114 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 (P<0.05).Conclusion:ThecombinationwithtransfectionofZIC1geneandcurcuminworkedmostef fectivelyinbreastcanermda MB 231celproli

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1 第 26 卷第 2 期 2016 年 3 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.26 No.2 Mar.2016 ZIC1 基因转染联合姜黄素对人乳腺癌细胞生物学行为的影响史春桃 1, 于民 1, 汪华兵 1, 韩玮 1, 曹方 2 2, 丁厚中 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 ;2. 江苏大学附属昆山医院普外科, 江苏昆山 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 ZIC1 基因转染联合姜黄素对人乳腺癌 MDA MB 231 细胞生物学行为的影响方法 : 将慢病毒载体 plv Zic1 PGK Puro 稳定转染人乳腺癌 MDA MB 231 细胞, 通过蛋白质印迹法检测转染后 MDA MB 231 细胞 ZIC1 蛋白的表达水平通过 MTT 法检测抑制率在 50% 左右的姜黄素浓度, 并作为后续实验的标准加药浓度以 ZIC1 空载不加姜黄素为对照组, 空载加姜黄素转染不加姜黄素及转染加姜黄素为实验组, 以 MTT 法检测 ZIC1 姜黄素及 ZIC1 联合姜黄素对 MDA MB 231 细胞黏附的影响 ; 用划痕实验检测各组细胞的迁移能力 ; 用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率结果 : 乳腺癌细胞转染 ZIC1 质粒后,ZIC1 蛋白呈阳性表达, 而转染空载体细胞中 ZIC1 蛋白表达阴性细胞增殖抑制率在 50% 左右的姜黄素浓度为 5mg/L, 以此作为标准加药浓度与对照组比较, 转染组姜黄素组及转染联合姜黄素组乳腺癌 MDA MB 231 细胞增殖受到明显抑制, 凋亡率明显增高 ( 均 P<0.05) 其中,ZIC1 转染联合姜黄素对细胞增殖的抑制及凋亡诱导作用更明显 (P<0.05) 结论:ZIC1 基因与姜黄素对乳腺癌的抑制存在协同作用 [ 关键词 ] ZIC1; 姜黄素 ; 乳腺癌 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] R73 36 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2016) DOI: /j.isn y InfluenceofZIC1genecombinedwithcurcuminonbiologicalbehaviorof humanbreastcancermda MB 231cel SHIChun tao 1,YUMing 1,WANGHua bing 1,HANWei 1,CAOFang 2,DINGHou zhong 2 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.DepartmentofGeneralSurgery,KunshanHospitalAfiliatedto JiangsuUniversity,KunshanJiangsu215300,China) [Abstract] Objective:ToinvestigatetheinfluenceofZIC1genecombinedwithcurcuminonbiological behaviorofhumanbreastcancercelmda MB 231.Methods:LentivirusvectorpLV Zic1 PGK Purowas constructedandtransfectedstablyintomda MB 231cel,Westernblotingwereappliedtodetecttheex presionofzic1proteininstablytransfectedmda MB 231cel.Forthefolowingexperiments,MDA MB 231celwithnoZIC1emptyvectorthatweaddingcurcuminwasdefinedascontrolgroup,andthegroupsof