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竹湛
5 years ago
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'& $& 基础研究对肝癌细胞癌基因和表达的影响姬媛媛王志东杨正安王宝太史敏惠博雷妮娜岳卫娜西安交通大学医学部第二附属医院科研中心实验室干四病区普通外科陕西西安 $% 摘要目的观察胰岛素样生长因子 &' 对肝癌细胞 $ 中癌基因和 ()*+ 表达的影响方法培养肝癌细胞株 $ 用 &'!,- 作用 %. 后分别采用细胞免疫荧光 /#+#)!01 法及 #*0# 法检测细胞中和 ()*+ 的表达情况并与对照组比较进行定量分析结果及 ()*+ 蛋白阳性表达主要位于细胞核对照组 &' 组 $ 细胞中荧光表达量分别为. %$()*+ 荧光表达量分别为 %%$% 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中及 ()*+ 蛋白表达明显增强差异有统计学意义与对照组相比 &' 组 $ 细胞中和 ()*+ 的 ( 表达明显增加差异有统计学意义结论 &' 可上调肝癌细胞 $ 中癌基因和 ()*+ 的蛋白及 ( 表达这可能是 &' 促进肝癌细胞增殖的分子机制之一这为临床上肝癌防治提供了新线索关键词胰岛素样生长因子 &' 肝癌增殖 ()*+ 中图分类号 $$ 文献标志码 $%!""#$%" %&&'##%&&# 2&3"*!"*! /('41!, 3('4#!,*! /('5*1* 6&! 7&51-8&(!* 378 /#!* 6#!9 #+#*)#!#):#*)#!19;&'#!#)*06"),#)#6#1! 90*#1+*019*!2*11!,7!#)+#*06#!##!#)*!$%!* ()*)##()*+ #,- #"'!.,,$.#&.-.,,#!.,,$.#" "-" ()* -/%.&+,- #" ' "" --##&*-+,- #" '"#"0 10& -',- #"'"-"0 -,&+,- #" '#"0"#!.,,$.#&,-"#--# +,- #"'" #"0 ()*&&! +, - #" '# #"0 ()* &&-',- #" ' 0 #"0 ()* && ()* #+#,- # "'!.,,$.#"####-& +!, - *( # ()*###-,- #' 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一具有易侵袭转移及复发等特点肝癌的高侵袭转移是导致患者预后不良及临床疗效不佳的关键环节细胞生长增殖是肝癌侵袭转移的始动因素在肝癌发生发展的过程中居于要位癌基因的突变可致其功能异常活化通过促使细胞持续生长增殖继而诱导大量肝细收稿日期修回日期 % 基金项目国家自然科学基金资助项目 (1. 西安交大二院人才培养专项科研基金资助项目 (1''%% 6"1)##(*1!*0(*")*06#!#1"!*1!19!*(1.*!#)+1!!#0)*!!,6#*0##+#*)1"!* 1!19#6#1!90*#1+*019*!2*11!,7!#)+(1''%% 通讯作者王志东 8*0*1 优先出版!!# +#*0$%0$!"#"!

