浙江理工大学学报 第 卷 第 期 年 月!"#$%# & ' ' 文章编号 $$$ 复制缺陷型腺病毒! - 的构建及其对结肠癌细胞生长的影响 黄 越 陈文铎 周 炜 董 淼 高 永 许韶威 徐 涛 唐 斌 浙江理工大学生命科学学院 杭州, 摘 要 通过同源重组方式 利用 3: 系统成功构建携带 =)

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1 浙江理工大学学报 第 卷 第 期 年 月!"#$%#&' ' 文章编号 $$$ 复制缺陷型腺病毒!- 的构建及其对结肠癌细胞生长的影响 黄 越 陈文铎 周 炜 董 淼 高 永 许韶威 徐 涛 唐 斌 浙江理工大学生命科学学院 杭州 摘 要 通过同源重组方式 利用 3: 系统成功构建携带 =)3/ 基因的复制缺陷型腺病毒 命名为 3:$ ="$?$=)3/3 并研究其对结肠癌细胞株 "4) 及 %$. 的杀伤作用 / 方法鉴定阳性重组子病毒?%% 法检测 3 对细胞增殖的影响 #* 荧光染色法检测细胞凋亡形态学变化 结晶紫染色法定性分析 3 对两种结肠癌细胞的杀伤作用 结果显示 经目的病毒 3 作用 "4) 及 %$. 出现明显病变和生长抑制现象 并呈现出时间和浓度依赖性 # 染色后观察到细胞内出现凋亡小体 并且数目随药物处理浓度的升高而增多 关键词 3:$=)$3/ 结肠癌?%% 结晶紫染色 细胞凋亡 中图分类号 B+. 文献标志码 3 引 言 结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一 在西方国家它是癌症引发死亡的 第三大杀手 在我国发病率 $ 也呈逐年增长的趋势 目前主要的治疗方法是手术和化疗 但是对于晚期结肠癌 无法进行手术且化疗疗效欠佳 因此寻求高效 低毒的治疗方法迫 在眉睫 基因治疗通过载体携带基因来治疗疾病 此概念一经提出 很快受到重视 并开始应用于肿瘤治疗 =)3/ ) 是..* 年发现的一种重要的细胞周期负调控基因 主要将细胞阻滞于 5 期和 5? 期 =)3/ 定位于染色体.= 的 8<)3$3/ 基因位点 其 #3 长度为..= 编码 个氨基酸 分子量约 ) 分子病理学和分子流行病学研究发现 =)3/ 蛋白表达的异常与多种恶 *$+ 性肿瘤的发生 发展有密切关系 动物实验也表 明 敲除 =)3/ 的小鼠肿瘤患病率明显上升 =)3/ 基因具有以下特点 #3 长度较短 便于基因克隆的操作 在多种人类肿瘤中缺失表达 是目前发现最为重要的抑癌基因 =* 的上游调节基因 因此符合抑癌基因治疗对目的基因片段的要求 有望在恶性肿瘤的基因治疗中发挥重要作用 本实验在以上理论的基础上 利用 3: 系. 统构建并扩增了复制缺陷型腺病毒 3:$="$?$=)3/ 并研究其对结肠癌细胞 "4) 及 %$. 的生长抑制效应 材料与方法 材料 细胞 菌株和质粒质粒 ="$? 由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供 质粒 =?$%$:) / 3+"* 和 /3+"* 由本实验室保存?? 购自 58 公司?%% 和 $ 收稿日期 (( 基金项目 国家自然基金资助项目 ++ 作者简介 黄 越.( 女 吉林四平人 硕士研究生 主要从事天然药物抗肿瘤活性研究 通信作者 徐 涛 电子邮箱 =@9#1#