emptyvectorwithaddingcurcumin,zic1vectorwithnocurcumin,zic1vectorwithaddingcurcuminwere usedasexperimentgroup.mttasaywasusedtodetecttheefectofcurcumin(variousconcentration)on celproliferation,thestandardconcentrationofcurcuminwasusedinceladhesionexperimentandcelmi grationexperimentwheninhibitionratiowas50%,thetwoexperimentswereappliedtodetectdiferencesof celadhesionrateandmigrationability.celapoptosiswasthentestedbyfcm asay.results:expresion ofzic1proteinwerepositiveinexperimentgroup.thecurcuminconcentrationwas5mg/lwheninhibition ratiowas50%.comparedwithcontrolgroup,zic1,curcumin,combinationwithzic1andcurcumingroups showedmarkedlycelproliferationrepresionandapoptosisinduction(bothp<0.05).andthen,compared withthegroupsofemptyvectorwithaddingcurcumin,zic1vectorwithnocurcumin,theefectofexperi mentgroup(addingcurcumin)forcelproliferationrepresionandapoptosisinductionwasmoreobvious [ 作者简介 ] 史春桃 (1989 ), 男, 硕士研究生 ; 丁厚中 ( 通讯作者 ), 教授, 硕士生导师,E mail:dinghouzhong@163.com

2 114 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 (P<0.05).Conclusion:ThecombinationwithtransfectionofZIC1geneandcurcuminworkedmostef fectivelyinbreastcanermda MB 231celproliferationrepresionandapoptosisinduction,soZIC1gene andcurcuminmaybehassynergisticefectontumor suppresor. [Keywords] ZIC1gene;curcumin;breastcancer;celproliferation;celapoptosis ZIC1 又称小脑锌指结构 1, 是 ZIC 家族中的重要成员, 在肝癌结直肠癌胃癌及甲状腺癌等多种恶性肿瘤中起抑制作用 [1-5] 国内已有 ZIC1 基因可显著抑制乳腺癌细胞增殖的相关报道 [6], 其抑癌作用主要受 PI3K/Akt MAPK Shh Wnt/β catenin 等相关信号通路调控 [5,7] 姜黄素作为一种天然化合物, 广泛存在于姜黄莪术郁金菖蒲等多种植物的根茎中姜黄素具有抗恶性细胞增生抗炎以及促细胞凋亡等生物学活性, 对乳腺癌有明显疗效 [8] 其作用主要通过抑制 NF κb EGFR Wnt 以及 Akt/mTOR 等信号通路上相关靶基因的活性而发挥 [9-10] 目前, 关于 ZIC1 基因联合姜黄素在抗乳腺癌过程中的作用及相关机制尚不清楚因此, 本文就姜黄素联合 ZIC1 对乳腺癌 MDA MB 231 细胞增殖及凋亡的影响进行探讨 1 材料与方法 1.1 细胞株与试剂人乳腺癌 MDA MB 231 细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心细胞培养基 DMEM( 高糖 ), 胎牛血清 (FBS), 青霉素链霉素双抗溶液, 磷酸缓冲生理盐水 (PBS), 胰蛋白酶及无血清培养基 (Opti MEM) 均为 Gibco 公司产品 ; 嘌呤霉素姜黄素以及二甲基亚砜 (DMSO) 均为 Sigma 公司产品 ;Matrigel 胶 (BD 公司 ) ZIC1 慢病毒质粒 plv Zic1 PGK Puro 由武汉巴菲尔公司构建包装 ; Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 ),DL2000DNA 标准参照物 ExTaq TM (TaKaRa 公司 ), 抗人 ZIC1 多克隆抗体 (SantaCruz 公司 ),HRP 标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司,BCA 蛋白测定试剂盒 RIPA 裂解液购自碧云天生物技术研究所,ZIC1 引物和 GAPDH 内参引物由上海生工生物工程公司合成 1.2 方法分组方案先将乳腺癌 MDA MB 231 细胞分别转染空载体和 ZIC1 质粒, 并进行荧光显微镜下观察及蛋白质印迹法检测 ZIC1 表达然后加入标准浓度姜黄素 ( 即 MTT 筛选出来的最接近 50% 抑制率的有效浓度 ), 并以此标准浓度为基准, 结合转染将 MDA MB 231 细胞分为对照组 ( 空载不加药 ) 空载加药组转染组及转染加药组再进行后续细胞黏附划痕迁移力及流式细胞凋亡实验慢病毒载体 plv Zic1 PGK Puro 转染人乳腺癌 MDA MB 231 细胞转染前 24h 将处于对数生长期的细胞用胰酶消化, 按 / 孔的细胞密度接种于 24 孔板内,37 培养至细胞密度为 50% 时, 用聚凝胺 (10μg/mL) 介导慢病毒转染 MDA MB 231 细胞, 按慢病毒液试剂说明书进行操作转染 48h 后, 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白 (green fluorescentprotien,gfp) 的表达分布传代后, 换用含有嘌呤霉素 (8μg/mL) 的培养液加以筛选, 得到稳定传代的细胞克隆蛋白质印迹法检测转染后 MDA MB 231 细胞 ZIC1 蛋白的表达收集稳定转染的细胞, 按照细胞质蛋白提取试剂盒操作, 提取胞内蛋白, 经分光光度计定量, 取 50μg 蛋白上样进行 12% SDS PAGE, 转移至 PVDF 膜, 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST( 封闭液 ) 室温摇床封闭 2h 加封闭液稀释的 ZIC1 一抗 (1 200),4 孵育过夜 TBST 充分洗涤 PVDF 膜 5~6 次,5min/ 次, 加封闭液稀释的 HRP 标记的二抗 ( ), 室温摇床孵育 2h TBST 充分洗涤 PVDF 膜 5~6 次,5min/ 次滴加 ECL 底物液, 曝光, 显影以 GAPDH 作为内参对照 MTT 法检测不同浓度姜黄素对细胞增殖的影响先将转染空载体的 MDA MB 231 细胞提前种于 6 孔板, 并用 1,2.5,5,10 和 20mg/L 的姜黄素处理细胞 48h, 用 0.25% 胰酶处理对数生长期细胞, 分别收集计数并调整细胞密度为 /ml,96 孔板每孔加入 100μL 细胞悬液, 同时设空白组及未给药组, 每个组设置 5 个复孔,37,5%CO 2 继续培养 24h, 小心吸出孔内液体, 加入预先配置混匀的含 MTT 的 DMEM100μL(DMEM MTT=90μL 10 μl), 在 96 孔板上未加入细胞悬液处再设 5 个复孔, 并加入此含 MTT 的 DMEM 每孔 100μL,37, 5%CO 2 继续培养 4h 小心吸出孔内液体, 每孔加入 150μLDMSO, 室温低速振荡 10~15min, 使紫色结晶充分溶解, 酶标仪测定在 570nm 波长处各孔光密度值 (D) 用同样方法处理转染 ZIC1 质粒细胞抑制率 =1-( 给药组 D 值 - 空白 D 值 )/( 未给药组

第 2 期史春桃, 等.ZIC1 基因转染联合姜黄素对人乳腺癌细胞生物学行为的影响 115 D 值 - 空白 D 值 ) 100% 选取细胞抑制率最接近 50% 的姜黄素浓度, 作为后续实验的标准浓度 1.2.5 MTT 法检测各组 MDA MB 231 细胞的黏附率将转染空载体的对数生长期 MDA MB 231 细胞接种到 6 孔板, 细胞密度为 5 10 5 /ml, 放入 37,5% 的

37,5%CO 2 培养箱中活化, 将细胞悬液 100μL 加入 96 孔板内, 使密度为 2 10 4 / 孔, 继续培养 1h 后弃上清液,PBS 洗 2 遍, 加入 100 μl 培养基和 20μLMTT 置于培养箱培养 6h 之后, 吸去上清液, 加入 DMSO150μL/ 孔, 振荡 10 min, 用酶标仪在 492nm 处测定 D 值用同样方法处理转染 ZIC1 质粒的细胞

