 ( 流动相 A) 为 100 mm (ph 3), 流动相 B 由乙腈组成在最佳流速为 0.5 ml/min 梯度为 30%-90% B 时, 其在 45 的柱温下分析循环时间为 2.5 min 流动相添加剂的浓度对方法特异性灵敏度以及将目标分析物与流动相和内源性基质进行色谱分离的能力具有重要影响较高的缓冲液浓度 100 mm( 而不是 20 至 50 mm) 极大地改善了后洗脱分析物的峰宽特别是高 mm 浓度的甲酸铵使 t-miaa 的峰拖尾现象显著减少定量下限控制标准品 (LLQC) 中的 ACh Ch 及其各自代谢产物, 色谱保留时间和性能如图 2 所示 ACh Ch 及其各自代谢产物和 ACh 的同分异构体 Iso-ACh(3- 羧丙基 ) 三甲基铵在 1.35 至 1.75 min 内洗脱, 基线峰宽小于 3.7 s 1.73 t-mha > (t-mha) 3.43e4 % % % % % > (HA) 5.39e > (MIAA) 1.14e > 60.1 (CH) 1.30e ACh Ch HA t-miaa > (ACH) 6.69e4 时间图 2. acsf 中 ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 在 LLQC 浓度 (ACh/t-mHA 为 16 pg/ml,ha 为 62 pg/ml, t-miaa 为 35 pg/ml 和 Ch 为 140 pg/ml) 下的代表性色谱图 5

6 由于 Iso-ACh(3- 羧丙基 ) 三甲基铵在脑中以较高浓度存在, 因此本研究对其进行了分析据报道, 它是肉毒碱生物合成中的酶 (G- 甜菜碱羟化酶 ) 的底物 11 ACh 和 Iso-ACh 为同分异构体, 在进行 CSF 中 ACh 的准确定量时确保二者的色谱分离度相当重要在人 CSF 样品提取物中 ( 图 3), 突显了存在的高浓度内源性 Iso-ACh 将 ACh 以 1000 pg/ml 的浓度加标至人 CSF 中, 以展示 ACh 和 Iso-ACh 之间的色谱分离和浓度差异 100 iso-ach > (ACH) 2.06e7 0% ACh 1.36 Time 图 3. 人 CSF 中 ACh 和 Iso-ACH 的代表性色谱图 (ACh 加标浓度为 1000 pg/ml) 样品制备选择人工 CSF (acsf) 作为替代基质用于制备标准曲线, 以对所有分析物进行定量 acsf 较容易获得, 且花费不像人 CSF 那样高昂, 因此, 将其作为替代基质更为实际为了确保 acsf 可作为合适的基质用于所有分析物的准确定量, 我们制备了 ACh HA 和 t-mha 的加标人 CSF QC 样品, 以及 Ch 和 t-miaa 的 acsf QC 样品 Ch 和 t-miaa 的 QC 样品由 acsf 配制, 是因为人 CSF 中内源性基底水平的 ng/ml 浓度较高, 使得难以通过标准品加入法在适用于其它分析物测定的线性范围内进行定量, 因此需使用 acsf 制备 Ch 和 t-miaa 的 QC 样品此外, 人 CSF 中 Ch 的 ng/ml 浓度较高, 因此需要采用 acsf 对样品进行稀释以便在动态检测范围内进行准确定量如 Zhang Tingley Tseng 等人所述, 所有人 CSF QC 样品和人 CSF 样品均含有最终浓度为 4 mm 的稳定剂毒扁豆碱, 用于阻止 ACh 经酶转化为 Ch 和醋酸盐标准曲线人 CSF QC 样品 acsf QC 样品和样品均采用 1mL 96 孔板制备通过加入含实验部分所述内标的乙腈, 进行一步法样品稀释 ( 样品量 : 乙腈量 1:5) 使用 96 孔板可以在 15 min 内完成样品制备, 满足了开发定量分析方法所需的高通量分析要求 6

7 线性精度和使用 ACh HA t-mha 和 t-miaa 的氘代稳定同位素标记标准品 (ISTD) 进行定量分析用 d4 ACh 内标进行 Ch 定量 ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 的标准曲线 (1/x 加权 ) 在定量动态范围内呈线性 (>0.99) 各分析物的动态范围线性平均 QC 和定量下限 (LLOQ) 如表 2 所示 ACh 的代表性校准曲线示于图 4 中化合物名称乙酰胆碱相关系数 : r = , r^2 = 校准曲线 : * x 响应类型内标 ( 参比 2), 峰面积 *( 内标浓度 / 内标峰面积 ) 曲线类型线性, 原点 : 排除, 加权 1/x, 轴转无残差 Conc 响应 Conc 图 4. acsf 样品中 ACh 的代表性标准曲线化合物动态范围表 2. ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 的 UPLC/MS/MS 检测分析性能线性 (1/x) LLQC* 平均 QC 乙酰胆碱 10 to 10, 胆碱 100 to 30, 组胺 50 to 10, t - 甲基组胺 10 to 10, t - 甲基咪唑醋酸 20 to 30, *LLQC 定量下限控制 7