2 期姬媛媛王志东杨正安等 &' 对肝癌细胞 $ 癌基因和 ()*+ 表达的影响胞癌变胰岛素样生长因子!+"0!0#,)1 9*1)&' 作为一种增殖调控因子在细胞分化增殖胚胎的生长发育中发挥着重要的促进作 % 用前期研究已证实 &' 具有刺激肝癌细胞生长增殖的功能然而 &' 与癌基因表达之间的关系目前尚不清楚因此本实验以 &' 作用于人肝癌细胞 $ 观察其对肝癌细胞 $ 中癌基因及 ()*+ 表达的影响进一步明确 &' 对肝癌细胞增殖的作用机制以期为临床上肝癌的防治提供新线索. 材料与方法.. 材料人肝癌细胞株 $ 由复旦大学肝癌研究所提供胎牛血清 56 和 :8 高糖培养基购自美国 01!# 公司 &' 购自美国 6,* 公司 & 裂解液来自北京百泰克生物技术有限公司蛋白酶抑制剂 1*0 购自美国 1# 公司 ( 膜购自美国 01)# 公司化学发光试剂 8- 购自美国 #)# 公司兔抗人 *! 抗体购自美国 )1#!# 公司兔抗人和 ()*+ 抗体购自美国 * 公司羊抗兔 &,' 抗体由陕西先锋生物科技有限公司提供总 ( 提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司逆转录试剂盒 635)#8 #)9# #*0# 试剂盒购自 *<** 宝生物工程有限公司荧光实时定量仪型号为美国 0#51++#+ 6#=!# ()*+ 及 *! 引物由 *<** 宝生物工程有限公司合成./ 细胞培养将人肝癌细胞株 $ 接种在 :8 高糖完全培养基 --56 万 7- 青霉素及,- 链霉素中培养于 $ > --= 的细胞培养箱中每进行次传代选取处于对数生长期的细胞用于后续实验.0 细胞免疫荧光法 $ 细胞弃去培养液加入含 --56 的 :8 高糖完全培养基培养 % 同步化后予以 &'!,- 作用 %. 对照组加入无血清的 :8 培养基采用细胞免疫荧光染色法检测 $ 细胞中 ()*+ 的表达简要步骤如下细胞爬片经 %,- 多聚甲醛溶液固定即用 --)1! 室温!56 冲洗?! 正常山羊血清室温下封闭! 及 ()*+@ %> 孵育过夜 56 冲洗?!& 标记羊抗兔二抗避光常温孵育最后用 :& 复染细胞核实验重复次每组设个复孔用甘油封片使用激光共聚焦显微镜观察并拍照且对荧光染色结果进行定量分析.1-#$#&%$ 检测蛋白表达 &'!,- 刺激 $ 细胞 %. 后弃去培养液冷 56 轻轻漂洗后加入细胞冷裂解液刮下裂解细胞置于 -8#1)9 管中经细胞膜破碎仪反复抽打细胞次后静置于冰上!)!% > 离心! 将上清待测蛋白样品于 > 冰箱内保存实验组对照组的蛋白定量按照 5 蛋白定量试剂盒说明书进行操作 /#+#)!01 检测简要步骤如下待测样品蛋白, 上样经 6:6'8,- 浓缩胶及,- 分离胶电泳半干式电转移法将蛋白转移到 ( 膜上,- 脱脂奶粉封闭液封闭加入一抗兔抗人 ()*+@ 兔抗人内参 *!@%> 孵育过夜 56 冲洗!? % 加入孵育 56 冲洗!?% 立即用 8- 显色利用凝胶图像分析系统曝光蛋白条带对图像进行拍照和定量分析实验重复次每组设个复孔结果表示为 &' 组蛋白表达量正常对照组蛋白表达量.1*#$#* 检测 * 表达按照试剂盒说明操作提取总 ( 使用紫外分光光度计进行 ( 浓度及纯度测定. > 冰箱保存将, 提取总 ( 逆转录合成 :( 具体操作按逆转录试剂盒说明进行取逆转录产物 - 进行 #*0 # 循环扩增其中目的基因的引物序列为上游 A''''''' A 下游 A''''''A 扩增片段为目的基因 ()*+ 引物序列为上游 A'''A 下游 A'''A 扩增片段为 *! 内参的引物序列为上游 A ''''A 下游 A '''''A 扩增片段为.#*0# 扩增程序为预变性 > + 个循环 > +> +% 个循环实验重复次每组设个复孔每个样本做个复管使用 5&#*0# 扩增仪器中的软件求出各样本的值用 B 法计算出实验组基因表达与正常对照组基因表达比较的 10+ 值此外取产物.- 上样于,- 琼脂糖凝胶含溴化乙锭.; 电泳! 利用凝胶图像分析系统进行扫描并拍摄图片结果表示为 &' 组 ( 表达量正常对照组 ( 表达量!"#"!

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3 西安交通大学学报医学版第卷. 统计学分析所有数据均以表示用 )+ 统计软件进行分析数据首先进行了正态性分布和方差齐性检查然后组间两两比较采用 6"#!+ 检验认为差异有统计学意义 / 结果 /1. 明显增加细胞中的荧光表达共聚焦显微镜结果显示 &'!,- 作用于 $ 细胞 %. 后阳性染色为绿色主要定位于细胞核其在细胞质中未见表达而 :& 将细胞核染为蓝色绿色和蓝色可以完全重合进而说明在细胞核表达对照组 &' 组 $ 细胞中荧光表达量分别为.%$ 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中荧光表达量明显增强差异有统计学意义 C% 图图. 共聚焦显微镜观察对肝癌细胞中的荧光表达,&' +,!9*!0!)#*+##"!190"1)#+#! #)#++1!19! $ #0+ 与对照组比较 /1/ 明显增加细胞中荧光表达共聚焦显微镜结果显示 &'!,- 作用于 $ 细胞 %. 后 ()*+ 阳性染色为绿色主要定位于细胞核其在细胞质中未见表达而 :& 将细胞核染为蓝色绿色和蓝色可以完全重合进而说明 ()*+ 在细胞核表达对照组 &' 组 $ 细胞中 ()*+ 荧光表达量分别为 %%$% 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中 ()*+ 荧光表达量明显增强差异有统计学意义 C% 图 /10 上调细胞中和蛋白表达 /#+#)! 01 检测对照组 &' 组 $ 细胞中蛋白相对表达量分别为 %()*+ 蛋白相对表达量分别为 % 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中和 ()*+ 蛋白表达量明显增加差异有统计学意义 CC 图!"#"!

