蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 等 763 Results: BUF and DOX showed inhibitory effect on the A549 cells in a dose and time-dependent manner. Compared

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璋召阎
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762 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(7) http://www.csumed.org DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2017.07.004 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/201707762.

1 762 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(7) DOI: /j.issn 蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 付丽娜 ( 黄河科技学院医学院药学教研室, 郑州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨天然药物蟾蜍灵阿霉素以及两者联用对非小细胞肺癌 A549 细胞增殖凋亡和细胞周期的影响方法 : 采用四甲基偶氮唑盐 (methyl thiazolyl tetrazolium,mtt ) 法观察蟾蜍灵阿霉素以及两者联用对 A549 细胞增殖的影响 ; 采用赫斯特 (Hoechst 33342) 染色法观察细胞核形态变化 ; 采用流式细胞仪检测蟾蜍灵阿霉素以及两者联用对 A549 细胞凋亡和细胞周期的影响 ; 采用 Western 印迹检测凋亡蛋白的表达结果 : 蟾蜍灵和阿霉素单独用药均能抑制 A549 细胞的增殖, 且呈剂量与时间依赖关系 ; 与蟾蜍灵和阿霉素单独用药相比,1,20,100 nmol/l 蟾蜍灵分别与 1.0 μg/ml 阿霉素联合作用 A549 细胞 24,48,72 h 的抑制率显著升高 ( 均 P<0.05) 蟾蜍灵和阿霉素均可在一定程度上诱导细胞凋亡, 两药联用后诱导细胞凋亡作用显著增强蟾蜍灵和阿霉素联用可将细胞周期阻滞在 S 期, 并上调凋亡蛋白 caspase-3 的表达结论 : 蟾蜍灵联合阿霉素可显著抑制 A549 细胞的增殖, 其抗肿瘤的机制可能与诱导细胞凋亡细胞周期 S 期阻滞及凋亡蛋白 caspase-3 的上调有关 [ 关键词 ] 蟾蜍灵 ; 阿霉素 ; 人非小细胞肺癌 A549 细胞 ; 凋亡 Effects of bufalin combined with doxorubicin on the proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line A549 in vitro ZHANG Cuili, FU Li na ( Department of Pharmacy, Medical School, Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou , China ) ABSTRACT Objective: To explore the effects of bufalin (BUF) combined with doxorubicin (DOX) on the proliferation and apoptosis in human lung cancer cell line A549 in vitro. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to measure the inhibitory effects of BUF, DOX and their combination on the growth of A549 cells. Hoechst staining was used to observe the changes of nucleus. Flow cytometry was used to investigate the apoptosis and cell cycle distribution of A549 cells. Western blot was used to examine the expression of apoptotic protein. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 张翠利, zhangcuilicai@sina.com 通信作者 (Corresponding author): 张翠利, zhangcuilicai@sina.com 基金项目 (Foundation item): 郑州市科技攻关项目 ( ) This work was supported by the key Project of Zhengzhou Science and Technology, China ( ).