2 . 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 #* 购自 "!1 公司 试剂 3 小量抽提试剂 捷瑞公司 3 提取凝胶试剂盒 爱思进公司 / 产物纯化试剂盒 爱思进公司 及 3 7::?@ 全式金 天根公司 四甲基偶氮唑蓝?%%"!1 公司 限制性内切酶 公司?? 培养基及胎牛血清 5# 公司 细胞株及培养条件 腺病毒转化的人胚肾细胞株.3 人胚结肠癌细胞株 "4) 及 %$. 由本实验室提供 细胞培养条件为 *2 + 培养箱中培养 培养液为含 2 " 的??# 1::!1:1 方法 =)3/ 基因的克隆以本实验室构建的 =?$%$:) 为模板 分别以 *$5'%35355%3555$ 下划线为 酶切位点 和 *$553'' 3%55%55355%%%%5$ 下划线为 *+ 酶切位点 为上下游引物 通过 / 扩增得到 =)3/ 基因 反应参数为.* *1.* )* **)* 个循环 扩增产物纯化后分别经 *+ 双酶切后回收 含 =)3/ 基因的质粒 ="$?$ =)3/ 的构建 质粒 ="$? 经 *+ 双酶切后回收载体大片段 并将其与 酶切回收得到的 =)3/ 基因混合 经 %) 连接酶连接后转化 / 3+"* 并涂布与 7 抗性平板 + 培养 后挑取单个克隆于 7 液体培养基 培养 后抽取质粒 / 和双酶切鉴定重组子并测序 将构建含有 =)3/ 基因的 ="$? 质粒命名为 ="$?$=)3/ 重组腺病毒质粒 =3:$="$?$ =)3/ 的构建 构建得到的 ="$?$=)3/ 载体经 18 线性化后 与 =3:$ 通过电转法共转染到 * 感受态细胞中进行同源重组得到腺病毒质粒 =3:$="$?$=)3/ 酶切及测序鉴定该重组腺病毒质粒 ) 重组腺病毒的包装 鉴定 扩增以及滴度的测定 将构建的 =3:$="$?$=)3/ 质粒转染到.3 细胞 挑取空斑 抽提病毒基因组 利用 / 进行鉴定 筛选获得携带 =)3/ 基因的重组腺病毒 病毒的体外扩增选用.3 细胞 并采用 %8* 法测定病毒滴度 *?%% 法检测细胞增殖收集对数生长期细胞 调整细胞悬液浓度 将细胞以 7 孔接种于. 孔板 使待测细胞密度为 ) 孔 *2 + 孵育 后加药 病毒处理组加入?8 的 3 对照组加等体积 " 并设置不加细胞为空白组 每个处理均设 个复孔 分别培养 ))+. 后 每孔加入 1!17 的?%% 溶液 7 继续培养 ) 后 小心吸去孔内培养液 每孔加入 *7?" 置摇床上低速振荡 1 使结晶物充分溶解 用酶联免疫检测仪于 ).1 处测量各孔的吸光值 细胞存活率 处理组 值 ( 空白组 值 对照组 值 ( 空白组 值 2 细胞形态学观察将 * * 个 17"4) 和 %$. 细胞分别接种于 孔板中 贴壁培养 后加药 病毒处理组加入?8 的 3 对照组加等体积 "+*2 培养 ) 后 倒置光学显微镜下观察细胞形态学变化并拍照 + 结晶紫染色分析杀伤作用收集对数生长期结肠癌细胞 "4) 和 %$. 用含 2 胎牛血清的?? 培养基调整细胞悬液浓度 将细胞以 *7 孔接种于 ) 孔板 使待测细胞密度为 )* ) 孔 +*2 条件下培养 待细胞贴壁后 加入?8 的 3 对照组加等体积 " 每组做 个重复 作用. 后 吸去上清液 用 " 小心洗涤 次 每孔加 *172 甲醇溶液 固定细胞 后 小心吸尽甲醇溶液 每孔加 *17 结晶紫染色液 2 结晶紫溶于 2 甲醇 室温放置 1 后 轻轻甩去染色液 用蒸馏水洗涤各孔 将培养板倒置于吸水纸上吸干水分 + 烘干后拍照记录 #* 染色观察肿瘤细胞的凋亡对数期肿瘤细胞 "4) 和 %$. 按 * * 个 17 接种至 孔板中 过夜培养 分别用?8 的 3 处理细胞 *2 + 培养 ) 后 每个孔中加入 1!17 的 #* 染料 *7+ 染色 1 后荧光倒置显微镜观察并拍照