3 第 2 期史春桃, 等.ZIC1 基因转染联合姜黄素对人乳腺癌细胞生物学行为的影响 115 D 值 - 空白 D 值 ) 100% 选取细胞抑制率最接近 50% 的姜黄素浓度, 作为后续实验的标准浓度 MTT 法检测各组 MDA MB 231 细胞的黏附率将转染空载体的对数生长期 MDA MB 231 细胞接种到 6 孔板, 细胞密度为 /ml, 放入 37,5% 的 CO 2 培养箱过夜, 待其长至 70% ~80% 时, 用 Opti MEM 作用细胞 18h 使之同步化后, 取出 6 孔板, 加入 2mL 标准浓度的姜黄素, 放入 37,5% CO 2 培养箱培养处理 48h PBS 清洗 2 遍, 并收集细胞提前将 Matrigel 胶用基本培养基以 1 4 稀释, 并平铺至 96 孔板内, 体积为 30μL/ 孔, 室温过夜, 并于实验当天放入 37,5%CO 2 培养箱中活化, 将细胞悬液 100μL 加入 96 孔板内, 使密度为 / 孔, 继续培养 1h 后弃上清液,PBS 洗 2 遍, 加入 100 μl 培养基和 20μLMTT 置于培养箱培养 6h 之后, 吸去上清液, 加入 DMSO150μL/ 孔, 振荡 10 min, 用酶标仪在 492nm 处测定 D 值用同样方法处理转染 ZIC1 质粒的细胞细胞黏附率 =( 各组平均 D 值 / 对照组平均 D 值 ) 100% 划痕实验检测各组细胞的迁移能力提前在 6 孔板背面用记号笔画平行线, 保证每孔至少 6 横取转染空载体的对数生长期 MDA MB 231 细胞, 制成密度为 /ml 的细胞悬液, 接种于 6 孔板内, 放入 37,5%CO 2 培养箱内过夜, 待细胞生长至 70% ~80% 后, 用 Opti MEM 作用 18h 使细胞同步化取出 6 孔板, 放在超净台上, 用 1mL 枪头在底部画线, 吸净培养液, 并用 PBS 洗 2 遍, 加入标准浓度的姜黄素作用 0,24,48 和 72h 后, 在 400 倍显微镜下观察并拍照测量划痕宽度, 每条 3 次取平均值同样方法处理转染 ZIC1 质粒细胞细胞迁移相对距离 =1- 划痕后不同时间宽度 / 初始宽度流式细胞术检测各组细胞的凋亡率用不含 EDTA 的 0.25% 胰酶消化转染空载体 48h 后的 MDA MB 231 细胞, 终止消化后收集细胞悬液, 1500r/min, 离心 5min, 弃上清液, 加 PBS 重悬, 润洗细胞 2 次,1500r/min 离心 5min 按照 Annex inv FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行 : 加入 500μL 结合缓冲液, 重悬细胞,5μLAnnexinV FITC 混匀后加入 5μLPI, 混匀, 室温避光反应 5~ 15min, 然后在流式细胞仪上机进行检测细胞凋亡率用同样方法处理其他 3 组细胞 1.3 统计学处理实验数据以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 所有数据均应用 SPSS16.0 软件进行统计学分析, 组间差异采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 ZIC1 基因转染结果转染后 ZIC1 的表达 ZIC1 慢病毒表达载体 plv Zic1 PGK Puro 转染乳腺癌 MDA MB 231 细胞 48h 后, 可以检测到绿色荧光蛋白, 转染率达 90%, 见图 1 图 1 荧光显微镜下转染 plv Zic1 PGK Puro 的 MDA MB 231 细胞 ( 100) 乳腺癌细胞 ZIC1 蛋白的表达蛋白质印迹结果显示,ZIC1 蛋白在转染细胞中均有表达, 而在空载细胞中均无表达, 见图 2 ZIC1 GAPDH 图 2 转染后 MDA MB 231 细胞 ZIC1 蛋白的表达 2.2 姜黄素对人乳腺癌细胞的细胞毒作用首先选择了 5 个浓度梯度的姜黄素 (1,2.5,5, 10,20mg/L) 作用于空载组与转染组 48h 结果发现姜黄素对两组细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖性, 并且浓度为 5mg/L 的姜黄素作用于空载组转染组 48h 后抑制率在 50% 左右 ( 分别为 51.89% 和 49.20%) 于是选取 5mg/L 的姜黄素作为下面实验的标准加药浓度见图 3 (%) (mg/l) 图 3 不同浓度姜黄素作用乳腺癌细胞 48h 后的细胞抑制率

116 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 2.3 各组乳腺癌细胞的黏附率 MTT 法检测结果显示, 与对照组比较, 转染 ZIC1 基因或是加入 5mg/L 姜黄素, 均能够明显抑制 MDA MB 231 细胞的黏附率 ( 均 P<0.05), 且转染 ZIC1 联合姜黄素对细胞黏附的抑制作用明显强于单独转染组或空载加药组 (P<0.05) 见图 4 2.