2 蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 等 763 Results: BUF and DOX showed inhibitory effect on the A549 cells in a dose and time-dependent manner. Compared with BUF or DOX alone, combination of BUF (1, 20, 100 nmol/l) with DOX (1.0 μg/ml) could significantly increase the growth inhibition rate of A549 cells at 24, 36, 72 h, respectively (all P<0.05). BUF and DOX alone could induce apoptosis, and their combination could significantly increase the apoptosis ratio. In addition, BUF combined with DOX could block the cell stage of A549 cells, keep the cell stage stay in S stage and up-regulate the expression of caspase-3. Conclusion: BUF combined with DOX can significantly inhibit the proliferation of A549 cells, which might be related to the induction of apoptosis, cell cycle S phase arrest and caspase-3 upregulation. KEY WORDS bufalin; doxorubicin; human lung cancer cell line A549; apoptosis 非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 是一种恶性肿瘤, 约占肺癌总数的 4/5 [1] 目前临床上治疗 NSCLC 患者的主要手段仍然是化学治疗 ( 化疗 ) [2-4] 但在肿瘤治疗过程中, 发现常用抗肿瘤药物的临床疗效有限, 且存在一些毒副作用, 严重影响了肿瘤患者的化疗效果 [5-6] 因此, 寻找一种新的治疗手段成为近年来肿瘤研究的一个重要方向阿霉素 (doxorubicin,dox) 是一种抗肿瘤抗生素, 抗瘤谱较广, 对多种肿瘤均有抑制作用, 目前临床上主要用于急性白血病的治疗, 同时对恶性淋巴瘤乳腺癌肺癌卵巢癌软组织肉瘤成骨肉瘤等肿瘤均有一定疗效 [7-9] 但由于其一些毒副作用 ( 如会产生剂量依赖的心脏毒性 ), 因此多与其他抗癌药物联合使用蟾蜍灵 (bufalin,buf) 是从中药蟾酥中提取出来的一种毒性配基, 属于强心甙类物质 [10-12] 这种物质具有麻醉解毒等药理作用 [13] [14] 有研究发现 : BUF 可以有选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡, 如肝癌乳腺癌等本课题研究 BUF 和 DOX 以及两者联用对 NSCLC A549 细胞增殖凋亡和细胞周期的影响, 并探讨 BUF 与 DOX 是否具有协同作用, 从而为临床寻找有效的 NSCLC 治疗药物和手段提供理论和实验依据 1 材料与方法 1.1 材料药物 BUF( 含量 98%) 购自上海君瑞生物技术有限公司, 使用时用无水乙醇配成 0.02 mol/l 的母液, 然后稀释成所需浓度 DOX( 含量 99%) 购自武汉楚丰源科技有限公司, 为水溶性药物, 实验时用去离子水配制, 并用 0.22 μm 滤头过滤除菌细胞株人非小细胞肺癌 A549 细胞购自中国科学院上海细胞库主要试剂碘化丙啶 (propidium iodide,pi) 四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium,mtt) 二甲亚砜 (dimethyl sulfoxide,dmso) 购自上海阿拉丁试剂公司 ;DMEM 培养基和 0.25% 胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司 ; 新生小牛血清购买于杭州四季青生物工程材料有限公司 ; 流式双染试剂盒 (annexin V/PI) 购自上海前尘生物科技有限公司 1.2 方法细胞培养将 A549 细胞置于含 10% 的小牛血清 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养液,37,5%CO 2 饱和湿度的培养箱中培养细胞长满培养瓶的 70%~80% 时, 用 0.25% 胰酶进行消化计数并置于培养箱中传代培养 MTT 法检测细胞抑制率取对数生长期细胞, 采用胰酶消化细胞后, 取 100 μl 细胞悬液 (1 个 /ml) 接种于 96 孔培养板中, 将培养板放入细胞培养箱中培养 24 h 去掉旧培养液加入含药的新鲜培养液, 设定的实验组如下 : 对照组 BUF 组 (1,10,20,50,100 nmol/l) DOX 组 (0.1,0.5,1.0,3.0,5.0 μg/ml) BUF(1,20,100 nmol/l)+ 1 μg/ml DOX 组, 分别放入培养箱培养 24,48,72 h 然后每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml) 工作液, 孵育 1~3 h 后加 180 μl 的 DMSO, 室温匀速振荡后, 用酶标仪检测 570 nm 处的吸光度值 (A 570 ) 抑制率 =(1 实验组 A 570 / 对照组 A 570 ) 100%