3 第#期 黄!越等!复制缺陷型腺病毒 ZLQ 的构建及其对结肠癌细胞生长的影响 %>!!统计学处理 实验数据用 K) 2 2 *D> "软件分析& 3 分别为B 说明ZLQ 对这两株结肠癌细胞 %> BP和! #> AP# & 都有较强的抑制作用# 但抑制作用差异明显" T("> " B$ '!结果与分析 $> %!4/( Lc= %AQG_ 质粒双酶切鉴定 C'+!.$/ 双酶切胶回收 A"$\ 大 %A用 B* 小的目的片段#同时 B* C' 和!.$/ 双酶切 4/( 5I9质粒#割胶回收得到 #A""\ 大小的目的片 段&成功得到 %A 基因片段与 4/( 5I9 载体 片段#用 7A连接酶连接两个片段#转化到 MTB(感 受态细胞& 成功的长出单菌落#挑选 A 管#摇床培 养&提取质粒用 B* C'+!.$/ 双酶切鉴定#得到目 的片段大小与预期相符 "图 %$& 测序结果与酶切鉴 定结果一致# 成功构建4/( 5I9 % AQG_质粒& 图%!4/( $/B* C'双酶切鉴定 5I9 %AQG_ 经!. c!m?q c+ ) d )%%# $!4/( 5I9 %AQG_ 图!!对照病毒 QX对结肠癌细胞株的杀伤作用 $> $重组病毒 QX Lc= 4/( %AQG_ 的鉴定 用 重 组 腺 病 毒 质 粒 QXH+ : Lc= < 4/( 包装病毒并进行小量扩增# F!Q 细胞# % AQG_转染$ 抽提病毒 M?Q#进行 ZLG 扩增鉴定#以确定是否为 重组目的病毒&ZLG 结果表明病毒重组成功" 图$$ & 图$!重组病毒 QXH+ : Lc= %AQG_ 鉴定 < 4/( c!m?q c+ ) d )%%!空白对照%$!目的病毒 $>!!复制缺陷型腺病毒 ZLQ 对结肠癌细胞株的 生长抑制作用 V的复制缺陷型腺病毒 ZLQ 分别感染!!以不同 ck 细胞# 不同时间处理后检测其对结肠癌细胞株存活率 结果如图$+ 图!所示&ZLQ 对结肠癌细胞株 的影响# 4RA D "与 T7 $ F的抑制作用存在剂量与时间依赖性& % " "ck V病毒作用F #/后4RA D "与 T7 $ F细胞存活率 F"! 图A!ZLQ 对结肠癌细胞株的杀伤作用

4 . ) 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 ) 细胞形态学观察结肠癌细胞 "4) 和 %$. 经 3 处理后出现典型凋亡变化 结果如图 * 图 所示?8 的 3 处理 ) 后 光学显微镜下观察细胞生长状态 "4) 和 %$. 细胞生长均受到明显抑制 出现典型的凋亡形态学变化 细胞皱缩 细胞膜出现发泡现象 细胞核浓缩 #* 染色观察细胞凋亡为进一步检测 3 处理细胞后细胞核的形态学变化以及凋亡情况 用 #* 染色法在荧光显微镜下观察各处理组的细胞形态变化 图 图. 显示 对照组细胞核形状规则 染色质分布均匀 细胞所发荧光较弱且均匀 而病毒处理组中 由于发生凋亡的细胞中细胞核染色质会发生明显凝集 固缩 并伴有核碎裂及凋亡小体出现 因此荧光显微镜下观察到呈亮蓝色的固缩的染色质 且随着病毒浓度增加 颗粒状或碎片状致密浓染逐渐增多 图 * 经不同浓度 3 处理后 "4) 细胞形态学观察 3 对照组 加 "?8?8?8?8?8 图 #* 染色检测 "4) 细胞凋亡 3 对照组 加 "?8?8?8 图 经不同浓度 3 处理后 %$. 细胞形态学观察 3 对照组 加 "?8?8?8?8?8 * 结晶紫实验分析 3 对结肠癌细胞 "4) %$. 的杀伤能力 结晶紫实验用于观察比较不同浓度的 3 对结肠癌细胞 "4) 和 %$. 杀伤效果 图 + 所示 随着 3 浓度的增加 对 "4) 和 %$. 的杀伤作用均显著提高 图.#* 染色检测 %$. 细胞凋亡 3 对照组 加 "?8?8?8 讨 论 图 + 结晶紫染色检测肿瘤细胞的病变效应 结肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一