4 116 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 2.3 各组乳腺癌细胞的黏附率 MTT 法检测结果显示, 与对照组比较, 转染 ZIC1 基因或是加入 5mg/L 姜黄素, 均能够明显抑制 MDA MB 231 细胞的黏附率 ( 均 P<0.05), 且转染 ZIC1 联合姜黄素对细胞黏附的抑制作用明显强于单独转染组或空载加药组 (P<0.05) 见图各处理组对人乳腺癌细胞迁移的影响划痕实验结果显示, 各组细胞的迁移距离随着时间的延长而增加 ; 同一时间 MDA MB 231 细胞迁移的距离, 转染不加药组空载加药组及转染加药组均比空载不加药的对照组明显缩短 ( 均 P<0.05) 因此,ZIC1 基因姜黄素以及两者联合作用均能抑制 MDA MB 231 细胞的迁移能力, 存在着时间依赖性, 并且两者联合效果更为明显见图 5, 图 6 (%) :P<0.05, 与对照组比较 ;#:P<0.05, 与空载加药转染组比较图 4 各处理组乳腺癌细胞的黏附率 # 0 h 24 h 48 h 72 h 图 5 各组乳腺癌细胞不同时间的迁移 ( 400) (%) # # # # # 1.33)%] 和转染组 [(5.41±1.43)%];3 组 ( 空载加药组, 转染组及转染加药组 ) 的细胞凋亡率均明显高于空载不加药的对照组 [(2.49±0.83)%, 均 P<0.05] 见图 7 3 讨论 t(h) :P<0.05, 与 0h 比较 ;#:P<0.05, 与同时点对照组比较图 6 各处理组人乳腺癌细胞的迁移距离 2.5 各组乳腺癌细胞的凋亡率流式细胞凋亡结果显示, 转染加药组凋亡率为 (15.17±1.17)%, 明显高于空载加药组 [(7.34± 本研究结果显示,ZIC1 姜黄素及 ZIC1 联合姜黄素对乳腺癌 MDA MB 231 细胞有生长抑制及诱导凋亡作用, 且 ZIC1 联合姜黄素作用最为明显, 提示 ZIC1 基因与姜黄素在抑癌作用方面可能存在协同作用, 由此我们推测 ZIC1 及姜黄素在抑癌作用发挥过程中可能存在相关作用机制及信号通路上的关联性

5 第 2 期史春桃, 等.ZIC1 基因转染联合姜黄素对人乳腺癌细胞生物学行为的影响 117 图 7 各组乳腺癌细胞的凋亡率 [11] ZIC1 基因最早由 Aruga 等于 1994 年在成年鼠的小脑中发现, 因小脑颗粒细胞里大量表达锌指蛋白而得名近年来的研究表明,ZIC1 基因与多种肿瘤包括脑膜瘤肝癌结直肠癌胃癌及甲状腺癌等的发生发展密切相关, 尤以对肿瘤发生过程中相关信号通路起调控作用为显著 [2-5,12] [5] Zhong 等在研究中证实 ZIC1 基因能够抑制胃癌 AGS MKN28 BGC823 及 SGC7901 细胞的增殖及迁移能力, 还通过蛋白质印迹法检测 PI3K/Akt 通路在胃癌中的作用, 并发现过表达的 ZIC1 能够抑制 p Akt 的表达, 从而推断该信号通路在 ZIC1 调节胃癌细胞生 [13] 物学行为方面起到重要作用 Aruga 等研究显示 ZIC1 可通过降低细胞周期蛋白 D1 表达, 从而增强有丝分裂抑制蛋白 p27 p16 的表达, 尤其 Wnt7a 的表达, 从而通过调节 Wnt 通路抑制脑肿瘤细胞的增殖本实验结果与以上报道结果中姜黄素对肿瘤细胞增殖及迁移能力的抑制作用相一致此外,ZIC1 基因在肿瘤发生中的分子调控机制还包括 BMP Shh 等信号通路 [7] 姜黄素是一种酸性多酚类物质, 为二酮类化合物 [14] 姜黄素的抗肿瘤活性于 1985 年由印度学者 [15] Kutan 等首次提出, 其作用发挥受细胞内外多种 [16] 途径及信号分子调控 Wong 等研究发现姜黄素对子宫平滑肌肉瘤 SKN SK UT 1 细胞有增殖抑制及诱导凋亡作用, 并通过蛋白质印迹法检测 AKT mtor 信号通路, 发现 p mtor 表达下调, 从而推断该信号通路在姜黄素调节子宫平滑肌肉瘤细胞生物 [16-17] 