3 764 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(7) 细胞凋亡检测 Hoechst 染色技术观察细胞核形态取对数生长期细胞, 采用胰酶消化后将细胞 (1 个 /ml) 接种于 6 孔板中, 培养 24 h 后, 分别加入 20 nmol/l BUF,1.0 μg/ml DOX,20 nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX 联合处理细胞 24 h, 药物处理后吸尽培养液,PBS 洗 3 次, 用 40 g/l 多聚甲醛固定细胞 30 min,pbs 洗 3 遍, 最后用 Hoechst 染色液在避光环境下染色 5 min, 然后放到荧光显微镜下观察细胞核形态流式双染法检测细胞凋亡率取对数生长期细胞, 采用胰酶消化后将细胞 (1 个 /ml) 接种于 6 孔板中, 培养 24 h 后, 分别加入 20 nmol/l BUF,1.0 μg/ml DOX,20 nmol/l BUF+ 1 μg/ml DOX 联合处理细胞 24 h 后,0.25% 胰酶消化后, 用 r/min 离心 5 min, 弃掉上清液再加入 500 μl 结合缓冲液并混匀, 再加入 5 μl 的 annexin V- 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate,fitc) 和 5 μl 的 PI, 混匀后室温避光染色 15 min, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡, 并进行统计学分析流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期细胞, 采用胰酶消化后将细胞 (1 个 /ml) 接种于 6 孔板中, 培养 24 h 后, 分别加入 20 nmol/l BUF,1.0 μg/ml DOX,20 nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX 联合处理细胞 24 h 后,0.25% 胰酶消化, r/min 离心 5 min, 预冷的 PBS 清洗细胞 3 遍, 加入 70% 的预冷乙醇,4 过夜, 然后加入 10 μg/ml 的 RNAse, 并在 37 环境中孵育 30 min, 加入 10 μg/ml 的 PI 试剂, 避光染色 30 min, 然后进行流式细胞仪测定 Western 印迹检测凋亡蛋白表达取对数生长期细胞, 经胰酶消化后制成单细胞悬液, 以 1 个 /ml 密度接种至细胞培养瓶中, 贴壁后, 加入 20 nmol/l BUF,1.0 μg/ml DOX,20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 联合处理细胞 24 h, 吸出含药培养基, 用 PBS 清洗 3 遍分别收集对照组 20 nmol/l BUF 组和 1 μg/ml DOX 组细胞,4 下用蛋白裂解液裂解 40 min, r/min 离心 20 min, 取上清并用 Lowry 法对蛋白进行定量检测然后与样品缓冲液混合后, 煮沸 6 min, 点样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶孔中, 电泳 3 h, 然后转印至硝酸纤维素膜上 30 min 将膜用脱脂牛奶封闭后, 分别加入 caspase-3 抗体 (1:500),4 过夜用 Tris-HCI 缓冲盐溶液清洗膜 3 次后, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗室温作用 30 min, 再用增强化学发光法显色, 并在凝胶图像分析系统中进行成像和分析 1.3 统计学处理所有数据资料均为 3 次重复独立实验结果, 以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 采用 SPSS 11.0 统计软件进行单因素方差分析和 t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 MTT 检测细胞抑制效果 BUF 对 A549 细胞的抑制效果 BUF 可以显著地抑制 A549 细胞的增殖, 并随着 BUF 浓度的增加和处理时间的延长, 其抑制率也随之增强, 与同一处理时间的对照组 (0 nmol/l) 相比, 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05, 表 1) DOX 对 A549 细胞的增殖抑制效果 DOX 对 A549 细胞的增殖有显著抑制作用, 并且呈时间剂量依赖性与同一处理时间的对照组 (0 nmol/l) 相比, 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05, 表 2) 表 1 BUF 对 A549 细胞的增殖抑制效果 (n=3,x±s) Table 1 Inhibitory effect of BUF on the proliferation in A549 cells (n=3, x±s) 细胞抑制率 /% 24 h 48 h 72 h 对照组 nmol/l BUF 组 8.7±1.4* 16.4±2.5* 25.4±0.8* 10 nmol/l BUF 组 16.7±1.7* 27.7±2.4* 35.9±1.3* 20 nmol/l BUF 组 24.1±1.8* 43.4±2.5* 57.4±1.1* 50 nmol/l BUF 组 41.2±1.2* 64.4±1.6* 75.5±0.6* 100 nmol/l BUF 组 53.9±1.3* 72.9±3.1* 82.6±2.6* 与同一处理时间对照组比较,*P<0.05 表 2 DOX 对 A549 细胞的增殖抑制效果 (n=3,x±s) Table 2 Inhibitory effect of DOX on the proliferation in A549 cells (n=3, x±s) 细胞抑制率 /% 24 h 48 h 72 h 对照组 μg/ml DOX 组 5.6± ±1.8* 19.8±2.1* 0.5 μg/ml DOX 组 12.6±2.5* 21.6±1.4* 35.6±2.7* 1.0 μg/ml DOX 组 22.6±1.6* 39.5±3.2* 44.3±1.5* 3.0 μg/ml DOX 组 55.6±2.8* 68.7±2.4* 79.9±1.8* 5.0 μg/ml DOX 组 71.2±2.8* 78.6±1.5* 91.9±0.7* 与同一处理时间对照组比较,*P< BUF 和 DOX 联用对 A549 细胞的增殖抑制效果如表 3 所示 :DOX(1.0 μg/ml) 联合不同浓度的 BUF(1,20,100 nmol/l) 对 A549 细胞的增殖有抑制

蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 等 765 作用, 两者联用抑制效果呈浓度和时间依赖性 ( 均 P<0.05) BUF(1,20,100 nmol/l) 与 DOX(1.0 μg/ml) 联用的肿瘤抑制效果显著强于单用 BUF 和 DOX( 均 P<0.05), 两者联用具有协同的肿瘤抑制效果 2.