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4 期姬媛媛王志东杨正安等 &' 对肝癌细胞 $ 癌基因和 ()*+ 表达的影响 $ 图 / 共聚焦显微镜观察对肝癌细胞中的荧光表达,&' +,!9*!0#!*!##"!190"1)#+#! #)#++1!19()*+! $ #0+ 与对照组比较 /1 上调细胞中 * 水平 #*0# 检测对照组 &' 组 $ 细胞中 ( 相对表达量分别为.% 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中 ( 表达量明显增加差异有统计学意义 C 图 % /1 上调细胞中 * 水平 #*0# 检测对照组 &' 组 $ 细胞中 ()*+ ( 相对表达量分别为 % 与对照组相比 &' 组 $ 细胞中 ()*+( 表达量明显增加差异有统计学意义 C% 图图 0-#$#&%$ 检测肝癌细胞中和蛋白表达,8)#++1!+19 *!()*+!$ #0+ ### /#+#)!01 与对照组比较 0 讨论目前研究认为癌细胞的恶性转化是一个由细胞外多种促生长因子激活细胞内信号转导通路的异常活化使得癌细胞内多种癌基因或者抑癌基因表达异!"#"!

. 西安交通大学学报医学版第卷程中亦发挥重要作用在转基因鼠化学诱癌鼠等动物模型以及肝炎病毒慢性感染的肝组织中获得证 $ 实此外我们前期实验研究也发现不同浓度的 &'!,- 作用于肝癌细胞 $ 不同时间点 %%.$ 后对 $ 细胞的生长增殖有一定的促进作用因此本实验以 &'!,- 刺激人肝癌细胞 $%.

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其可以导致肝细胞不断生长增殖而使细胞最终发生癌变新近研究发现增殖相关基因的活化与大量肝细胞的癌变关系密切并且其还直接参与诱导肝细胞癌前病变过程的形成目前认为生长因子 &' 在肝细胞的癌变过 *0# 等方法从蛋白及 ( 水平对 $ 中及 ()*+ 的表达进行定性定位及定量分析结果表明 &' 可明显上调 $

殖的调控中发挥着重要作用以前的研究发现蛋白在肝癌组织中呈现出高度表达而在癌旁组织中呈现出低表达在正常肝组织中则表达更少进一步的研究还显示的蛋白表达与肝癌患者的年龄性别肿瘤大小及分化程度无关而与肝癌的侵袭转移高度相关提示的表达增强与肝癌的发生发展关系密切可以作为判断肝癌是否发生转移的指标之一

5 . 西安交通大学学报医学版第卷程中亦发挥重要作用在转基因鼠化学诱癌鼠等动物模型以及肝炎病毒慢性感染的肝组织中获得证 $ 实此外我们前期实验研究也发现不同浓度的 &'!,- 作用于肝癌细胞 $ 不同时间点 %%.$ 后对 $ 细胞的生长增殖有一定的促进作用因此本实验以 &'!,- 刺激人肝癌细胞 $%. 进一步观察其对肝癌细胞 $ 中癌基因及 ()*+ 表达的影响进而明晰相关分子机制本研究利用细胞免疫荧光 /#+#)!01 及 # 图 *#$#* 检测对肝癌细胞中 * 表达变化,%&' ")#,"0*##(#)#++1!19! $ #0+ 与对照组比较图 *#$#* 检测对肝癌细胞中 * 的表达变化,&' ")#,"0*##(#)#++1!19()*+! $ #0+ 与对照组比较常继而促进癌细胞异常增殖的多步骤多阶段的复杂过程癌基因在调控肿瘤细胞的增殖过程中发挥着重要作用而癌基因突变被认为是肝癌细胞增殖的分子基础常见的肿瘤癌基因有转化基因 ( )*+ 增殖相关基因等其中转化基因 ( )*+ 被认为是肝癌中最早发现的恶性转化基因其可以导致肝细胞不断生长增殖而使细胞最终发生癌变新近研究发现增殖相关基因的活化与大量肝细胞的癌变关系密切并且其还直接参与诱导肝细胞癌前病变过程的形成目前认为生长因子 &' 在肝细胞的癌变过 *0# 等方法从蛋白及 ( 水平对 $ 中及 ()*+ 的表达进行定性定位及定量分析结果表明 &' 可明显上调 $ 细胞中癌基因及 ()*+ 蛋白及 ( 表达说明 &' 信号通路与及 ()*+ 癌基因的表达途径上有交汇点可以相互促进而癌基因的过度表达又可进一步导致肝癌发生发展基因是基因家族的成员之一作为原癌基因其编码的蛋白质属于核内转录因子介导细胞外向细胞核内生物信号转导在细胞凋亡和细胞增. 殖的调控中发挥着重要作用以前的研究发现蛋白在肝癌组织中呈现出高度表达而在癌旁组织中呈现出低表达在正常肝组织中则表达更少进一步的研究还显示的蛋白表达与肝癌患者的年龄性别肿瘤大小及分化程度无关而与肝癌的侵袭转移高度相关提示的表达增强与肝癌的发生发展关系密切可以作为判断肝癌是否发生转移的指标之一与肝癌患者的预后密切相关研究证实 ()*+ 原癌基因通过 ' 蛋白偶联受体信号转导通路发挥生物学效应其表达异常被认为是肝癌发生恶性转化较早的分子表达变化其表达水平随肝癌的恶性分化程度而逐渐增强并且 ()*+ 基因的表达水平增高还为癌变的肿瘤细胞提供了良 % 好的生长环境此外研究报道和 ()*+ 基因的表达水平增高还与肝细胞的增殖调控失衡以及肝癌进展密切相关 &' 被认为是多种肿瘤细胞重要的自分泌生长因子其过度表达具有明显的促进细胞增殖及细胞恶性转化的作用本实验结果显示 &' 作用时癌基因 ()*+ 表达上调提示可能是 &' 促进肝癌细胞增殖的分子机制之一亦为临床上肝癌的防治提供了一些新线索参考文献 /('))/$2&!- # ##&,#2!"%%!"#"!

