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远萧
5 years ago
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1 Agilent 1200 RRLC 和 6410 三重串联四极杆质谱仪定量测定尿中乙基葡糖醛酸应用法医学作者 Julie Marr, Dustin Yaworsky, and Rita Steed Agilent Technologies, Inc Centerville Road Wilmington, DE Jeffrey Keever Agilent Technologies, Inc. 200 Regency Forest Drive Cary, NC Michael Zumwalt Agilent Technologies, Inc S Meridian Blvd., MS 1-1E Englewood, Colorado Deborah Tinnemore and Bert Toivola Sterling Reference Laboratories 2617 East L Street, Suite A Tacoma, WA 摘要将 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱 (RRLC) 系统与 6410 三重串联四极杆质谱仪通过 G1948B 电喷雾离子源 (ESI) 相连接, 在负离子模式下操作验证乙基葡糖醛酸 (EtG) 的存在,EtG 是检测近期乙醇摄入的化学生物标志物本文工作的线性范围为 250 ng/ml 至 2500 ng/ml, 以 EtG 在尿中含量计使用 ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱,3 250 mm (5 µm 粒径 ), 进样 10 µl, 在 800 µl/min 恒速洗脱下显示出极好的重现性和线性 EtG 的保留时间为 2.2 min, 这使本分析方法成为一种快速定量方法引言乙基葡糖醛酸 (EtG) 是一种较小的乙醇代谢物, 可作为近期乙醇摄入的直接生物标记物 EtG 在肝脏经葡糖醛酸化形成, 低于摄入剂量 0.1% 的乙醇转化为 EtG 乙醇摄取后至 72 ~ 96 小时可在尿中检测到 EtG, 这比尿中乙醇 12 ~ 14 小时的检测窗要长得多除了检测窗窄外, 检测尿中乙醇的另一个缺点是乙醇可经发酵形成这是监测患糖尿病人群乙醇摄入时存在的潜在问题 EtG 不能经发酵形成, 它只能在乙醇经肝代谢后的尿中找到人尿样中 EtG 的浓度范围从非乙醇使用者的不能检测到至慢性酒精中毒者超过 100 万 ng/ml 的水平许多零容忍乙醇治疗计划使用 100 ng/ml 作为阳性截止值用作酒精摄入的标志使用 100 ng/ml 作为阳性截止值会产生一个问题, 即偶然接触乙醇就可能导致 EtG 含量水平超过 100 ng/ml, 如非处方药剂含醇漱口水消毒洗手液食品和化妆品等为了避免上述情况的发生, 许多实验室和治疗计划选择使用