4 蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 等 765 作用, 两者联用抑制效果呈浓度和时间依赖性 ( 均 P<0.05) BUF(1,20,100 nmol/l) 与 DOX(1.0 μg/ml) 联用的肿瘤抑制效果显著强于单用 BUF 和 DOX( 均 P<0.05), 两者联用具有协同的肿瘤抑制效果 2.2 细胞核形态学改变 Hoechst 染色荧光显微镜观察结果显示 : 20 nmol/l BUF,1.0 μg/ml DOX,20 nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX 处理 A549 细胞 24 h, 细胞核出现凋亡形态学变化 : 染色质出现浓缩细胞核裂解为碎块, 产生凋亡小体, 而对照组细胞核呈蓝色, 边缘光滑完整, 染色质呈均匀分布 ( 图 1) 表 3 BUF 和 DOX 联用对 A549 细胞的增殖抑制效果 (n=3,x±s) Table 3 Inhibitory effect of BUF combined with DOX on the proliferation in A549 cells (n=3, x±s) 细胞抑制率 /% 24 h 48 h 72 h 对照组 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组 33.5±1.6* 42.9±2.8* 55.7±4.2* 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组 56.9±2.5* 69.5±3.4* 79.1±3.2* 100 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组 80.5±1.4* 89.8±1.8* 94.3±2.1* 与同一处理时间对照组比较,*P<0.05 A B C D 图 1 BUF,DOX 及两者联用对 A549 细胞核的影响 (Hoechst 染色, 200) Figure 1 Effect of BUF, DOX and BUF combined with DOX on the nucleus (Hoechst staining, 200) A: Control group; B: 20 nmol/l BUF group; C: 1.0 μg/ml DOX group; D: 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX group 2.3 流式细胞检测结果 BUF,DOX 及两者联用对 A549 细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测结果显示 :20 nmol/l BUF 组 1.0 μg/ml DOX 组 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组 24 h 的凋亡率分别为 (19.1±2.5)%,(23.7±1.9)% 和 (59.8±1.5)%, 相比对照组 [(2.9±1.2)%] 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) 而 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组在处理后的 12,24, 48 h, 细胞凋亡率随着处理时间的增长而增加, 分别为 (21.8±1.5)%,(59.8±2.3)% 和 (81.6±1.1)%( 图 2) BUF,DOX 及两者联用对 A549 细胞周期的影响 20 nmol/l BUF 组和 1.0 μg/ml DOX 组 24 h 后的 G 0 /G 1 和 S 期细胞比例均下降 ( 均 P<0.01),G 2 /M 期细胞比例增加, 但不明显 20 nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX 组 24 h 后的 G 0 /G 1 期比例下降至 (35.2±0.9)%,S 期的细胞比例增长至 (55.9±0.65)%( 均 P<0.05, 表 4) 2.4 BUF,DOX 及两者联用对凋亡蛋白的影响 Western 印迹检测蛋白表达水平结果如图 3 所示 : 相比对照组,20 nmol/l BUF 组和 1.0 μg/ml DOX 组 A549 细胞中的 caspase-3 蛋白表达水平均上调 ( 均 P<0.05),20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX 组 caspase-3 上调最高 (P<0.05)

766 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(7) http://www.csumed.

5 766 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(7) A B C PI D E F Annexin V 图 2 BUF,DOX 及两者联用对 A549 细胞凋亡的影响 Figure 2 Effect of BUF, DOX and BUF combined with DOX on the apoptosis A: Control group; B: 20 nmol/l BUF group at 24 h; C: 1.0 μg/ml DOX group at 24 h; D: 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX group at 12 h; E: 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX group at 24 h; F: 20 nmol/l BUF+1.0 μg/ml DOX group at 48 h 表 4 BUF,DOX 及两者联用对 A549 细胞周期的影响 (n=3, x±s) Table 4 Effect of BUF, DOX and BUF combined with DOX on the cell cycle (n=3, x±s) 细胞比例 /% G 0 /G 1 S G 2 /M 对照组 71.60±1.0.30± ± nmol/l BUF 组 58.90±1.30* 30.10±0.85* 11.00± μg/ml DOX 组 60.50±0.80* 32.20±1.01* 7.30± nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX 组 35.20±0.90* 55.90±0.65* 8.90±0.88 与同一细胞周期的对照组比较,*P<0.05 Caspase-3 β-actin Control group 图 3 BUF,DOX 及两者联用对凋亡蛋白的影响 Figure 3 Effect of BUF, DOX and BUF combined with DOX on the apoptosis protein 20 nmol/l BUF group 1.0 μg/ml DOX group 20 nmol/l BUF+ 1.0 μg/ml DOX group 35 kd 42 kd 3 讨论 DOX 是一种广谱的肿瘤抗生素, 针对很多种肿瘤均具有一定的治疗效果 [15-16] 在临床上常作为肿瘤化疗的二线药物, 但是临床上发现其对正常组织有一定的毒副作用, 从而限制了其临床应用 [17] 近年来,BUF 作为一种低毒的中药提取物被用于抗肿瘤治 [18] 疗有一些研究发现 BUF 可以诱导部分白血病细胞分化及凋亡本研究结果发现 :1~100 nmol/l 的 BUF 处理细胞 24 h, 细胞抑制率从 (8.7±1.4)% 提高到 (53.9±1.3)%, 0.1~5.0 μg/ml 的 DOX 处理细胞 24 h, 细胞抑制率从 (5.6±3.1)% 提高到 (71.2±2.8)% 处理 48 和 72 h, 抑制率更加明显, 说明单独的 BUF 和 DOX 均对 A549 细胞有一定的抑制效果, 并且呈剂量和时间依赖关系 1 nmol/l BUF 处理细胞 24 h 的细胞抑制率为 (8.7±1.4)%,1.0 μg/ml DOX 处理细胞 24 h 的抑制率为 (22.6±1.6)%, 而两者联合处理细胞 24 h 后, 抑制率为 (33.5±1.6)%, 显著高于两药单独使用时的效果 ( 均 P<0.05), 并且呈浓度和时间依赖性说明 BUF 和 DOX 联合应用可使 DOX 在小浓度时即有较好的杀伤作用, 从而避免大剂量 DOX 所引起的毒副作用此外,BUF 所具有的解毒功能也可以起到保护肝肾功

6 蟾蜍灵联合阿霉素对人肺癌 A549 细胞体外增殖和凋亡的影响张翠利, 等 767 能等作用 [19] 流式细胞双染结果所示,BUF(20 nmol/l) 和 DOX(1.0 μg/ml) 联用处理 A549 细胞诱导的细胞凋亡率为 (59.8±1.5)%, 明显高于单独使用时所引起的细胞凋亡率可见, 不仅 BUF 和 DOX 均可诱导 A549 细胞的凋亡, 而且两者联用较单独用药显著提高了细胞的凋亡率此外, 本实验中流式细胞仪检测细胞周期结果表明 :BUF(20 nmol/l) 和 DOX(1.0 μg/ml) 联用处理 A549 细胞均引起 G 0 /G 1 细胞比例的下降, 同时引起 S 期细胞比例的上升, 提示 BUF 和 DOX 均可诱导细胞周期阻滞于 S 期, 其作用机制可能是 BUF 和 DOX 与 A549 细胞的 DNA 碱基结合, 从而使 DNA 模板失活, 抑制了细胞中 DNA 的合成, 使大量细胞阻滞于 S 期 BUF (20 nmol/l) 和 DOX(1.0 μg/ml) 联用处理 A549 使 S 期细胞比例升高更加明显,S 期阻滞效果更加突出这可能是由于不同增殖期细胞对化疗的敏感性不同, 有研究表明 S 期对细胞周期特异性药物敏感性较强, 而 M,G 1 和 G 2 期细胞对细胞周期非特异性药物较敏感 [20] 综上所述,BUF 可以联合 DOX 增强对肿瘤细胞的杀伤作用, 减少 DOX 的毒副作用 BUF 和 DOX 联合用药抗肿瘤的机制可能与诱导细胞凋亡和细胞周期 S 期阻滞以及凋亡蛋白 caspase-3 的上调有关参考文献 [1] 胡兴胜, 焦顺昌, 张树才, 等. 培美曲塞及吉西他滨分别联合顺铂治疗初治晚期非小细胞肺癌安全性和有效性的随机对照研究 [ J]. 中国肺癌杂志, 2013, 15(10): HU Xingsheng, JIAO Shunchang, ZHANG Shucai, et al. Pemetrexed and gemcitabine combined cisplatin treatment of advanced nonsmall cell lung cancer treated first safety and efficacy of randomized controlled studies[ J]. Chinese Journal of Lung Cancer, 2013, 15(10): [2] 姜丽岩, 廖美琳. 非小细胞肺癌新药化疗进展 [ J]. 实用肿瘤杂志, 2005, 16(4): JIANG Liyan, LIAO Meilin. The advances in chemotherapy for nonsmall-cell lung cancer[ J]. Journal of Applied Oncology, 2005, 16(4): [3] 胡毅, 冯奉仪. 晚期非小细胞肺癌化疗研究现状及展望 [ J]. 国际肿瘤学杂志, 2004, 29(3): HU Yi, FENG Fengyi. The present situation and prospect of chemotherapy for advanced nonsmall-cell lung cancer[ J]. International Oncology Journal, 2004, 29 (3): [4] Mcelnay P, Lim E. Adjuvant or neoadjuvant chemotherapy for NSCLC[ J]. J Thorac Dis, 2014, 6(2): S [5] 王素娟, 李孝波, 王杰. 中药联合化疗治疗非小细胞肺癌研究进展 [ J]. 山西中医, 2015, 31(9): WANG Sujuan, LI Xiaobo, WANG Jie. Progress in the treatment of non-small cell lung cancer in the combination of Chinese traditional[ J]. Chinese Traditional Medicine of Shanxi, 2015, 31 (9): [6] 冯燕. 吉西他滨联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌疗效观察 [ J]. 中华现代临床医学杂志, 2007, 7(6): FENG Yan. The effect of the treatment of advanced nonsmall-cell lung cancer in patients with advanced nonsmall-cell lung cancer[ J]. Journal of Modern Clinical Medicine in China, 2007, 7(6): [7] 龚连生, 郭春芳, 胥洪鹃, 等. 载阿霉素新型壳聚糖纳米粒的性质及体外抗肿瘤研究 [ J]. 中国现代医学杂志, 2013, 23(16): GONG Liansheng, GUO Chunfang, XU Hongjuan, et al. Adriamycin new antitumor properties of chitosan nanoparticles and in vitro studies[ J]. Chinese Journal of Modern Medicine, 2013, 23(16): [8] 刘一, 边原, 叶云. 阿霉素抗肿瘤作用的研究进展 [ J]. 泸州医学院学报, 2008, 12(1): LIU Yi, BIAN Yuan, YE Yun. The research progress of the anti-tumor effect of asamycin[ J]. Journal of Luzhou Medical School, 2008, 12(1): [9] 王新, 李德华. 阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展 [ J]. 中国实用医药, 2010, 5(7): WANG Xin, LI Dehua. The research progress of the mechanism of inducing apoptosis of tumor cells in tumor cells[ J]. China Practical Medicine, 2010, 5(7): [10] 陈小义, 呼文亮, 徐瑞成, 等. 蟾蜍灵对肝癌细胞 SMMC 7721 的细胞毒作用及生长相关基因表达的影响 [ J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2004, 15(4): CHEN Xiaoyi, HU Wenliang, XU Ruicheng, et al. Toad spirit of liver cancer cell SMMC 7721 cytotoxic effects and the influence of growth related gene expression[ J]. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2004, 15(4): [11] 张晔, 赵明芳, 刘云鹏, 等. 蟾蜍灵诱导人胃癌 SGC7901 细胞自噬与凋亡的研究 [ J]. 现代肿瘤医学, 2013, 21(10): ZHANG Ye, ZHAO Mingfang, LIU Yunpeng, et al. Toad spirit human SGC7901 gastric cancer cells induced autophagy and apoptosis[ J]. Journal of Modern Cancer Medicine, 2013, 21(10): [12] 吕银鹏, 周辉, 宋佳欣. 蟾蜍灵联合顺铂对人舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞增殖及凋亡的影响 [ J]. 山东医药, 2014, 12(46): LÜ Yinpeng, ZHOU Hui, SONG Jiaxin. Toad spirit combined cisplatin in human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells proliferation and apoptosis[ J]. Journal of Shandong Medicine, 2014, 12(46):

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s

戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联