8 以人 CSF 和 acsf 的混合物为基质制备 QC 样品, 用于评估样品内精度和重现性通过分析未加标的人 CSF, 测定 ACh HA 和 t-mha 的基底水平通过从 CSF 源中扣除平均基底水平浓度得出相应的 QC 水平, 从而测得 QC 浓度 ACh HA 和 t-mha 的加标人 CSF QC 样品分析, 以及 Ch 和 t-miaa 的加标 acsf QC 样品分析的代表性结果如表 3 和 4 所示 acsf 和人 CSF 校准定量完成后, 利用 acsf 标准曲线测定人 CSF 中各分析物的内源性基底浓度 ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 的基底水平平均测定值汇总于表 5 中和精度值符合 FDA 关于 LC/MS/MS 检测的法规标准 12,13 ACh 加标浓度最终 ACh QC 浓度 HA 加标浓度最终 HA QC 浓度 ACh 浓度计算值 HA 浓度计算值 t-mha 加标浓度 t-mha QC 浓度计算浓度表 3. 人 CSF QC 样品分析所得的代表性 ACh HA 和 t-mha 结果 SD SD SD 变异系数 (%) 变异系数 (%) 变异系数 (%)

9 t-miaa acsf QC 浓度 (ng/ml) t-miaa 浓度平均 (N=4) 计算值 (ng/ml) SD 变异系数 (%) Ch acsf QC 浓度 (ng/ml) Ch 浓度计算值 (ng/ml) 变异系数 (%) 表 4. acsf QC 样品分析所得的代表性 t-miaa 和 Ch 结果 SD 化合物计算浓度单位 SD 变异系数 % ACh 4.1* pg/ml Ch 530.0** ng/ml HA pg/ml t-mha pg/ml t-miaa 20.5 ng/ml * 低于定量限 ** 样品用 acsf 稀释 80 倍表 5. 人 CSF 中 ACh Ch HA t-mha 和 t-miaa 各自的内源性基底水平的平均测定值汇总 9

10 结论这种快速简单灵敏且高选择性的 UPLC 分析方法能够对人 CSF 中的 ACh HA 及其各自代谢产物进行分离和同时定量使用 96 孔板可以在 15 min 内完成样品制备, 提供了研发阶段分析方法所需的高分析通量 CORTECS UPLC HILIC 色谱柱的分离度和灵敏度改善了内源性基质组分的分离和分离度, 所用分析时间仅为 2.5min Xevo TQ-S MS 的高灵敏度使得只需少量样品 (20 µl) 和 5 倍的稀释, 即可达到低至 10 pg/ml 的检测限, 并具有宽的定量动态范围 pg/ml 所有分析物的 QC 样品分析结果均符合 FDA 法规标准, 变异系数为 0.3%-10.1%, 范围为 94.7%-113.7%, 表明本方法的重现性和良好本文所介绍的方法展示出在药物开发的研发阶段对多种神经性生物标记物进行高选择性和高灵敏度定量的潜力参考文献 1. Jia JP, et al. Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer s disease and vascular dementia. Chin Med J (Engl). 2004; 117(8): Vohora D, Bhowmik M. Histamine H3 receptor antagonists/inverse agonists on cognitive and motor processes: relevance to Alzheimer s disease, ADHD, schizophrenia, and drug abuse. Front Syst Neurosci. 2012; 6: Jadidi-Niaragh F, Mirshafiey A. Histamine and histamine receptors in pathogenesis and treatment of multiple sclerosis. Neuropharmacology. 2010; 59(3): Ito C. The role of the central histaminergic system on schizophrenia. Drug News Perspect. 2004; 17(6): Alvarez EO. The role of histamine on cognition. Behav Brain Res. 2009; 199(2): Prell GD, Green JP. Measurement of histamine metabolites in brain and cerebrospinal fluid provides insights into histaminergic activity ; 41: C Huang T, et al. Detection of basal acetylcholine in rat brain microdialysate. J Chromatogr B Biomed Appl. 1995; 670(2): Bourgogne E, et al. Simultaneous quantitation of histamine and its major metabolite 1-methylhistamine in brain dialysates by using precolumn derivatization prior to HILIC-MS/MS analysis. Anal Bioanal Chem. 2012; 402(1): Zhang Y, et al. Development and validation of a sample stabilization strategy and a UPLC-MS/MS method for the simultaneous quantitation of acetylcholine (ACh), histamine (HA), and its metabolites in rat cerebrospinal fluid (CSF). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011; 879(22): Grumbach ES, Diehl DM, Neue UD. The application of novel 1.7 microm ethylene bridged hybrid particles for hydrophilic interaction chromatography. J Sep Sci. 2008; 31(9): Zhu Y, et al. In vivo microdialysis and reverse phase ion pair liquid chromatography/tandem mass spectrometry for the determination and identification of acetylcholine and related compounds in rat brain. 2000; 14(18): Viswanathan CT, et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. Pharm Res. 2007; 24(10): Bansal S, DeStefano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. AAPS J. 2007; 9(1): E Waters ACQUITY UPLC Xevo ACQUITY UPLC MassLynx 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 CORTECS TargetLynx IntelliStart 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司印制于中国 2013 年 6 月 ZH LL-PDF (400)

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ [ 应用纪要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝刚苏州市食品药品检验所, 苏州 15104 关键词超高效液相色谱 - 质谱, 多反应监测, 减肥类保健食品非法添加, 快速定性定量