2 更高的阳性截止值, 即 250 或 500 ng/ml 这样就消除了偶然接触乙醇造成的 EtG 阳性报告, 但这样也就减小了乙醇摄入的检测窗 STERLING 参比实验室在大多数计划中使用的截止值为 250 ng/ml, 整体阳性率大约为 20% 在需要严格戒酒的计划中,EtG 检测已成为很有价值的检测工具与物质滥用的所有标志物一样,EtG 水平不应用作乙醇摄入的唯一标准, 而应该与其它指标相配合由经过专门培训的顾问和专业人员进行综合评价使用串联 MS/MS 质谱仪进行分析进一步提高了方法的特异性 QQQ 质谱仪的这种能力通过选择性检测 EtG 母离子及其产生的结构专一性子离子来实现强度较大的子离子用于定量而强度较小的离子用作定性, 通过成批校正标物质控标物 (QC) 和实际样品中广泛存在的定性离子与定量离子之间保持一个特定的比值来验证 EtG 的存在为了解决样品提取回收率和基质效应带来的影响, 在样品中加入一个内标物按相似的确证要求进行分析 EtG 是稳定的水溶性物质, 但对热不稳定, 很难在不进行衍生化的情况下采用 GC/MS 法进行分析它也是一种羧酸, 特别适合于电喷雾离子化, 在溶液中形成去氢离子本文分析 EtG 的浓度范围为 250 ~ 2500 ng/ml 经分析确认在十个尿样中存在 EtG, 其中包括三个浓度为 211,383 和 1594 ng/ml 的质控标样 (QCs) 由于采用 Agilent 6410 QQQ 质谱仪进行此类分析的灵敏度超过所需要的灵敏度, 所以将样品用 0.1% 甲酸水溶液稀释 10 倍后再进行测定以减少对色谱柱的污染应该指出, 即使将样品稀释 20 ~ 25 倍仍然具有足够的灵敏度根据得出的校正曲线, 质控标样的定量准确度分别为和 98% 此外, 所分析的 10 个样品中 7 个被确定为阳性, 即含量超过 250 ng/ml 的截止值 EtG 的结构示于图 1 H 3 C 图 1. O HO 实验部分样品制备 O OH OH OH 乙基葡糖醛酸及其去氢离子的 m/z O EtG [M H] = EtG 标物及其氘代衍生物 (d5) 来自 Sterling 参比实验室 (SRL) 浓度分别为 10 和 0.1 mg/ml 甲醇溶液标样用 0.1% 甲酸水溶液 (v/v) 稀释配制好的校正用标准溶液浓度分别为和 2500 ng/ml 未过滤的对照尿样和质控标样 (QC) 也来自 SRL 三种 QC 样品的浓度分别为和 1594 ng/ml 内标在所有样品中的含量均为 500 ng/ml 取每种稀释标物 QC 和实际样品 50 µl, 加入 450 µl 氘代内标 LC/MS 方法 LC 条件 Agilent 1200 系列二元泵脱气机温控多孔板进样器和柱温箱样品针温度 : 10 C 进样清洗 : (50 : 50 甲醇 / 水 )- 冲洗口 3 秒色谱柱 : Agilent ZORBAX XDB-C18, 3.0 mm x 250 mm, 5 µm ( 部件号 : ) 柱温 : 45 C 流动相 ( 等度 ): 90 : 10 的 0.25% 甲酸水溶液 / 甲醇流速 : 0.8 ml/min ; 进样量 : 10 µl 停止时间 : 4 min MS 条件操作模式 : ESI 负离子模式, 使用 Agilent G1948B 离子源喷雾器 : 60 psig 干燥气流速 : 13 L/min 干燥气温度 : 350 C V cap: 3,500 V 多反应监测 (MRM) 及其灵敏度优化设置列于表 1 2

表 1. 使用 6410 QQQ 质谱仪获得的多反应监测 (MRM) 裂解电压碰撞能量驻留时间化合物 MRM 转变 (V) (V) ( 毫秒 ) EtG 定量 221.0 > 85.0 140 12 200 EtG 定性 221.0 > 75.0 EtG D5 226.0 > 85.0 ( 内标 ) 定量 EtG D5 226.0 > 75.0 ( 内标 ) 定性分辨率 (FWHM): Q1 = 0.

3 表 1. 使用 6410 QQQ 质谱仪获得的多反应监测 (MRM) 裂解电压碰撞能量驻留时间化合物 MRM 转变 (V) (V) ( 毫秒 ) EtG 定量 > EtG 定性 > 75.0 EtG D > 85.0 ( 内标 ) 定量 EtG D > 75.0 ( 内标 ) 定性分辨率 (FWHM): Q1 = 0.7amu, Q2 = 0.7amu 此外, 在分析过程中使用空白以表明无残留物质空白由 50 µl 0.1% 甲酸水溶液和 450 µl 内标混合而成用内标溶液将样品和标样稀释 10 倍的方法减少了未过滤尿样中基质对系统的污染量此外, 由于以未过滤尿样进样能引起柱效下降,SRL 推荐每天至少用 100% 有机相冲洗一次色谱柱结果与讨论本文研究得出的校正曲线示于图 2 采用保守的线性数据拟合设置忽略原点且不加权重得到极好的相关系数 (R 2 > 0.999) 三个质控标样的定量准确度分别为 94%(211 ng/ml) 94%(383 ng/ml) 和 98% (1594 ng/ml) 根据进样量(10 µl) 和前面指出的稀释倍数 (1 : 10), 柱上进样量相应的分析范围是 250 pg(250 pg/ml)~ 2.5 ng(2500 ng/ml) 未观察到饱和或非线性发生出色的数据线性拟合 ng/ml ( pg 柱上 ) R 2 > µl 进样量 QC( 三角形表示 ) 的定量准确度 > 94% 图 2. 在 250 ~ 2500 ng/ml 分析范围内具有出色的线性线性曲线拟合设置忽略原点且不加权重根据内标稀释倍数和 10 µl 的进样量, 相应的柱上进样量范围为 250 ~ 2500 pg 3