5 第 期 黄 越等 复制缺陷型腺病毒 3 的构建及其对结肠癌细胞生长的影响.* 而化疗作为结肠癌综合治疗的重要组成部分 对人体有一定的副作用 因此 临床上迫切需要将放化疗与其他更好的治疗方式相结合 以延长患者的生存期和改善患者的生存质量 在诸多治疗方式中 基因治疗逐渐受到全世界的关注并被广泛研究 本研究利用 3: 系统成功构建携带 =)3/ 基因的复制缺陷型腺病毒 命名为 3:$="$?$ =)3/3 近年来研究发现 在人类恶性肿瘤中 =)3/ 基因所在的 8<)3/ 染色体位点基因异常的频 率仅次于 =* 基因的突变频率 <1 等报道 =)3/ 基因缺失的小鼠能够自发形成肿瘤 并在 年内死亡 同时发现肿瘤的形成常伴随着残留的 3/ 等位基因的丢失和 3/1/3 表达的缺乏 由此看出 =)3/ 基因在肿瘤发生过程中可能起 到一定作用 等报道 在原发性结肠癌的 =)3/ 基因的甲基化频率约 2 而且 =)3/ 的甲基化与 =* 的表达呈负相关 等进一步证明含有未甲基化启动子的 =)3/ 细胞显现出强阳性的? 的核表达 而在 =)3/ 高度甲基化的细胞 用去甲基化试剂处理能使?? 重新定位于核 而且 =* 表达恢复正常 这些研究提示 3/ 基因可能通 3/$??$=* 途径参与了细胞周期的调节 由于 =)3/ 蛋白的表达缺失在人类肿瘤中发生频率高 使 =)3/ 成为基因治疗中一个很好的候选基因 本实验将构建的重组腺病毒感染结肠癌细胞株 "4) 和 %$. 通过检测细胞的存活率来分析腺病毒 3 对结肠癌细胞的杀伤能力 实验结果显示重组腺病毒 3 能够有效地杀伤结肠癌细胞 对细胞进行形态学观察 发现结肠癌细胞 "4) 和 %$. 用 3 处理后出现典型凋亡变化 用来进一步验证的结晶紫实验更直观地显示 病毒对结肠癌细胞 "4) 和 %$. 的杀伤作用呈浓度依赖性 #* 染色发现发生凋亡的细胞中细胞核染色质会发生明显凝集 固缩 并伴有核碎裂及凋亡小体出现 且随着病毒浓度增加 颗粒状或碎片状致密浓染逐渐增多 综上所述 重组腺病毒 3 对两株结肠癌细胞的生长抑制作用显著 说明 =)$ 3/ 基因确实能发挥抑制肿瘤的作用 本研究为 =)$3/ 基因的靶向基因 $ 病毒治疗提供参考 同时也为进一步研究 =)$3/ 基因的抗肿瘤机理奠定了基础 随着对 =)$3/ 基因的深入研究 =)$ 3/ 基因在肿瘤基因治疗中的应用会更加广泛 参考文献 马爱妞 杨春欣 董 颖 等 结肠癌药物治疗的新进展 中国药房 ))? 3"3==$:#!#:#$ ##"!#/#.* $+ %@ -@?%@@-'=1 :#''!=1! =511=1:3'#$ #"#:)$) )7'$/#3?:??/:!8"!#''##:=) 3/1#1#=:=$ 3"!##!$. *7<?3!8# '1 1 =8<)3 1 ==!###9= 1=8<)3=)3/# #1)*$ "!! 3?#!# 11:11@##?# "!#!.$ + 7?@ -<#!?:1 :=:=* ==#= 3:1!?##!*.+.$+ >"%'F57A3/ 1==3/ 1#=!=>$ #1?== 3/$:#1# #811!."#?1""!1:3:1 1:#!'#@=1:=$ #:!1!#1 #A $ <1%:"':<1=%1 =#1 3/$:#1##/#...*..+$ ">? #!:1=)3/:=8<)! ### 78'! +$.?:$: 5 =)3/#!=1=11:$ 1##>?? #/#+$ 下转第. 页

6 . 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 3#4.&$1#$ 3&$$#$ #$ $%$ #"##$ #"##$ $!$! $ 3("&!"9 "#!7!!!"#$%#&'!> -.##%==:##:'>1!!1 :: =!###:'>=' ##'=! 14=###97!! 1::##:1##'::#=!> :::##1::3##1:!=## 91=:=#===:'>##'1$!!1:::#:#::!$1=# /'%:'>!!1::#! =#!'! 责任编辑 马春晓 上接第.* 页 3#.&$#"&$#$7%$$#.$#-%4$!- %#& &8#& '!! 5("'(4(!"$"'!*" "#7"##!"#$%#&'!> -.##%==##=#$:##1:'#:3:$ ="$?$=)3/ 3##=)3/!!3:1!1!$ #1:#####"4):%$.:='$ #1'/1::##3#=?%%1$ ::#1=!##!#== #*#!1:: #:#A'#3#####'$!%"4):%$.'':! =1: =1:##:=:#:#!'3==#:## ##!:1##1:### /'%3:$=)$3/###?%%#'!== 责任编辑 许惠儿

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