6 期姬媛媛王志东杨正安等 &' 对肝癌细胞 $ 癌基因和 ()*+ 表达的影响 $& $'3$'))$''&$+"#- "-###-#" -&#/%$%& 于秀石关媛媛田菊霞 & 肝癌发生的相关分子机制研究进展 & 健康研究 & %14'),.$(4. 3.$(,!& #- -- #0 "#"-## #-&$#$$...&.,1'),!$& - --#-" ' 0- #- ## - -"## ##-+*! "0+! $"#! #&...%& ( 11'),&!#0 3"#! #######& 2#- 2,--%$$& $ 陆园园姚登福吴信华等 & 肝癌及癌旁组织 ()*( 受体表达及.$.(..3!! '!2!&.- ### &(#%%.& /('*(')5.4')$&#+- #'$%%-#0 #! # -###-&,#,(% %.& 张艳程旭芳黄刚等 & 新型核苷类似物 *', 对 6 细胞增殖凋亡和 2#!,- # 表达的影响 & 郑州大学学报医学版 %.%%%%& 杨闯魏振彤郑宇等 & 肝癌中 2#2+ 和,- # 基因的表达及其临床意义 & 中国老年学杂志 %%& 李莉刘利锋武彦宁等 & 肝癌组织中,- # 基因突变的研究 & 临床荟萃.$$.& 4!($.(24!& -####-& $" %.& %/ /( 7*)%4,&'- "+-### -&1").%$& 杨季红程树杰 &()* 和. 与肿瘤关系的研究进展 & 河临床病理学特征 & 南通大学学报医学版.. 北医药..& $& 编辑国荣 %2&%"3#2$& 被收录为中国科学引文数据库 ( 来源期刊 21")!*019*)*#"*0!*0++2 药物分析学报创刊于年是由国家教育部主管西安交通大学主办的国内外公开发行专业英文学术期刊双月刊 2 主要集中反映与药品质量用药安全和分析方法等相关的最新研究成果主要报道中药药材成药方剂注射剂分析药物复杂体系分析生物技术药物质量控制技术与方法药物体内作用过程分析药物发现过程中的定量与定性分析分子药理学中的示踪分析生物药剂学中的定量分析临床检验与生物分析等栏目设有 ##=),!*0)0#+ 和 61)1"!*1! 2 自年起由全球最大的科技与医学文献出版发行商爱思唯尔 80+##) 出版采用 886 投稿平台实现了投稿采编网络化作者和同行评议国际化 2 发表的全部论文将在线向全球读者开放免费下载阅读 2 目前已被 61"+ 荷兰医学文摘美国化学文摘美国国际药学文摘波兰哥白尼索引美国剑桥科学文摘等国际数据库收录依据文献计量学的理论和方法通过定量与定性相结合的综合评审于近期 /4. 年月被中国科学引文数据库 ( 收录为来源期刊目前正在接受 ( 的评审欢迎从事药物分析相关研究的专家学者和研究生踊跃投稿所有在 2 发表的论文暂一律免收版面费杂志主页 #0+##)101*#* 投稿网址 ##+#0+##)12!*1 )#.%!"#"!

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