4 为了验证被测物存在, 使用任一浓度的校正标准溶液测定被测物 EtG 和内标物 EtG-d5 产生的定性离子峰面积离子比值然后将此比值及其 ± 20% 的允许限度应用于所有样品例如, 由于得到的被测物 EtG 的定性离子 / 定量离子离子比值为 84%, 所有定性离子 / 定性离子离子比值必须在 84% 的 ± 20% 之内, 即面积比值范围是 67 ~ 101% 这种做法同样应用于内标物所有处于校正范围之内的定量样品均符合这一标准参见图 3 所有样品的积分结果列于表 2 中注意尿样 1,4 和 8( 样品 1 样品 2 和样品 8 ) 被确定为阴性, 原因是它们计算出来的浓度均在定量限以下, 即低于 250 ng/ml 的截止限度其余七个样品或者落定量离子 EtG ± 20% 允许限量定量离子 / 定性离子叠加定量离子 D5-EtG (IS) ± 20% tolerance 定量离子 / 定性离子叠加图 3. 根据定性离子比值确证 EtG 存在于样品中, 采用的校正标准溶液浓度为 250 ng/ml 根据面积计算值, 定性离子与定量离子归一化叠加后示于图中右侧 4

5 在 250 ~ 2500 mg/ml 的定量范围之内, 或者浓度过高需要稀释后重新分析还要指出, 所有定量值高于 250 ng/ml 的样品, 包括 QC1, 不论是被测物 EtG 还是内标 EtG-d5 均满足定性离子比值为 0.84 ± 20% 的要求如前所述, 质控样品的定量准确度分别为 94%(QC1 和 QC2) 和 98%(QC3) 最后, 只含有内标的空白样品分析结果列于表 2 中, 表明在本分析中不存在明显的残留物质结论在电喷雾负离子化模式下, 能够很好地对化合物 EtG 进行定量分析在所分析范围内的线性相关系数 R 2 > 0.999, 显示本方法具有出色的线性数据采用保守的线性拟合不包括原点且不加权重 QC 样品具有很好的定量准确度 ( 至少为 94%), 并且十个尿样中有七个被确定为阳性所有定量结果高于 250 ng/ml 低限的样品, 不论是被测物 EtG 还是内标 EtG-d5 都符合定量离子离子比值标准本文工作作为示例, 很好地体现了 QQQ 质谱仪利用串联 MS/MS 的特性解决尿样中 EtG 定量并验证其存在的能力表 2. 所有样品的积分结果 EtG D5-EtG 样品类型含量水平实验浓度 RT 计算浓度准确度比值 RT 分别测定比值 Cal Cal Cal Cal Cal 空白 * QC QC QC 空白未检出样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品 * 约为 1% 的残留物质 5

6 更多信息欲了解本公司产品和服务的更多信息, 请访问本公司网址安捷伦对本资料中的错误, 及因使用本资料所引发的相关损失不承担责任本资料中的信息说明和性能指标如有更改, 恕不另行通知安捷伦科技公司,2007 中国印刷 2007 年 8 月 CHCN

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5989-4737CH.qxd 液相色谱 / 质谱 / 质谱 (LC/MS/MS) 法分析血液中的苯二氮类药物应用临床和法医毒理学作者 azel Rivera and G. Stewart Walker Flinders University Adelaide, South Australia Australia Peter Stockham and D. oel Sims