学行为方面有重要意义另外,Sun 等研究发现, 姜黄素通过抑制 PI3K/Akt 信号通路中相关蛋白如 mtor 及 NF κb 等诱导腺样囊性癌细胞凋亡 [18] Xu 等的实验显示姜黄素对肝细胞癌细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用, 呈现一定的时间和剂量依赖性,β 连环蛋白表达下调, 说明姜黄素通过抑制 β 连环蛋白的活性调控 Wnt 信号通路本实验结果与以上实验结果中姜黄素对肿瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导的影响一致另外, 姜黄素诱导细胞凋亡的主要信号途径还包括线粒体 / 内质网途径 MAPK NF κb p53 等信号转导途径 [19] 综上可见,ZIC1 与姜黄素对肿瘤发生发展的影响存在共同的信号通路 PI 3 K/Akt 及 Wnt 通路由此我们认为,ZIC1 基因联合姜黄素在抑癌作用方面存在的协同作用与两者相关信号通路存在交叉重叠有关 [ 参考文献 ] [1] WangN,RenD,DengS,etal.Diferentialefectsofba icaleinanditssulfatedderivativesininhibitingprolifera tionofhumanbreastcancermcf 7cels[J].ChemBiol Interact,2014,221: [2] WangYY,JiangJX,MaH,etal.RoleofZIC1methy lationinhepatocelularcarcinomaanditsclinicalsignifi cance[j].tumourbiol,2014,35(8): [3] SohnSH,ChoK,BaeH,etal.Screeningforherbal medicinesthatafectzic1genemethylationincolorectal cancer[j].molceltoxicol,2013,9(3): [4] QiangW,ZhaoY,YangQ,etal.ZIC1isaputative tumorsuppresorinthyroidcancerbymodulatingmajor signalingpathwaysandtranscriptionfactorfoxo3a[j]. J Clin Endocrinol Metab,2014, 99(7):E1163 -E1172. [5] ZhongJ,ChenS,XueM,etal.ZIC1modulatescel cycledistributionsandcelmigrationthroughregulation ofsonichedgehog,pi 3 KandMAPKsignalingpathways ingastriccancer[j].bmccancer,2012,12:290. [6] 李鹏飞, 王杰锋, 曹方, 等.ZIC1 基因在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌 MDA MB 231 细胞增殖的影响 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2015,25(1):53-56,61. [7] 钟菁, 王良静.Zic 基因在肿瘤发生中的作用和分子调控 [J]. 实用肿瘤杂志,2011,26(6): [8] 何静. 姜黄素对乳腺癌 MCF 7 细胞增殖侵袭性及 VEGF C 表达的影响 [D]. 南昌 : 南昌大学,2011. [9] LinJK.Moleculartargetsofcurcumin[J].AdvExp MedBiol,2007,595: [10] KimHJ,ParkSY,ParkOJ,etal.Curcuminsuppreses

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot