8 中南大学学报 医学版 恶性淋巴瘤是血液系统常见的肿瘤之一 近年发病率有增高趋势 随着治疗方案的不断改进 本病的缓解率和长期无病生存率有一定程度的提高 但仍有部分病人疗效欠理想 研究报道 规律服用某些非甾体类抗炎药物 $1/#2 如阿斯匹林 布洛芬 塞来昔布等可明显降低人群结肠癌 乳腺癌 前列腺癌

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1 中南大学学报 医学版 8 塞来昔布与阿霉素对 5%<' 细胞增殖和凋亡的影响及机制 黄晓春 李晓林 黄然欣 杨小刚 付斌 中南大学湘雅医院血液科 长沙 78 摘要 目的 观察塞来昔布 ' 单用及联合阿霉素 %&'%' /2; 对 5%<' 细胞增殖和凋亡的影响 方法 ; 法测塞来昔布单用或联合阿霉素干预后 5%<' 细胞的增殖率 流式细胞技术检测细胞凋亡率 53-5 检测 %%6 5$/ 变化 免疫组织化学法检测 %%6 蛋白的表达 结果 9 塞来昔布干预 5%<' 细胞后 随药物浓度增高细胞增殖率减低 凋亡率增高 联合阿霉素干预后细胞增殖率减低 凋亡率增高 与塞来昔布单用比差异有统计学意义 且伴随细胞 %%6 5$/ 和蛋白的表达增高 结论 塞来昔布可抑制 5%<' 细胞增殖 呈剂量和时间依赖 可诱导 5%<' 细胞凋亡 伴有 %%6 的激活 塞来昔布联合小剂量阿霉素后以上作用增强 关键词 塞来昔布 阿霉素 %% 凋亡 增殖 2=# 66 <' 7 6 5) # %+ ##,@/$0'%( 9#'%',@/$05%' "/$0'%% +@A'!"#" %&' &' $%!%!$' &$ 78 $) *)+ % ' ' '%' )' %&'%' /2; &'&%' % %', - ' )& &% )' ' % &'&%' )% %' 7 ' '% ' &% '( &' ; %'&' (%&%'&% )%%% ) & 53-5)%%' ''(' 4%%6 5$/ & '#(' '& )%( %%6 &' & ' ' 5%<' %! -' ''' &'&%' % '&% %'5%<' ' ' % % ' % &)'' 9-%& )' ' % &'&%' 5%<' ' '(% )' ' % %&'%' )% &%-%%6 5$/ % &' & ' ' 5%<' )& '''% % %& &% '!3 -' % ''' &'&%' 5%<' ' % % ' % &-' %% %'5%<' (&(%'%'4''%%6 /&'%' ( '' - '%&'%'%%%'&'&%' 收稿日期 6!! 作者简介 黄晓春 硕士 主治医师 主要从事血液肿瘤研究 通信作者! 李晓林 %'((

2 8 中南大学学报 医学版 恶性淋巴瘤是血液系统常见的肿瘤之一 近年发病率有增高趋势 随着治疗方案的不断改进 本病的缓解率和长期无病生存率有一定程度的提高 但仍有部分病人疗效欠理想 研究报道 规律服用某些非甾体类抗炎药物 $1/#2 如阿斯匹林 布洛芬 塞来昔布等可明显降低人群结肠癌 乳腺癌 前列腺癌的发病率和死亡率 现在该类药对恶性淋巴瘤作用的研究也受到关注 塞来昔布是一种近年来新上市的 $1/#2 为选择性 -= 抑制剂 主要用来解热镇痛和抗风湿治疗 它对恶性淋巴瘤的作用也逐渐引起人们的兴趣 为了解塞来昔布与淋巴瘤化疗药物联合应用是否能够增加化疗药物的敏感性并减少化疗药物的用量 本研究拟观察其对淋巴瘤细胞株增殖和凋亡的作用 并将其与阿霉素联用. / 材料与方法 主要试剂塞来昔布为安徽合肥森瑞股份有限公司产品 盐酸阿霉素为意大利法玛西亚公司产品 53 ;#7 培养基为海克隆生物化学制品 北京 有限公司产品 小牛血清 +-1 为杭州四季青公司产品 / ' +#- 试剂盒为南京凯基生物有限公司产品 反转录反应体系购自日本 =%*% 公司 3-5 扩增体系为日本 公司产品 %%6 引物和 - 引物由上海生工生物工程公司合成 -%%6 兔抗人单克隆抗体为美国 1%%-&( 生物公司产品 山羊抗兔 +#-#0 和浓缩 2/A 试剂盒为北京中杉金桥生物公司产品 2"/2;2$/ ' 3-5 仪为美国 ; D5 %& 公司产品 流式细胞仪为美国 A 2'*' 公司产品 酶标仪为美国 A'5% 公司产品 细胞培养及分组人 A(&*' 淋巴瘤细胞系 5%<' 细胞 为本实验中心保存 5%<' 细胞用含 8 小牛血清的 53 ;#7 培养基 在饱和湿度 和 -= 的培养箱中培养 换液传代 对照组 未处理的 5%<' 细胞 塞来昔布组 细胞培养基中加入二甲基亚砜 2;1= 溶解的塞来昔布 浓度分别为 塞来昔布浓度选择参照文献 阿霉素组 根据预实验结果选出 9 阿霉素加入培养基中 联合用药组 9 阿霉素联合以上各浓度塞来昔布 加入培养基中 ; 法检测细胞活力将对数生长期的细胞重悬于含体积分数为 8 小牛血清的 53;#7 培养液中 接种于 6 孔培养板 每孔 9 含 7 个细胞 设置对照组及塞来昔布 不同浓度组及联合用药组 置于 -= 培养箱中 培养 7 小心吸出各孔内培养液 观察量效关系 同时设置不同时间组 7 78 观察时效关系 每孔均为 9 每组均设 个复孔 置于 培养箱中 继续培养 培养结束前 7 各培养孔加入 9 的 ; 97 后离心弃去上清 每孔加入 2;1= 9 振荡器震荡 ' 后 用全自动酶标仪检测各孔吸光度值 / 76 并计算抑制率 以含 2;1= 的 53;#7 培养液替代实验用药物作为空白对照 实验重复 次 取平均值为相应的 / 值 其计算公式为 增殖率 C 实验组吸光度值 对照组吸光度值 7 流式细胞仪检测细胞凋亡收集各组细胞 7 预冷磷酸盐缓冲溶液 3A1 洗细胞 次 悬浮细胞并调节细胞浓度为 9 按试剂要求加入 / ' 和碘化丙锭溶液 混匀室温避光孵育 ' 流式细胞仪检测 塞来昔布诱导 5%<' 细胞凋亡率 C 实验组细胞凋亡率! 对照组细胞凋亡率 53-5 测定 %%6 5$/ 的表达分别收集各组 个细胞 加入 5# 试剂 按照说明书操作步骤提取 5$/ 使用分光光度仪检测 5$/ 质量和浓度 要求 / / 8 比值为 8 进行纯化和鉴定 基因特异的上 下游引物设计用 3&' & 软件 %%6 引物序列 上游 G 00/00/---0/--/0 G 下游 G-///0/ 0-0--/ 为内参 引物序列 上游 G/--/-/0--/0--/-/- G 下游 G--/--/ / G 取总 5$/ 用反转录酶将其转为 2$/ 按试剂说明书操作 7 保存用于扩增 然后以 2$/ 为模板 利用各基因的检测引物进行 反应条件为 67 变性 8 退火 延伸 ' 共 7 个循环后 延伸 ' %%6 反应条件为 67 变性 退火 延伸 ' 共 个循环后 延伸 ' 取 3-5 产物 9 在 的琼脂糖凝胶电泳

3 塞来昔布与阿霉素对 5%<' 细胞增殖和凋亡的影响及机制 黄晓春 等 8 在 A'5% 凝胶成像分析仪上观察结果并照相 用凝胶成像系统 (%' 软件分析结果 以目的基因与 - 条带的相对含量表示 免疫组织化学法检测 %%6 蛋白表达将处理组和对照组细胞用 9 3A1 洗 ' 调整细胞浓度 9 取 9 滴片 无水丙酮固定 ' 晾干 蒸馏水冲洗 3A1 浸泡 ', = 去离子水孵育 ' 滴加正常山羊血清室温孵育 ' 甩去多余液体 滴加一抗 %%6 兔抗人多克隆抗体 工作浓度 于 放置 93A1 冲洗 ' 共 次 滴加二抗山羊抗兔 #0 放置 ' 滴加辣根酶标记工作液 放置 ' 用 93A1 冲洗 ' 共 次 2/A 显色 自来水充分冲洗 苏木素轻度复染 梯度酒精脱水 二甲苯透明 中性树脂封片 同时用 3A1 代替一抗作阴性对照 结果判定 细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞 在高倍光镜下至少观察 个细胞 计算阳性细胞率 统计学处理所有数据以均数 > 标准差 >$ 表示 采用 1311 统计学软件分析 组间比较采用单因素方差分析 检验水准 C 为差异具有统计学意义 / 结 // 果 塞来昔布对 5%<' 细胞增殖的抑制作用塞来昔布对 5%<' 细胞增殖率影响见表 5% <' 细胞有明显的抑制增殖作用 同一药物浓度组作用的 个时间段 以 增殖率最低 不同药物浓度组作用 7 又以 9 组抑制作用最高 浓度在 9 范围内存在量效关系 且各组比较差异具有统计学意义 塞来昔布联合阿霉素 9 抑制 5%<' 细胞增殖 各组比较差异具有统计学意义 较相应浓度的塞来昔布单用组作用增强 表 塞来昔布 9 联合阿霉素作用 7 细胞已全部死亡 细胞的凋亡塞来昔布可诱导 5%<' 细胞凋亡 细胞凋亡率随药物浓度增高而增加 差异均有统计学意义 表 9 塞来昔布联合阿霉素 9 作用于细胞 7 的凋亡率较 药单用明显升高 差异有统计学意义 7 9 塞来昔布作用 78 的细胞凋亡率分别为 7 > 8 和 7 8 > 随药物作用时间延长细胞凋亡率显著增高 表./ 塞来昔布和 或阿霉素对 %+ 细胞增殖及凋亡的影响 64B &)./5) $, ) %+ 6 4B 组别 增殖率 7 78 凋亡率 7 78 对照组 > > >6 9 塞来昔布组 6 >8 886 >6 86 > >8 6 > 7 > 7 9 塞来昔布组 8 > 8 >6 >8 7 >8 7 >8 78 >7 塞来昔布组 6 > > 76 > 7 >77 66 > 7 > 8 9 塞来昔布组 > 777 > 7 >6 > > >77 9 塞来昔布组 8 > 8 > > > > 8 > /2; 组 67 > 86 > 8 > > 8 >7 8 > 9 塞来昔布 H/2; 组 88 >6 8 >7 > 7 9 塞来昔布 H/2; 组 78 > 67 > 76 > 7 >8 78 > 9 塞来昔布 H/2; 组 7 >6 8 >8 8 >6 78 > > > 塞来昔布 H/2; 组 87 >7 与 9 塞来昔布组比较 与 7 9 塞来昔布组比较 与 9 塞来昔布组比较 与 8 9 塞来昔布组比较 与同浓度的塞来昔布组比较

4 88 中南大学学报 医学版 -%%6 5$/ 和蛋白的表达 塞来昔布作用 7 细胞中 %%6 5$/ 表达分别为 > 7 > 7 > 7 78 > > 随药物浓度增高而增强 图 以上条件下 %%6 蛋白表达分别为 >6 >7 > 7 8 > >8 随药物浓度增高而增高 差异有统计学意义 9 塞来昔布作用 7 78 细胞的 %%6 5$/ 表达分别为 7 > 7 7 > 7 > 呈时间依赖性 塞来昔布联合阿霉素 9 作用于细胞 7 后 %%6 表达增强 表 图./ 塞来昔布作用 9 对 %+ 细胞 3? #%$ 表达的影响 9 塞来昔布 7 9 塞来昔布 9 塞来昔布 7 9 塞来昔布 H 9 阿霉素 8 9 塞来昔布 9 塞来昔布 ;2$/;%&* & "./5)53? %+ 9 ' &( 7 9 ' &( 9 ' &( 7 9' H/2; &( 8 9' &( 9 ' &( ;;%&* & 表 / 塞来昔布联合阿霉素作用 9 对 %+ 细胞 3? 表达的影响 64 &)/5) $, 5 3? %+ 6 4 组别 %%6 5$/ %%6 蛋白 对照组 > > 9 塞来昔布组 7 >7 >7 /2; 组 6 > > 9 塞来昔布 H/2; 组 7 > >7 与对照组比较 与 9 塞来昔布组比较 4/ 讨 // 论 在难治性或复发性非霍奇金淋巴瘤患者中使用大剂量塞来昔布 7 次 进行化疗前预处理 可明显改善化疗的效果 提示塞来昔布可改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 7 裸鼠造成中枢神经系统 A 细胞淋巴瘤 予口服塞来昔布治疗 结果显示药物干预组的裸鼠生存期比无药物干预组延长 实验证明单用 $1/#2 及 -= 抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡 但其抗癌作用机制存在 -= 依赖和 -= 非依赖途径的争论 -= 依赖性机制 主要是抑制前列腺素物质尤其是前列腺素 产生 使肿瘤血管生成抑制 导致肿瘤生长受阻 -= 非依赖机制 -= 抑制剂乙哚乙酸作用于无 -= 表达的 A(&*' 淋巴瘤细胞株 2%(' 和 5%<' 细胞 可诱导细胞凋亡 而不能诱导正常 A 淋巴细胞凋亡 研究表明 乙哚乙酸减少抗凋亡蛋白 A 的表达 激活 %%6 和 8 用塞来昔布 9 处理人 -= 2$/ 转染的结肠癌细胞后 出现剂量依赖的抗增殖和促凋亡作用 同时检测到有 %%6 和 的激活 3 和 3 上调 6 本研究探讨该药对细胞的直接影响 选择无 -= 表达的 A(&*' 淋巴瘤细胞系 5%<' 细胞 E%& 等报道用二甲基塞来昔布 与塞来昔布结构相近 无抑制 -= 作用的药物 对 A(&*' 淋巴瘤细胞作体内和体外实验 发现它与塞来昔布有相似的抗增殖和抗肿瘤形成效应 所以认为 该药抗增殖不需要 -= 依赖 & 等也用二甲基塞来昔布和塞来昔布对胶质瘤 淋巴瘤 多发性骨髓瘤 前列腺癌 乳腺癌和结肠癌细胞株进行实验 体内和体外实验均表明 二药抗增殖和诱导凋亡效应相近 本实验表明 塞来昔布能抑制 5%<' 细胞增殖 并呈剂量依赖性和 7 时间依赖性 这与 ( 等和 1(%'' 等研究结果相符 细胞凋亡的调控障碍与肿瘤的发生密切相关 肿瘤的发生与控制细胞增殖的癌基因的过度表达有关 也与抑制细胞凋亡的基因的高表达及诱导细胞凋亡的抗癌基因的变异失活有关 细胞凋亡机制被不适当地终止后 为细胞癌变提供了重要前提 目前凋亡的判定有许多成熟的检测方法 如形态学观察 2$/ 降解片段分析 流

5 塞来昔布与阿霉素对 5%<' 细胞增殖和凋亡的影响及机制 黄晓春 等 86 式细胞仪分析 2$/ 原位末端标记法 本实验应用快速直观的流式细胞仪 进行凋亡细胞的定量分析 结果显示塞来昔布诱导 5%<' 细胞的凋亡率呈浓度依赖性 当塞来昔布 9 浓度以上作用超过 7 后 流式细胞仪检测到大量死亡细胞 提示塞来昔布的作用随浓度和时间而改变 已知细胞凋亡有两条途径 8 一是 $+ 受体家族成员参与的通过 %%8 活化的途经 称为外源性凋亡途径 二是细胞色素 - - 参与的通过 %%6 活化的途径 称为内源性凋亡途径 两条途径最后均通过激活下游的效应因子 %% 使细胞发生凋亡 %%6 是内源性凋亡途径的启动因子 细胞凋亡不仅在肿瘤的发生发展过程中起重要作用 而且与肿瘤治疗和药物敏感机制以及耐药性有关 目前已发现大多数抗癌药发挥其抗癌效应是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的 6 本研究结果显示随塞来昔布浓度增加 %%6 的表达逐渐增强 差异有统计学意义 还呈时间依赖性 提示该药可通过线粒体途径诱导凋 亡 与 D&* 等的研究相符 A 通过控制的释放和改变线粒体膜的电势而激活 %% 6 诱发凋亡 所以塞来昔布诱导的细胞凋亡过程中 - 的释放机制仍需深入研究 1'%2%% 等研究也表明 成人 细胞淋巴瘤白血病细胞可被塞来昔布诱导凋亡 伴线粒体膜电位改变和 %%6 依赖 目前治疗恶性淋巴瘤最广泛的方法是以蒽环类为基础的联合化疗 对一些复发或难治性淋巴瘤常要加大剂量 一些患者不能耐受药物的毒性和不良反应 而使治疗出现困难 阿霉素是蒽环类抗生素中最常用一种 属于拓扑异构酶 抑制剂 已证实阿霉素对多种实体肿瘤有杀伤作用 阿霉素能诱导细胞凋亡 随其浓度的增加 凋亡细胞的百分率逐步增加 若浓度继续升高 则凋亡率不再增加 而坏死细胞逐渐增多 7 0% 等报道 阿霉素通过激活 %%6 的活性诱导 D(&*% 细胞凋亡 其临床应用因为有骨髓抑制 与总剂量相关的心脏毒性及消化道反应等而受限制 抗肿瘤研究希望找到能够使该药减量 又可以达到治疗目的的方法 本实验用小剂量阿霉素联合塞来昔布 发现联合用药组与分别单独应用 种药物相比均能明显降低细胞的存活率 且联合用药组细胞的凋 亡率高于单独应用 药时的细胞凋亡率 差异均具有统计学意义 联合用药组的 %%6 的表达均较单药组上升 提示塞来昔布可加强阿霉素的抗肿瘤作用 对治疗时减少阿霉素的用量提供了思路 但其机制是塞来昔布降低抗凋亡物质的表达使阿霉素凋亡作用增强 还是二药均通过 - 的释放激活 %%6 诱导凋亡 尚需进一步研究 塞来昔布是否可联合其他化疗药也期待研究 参考文献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

6 6 中南大学学报 医学版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本文编辑 彭敏宁

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