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1 第 8 卷第 11 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 11 月 Journal of Food Safety and Quality Nov., 2017 高效液相色谱法同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮胡莉 1,2,3*, 靳可婷 1,2,3, 仲伶俐 1,2,3, 杨晓凤 1,2,3, 江永洪 1,2,3 (1. 四川省农业科学院分析测试中心, 成都 ; 2. 农业部农产品质量安全风险评估实验室 ( 成都 ), 成都 ; 3. 农业部食品质量监督检验测试中心 ( 成都 ), 成都 ) 摘要 : 目的建立高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 测定粮食中 6 种大豆异黄酮 ( 大豆苷大豆黄苷染料木苷大豆素大豆黄素和染料木素 ) 含量的分析方法方法准确称取一定量粉碎混匀后的样品, 经 80% 甲醇提取后取上清液, 过 0.22 µm 有机相滤膜上机采用 Thermo Syncronis C 18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 μm), 以 0.5% 甲酸水溶液 (A) 乙腈(B) 和甲醇 (C) 作为流动相进行梯度洗脱, 流速 0.8 ml/min, 柱温为 35, 于紫外检测器波长 260 nm 处检测, 大豆异黄酮各组分含量以外标法进行定量结果本方法在 30 min 内完成 6 种大豆异黄酮的分离分析, 大豆异黄酮各组分浓度在 0.2~50 µg/ml 范围内呈良好的线性关系 (r>0.999), 平均加标回收率为 96.9%~107.8%, 相对标准偏差 (relative standard deviation, ) 为 0.6%~5.0%, 检出限为 0.03~0.1 µg/ml, 定量限为 0.1~0.3 µg/ml 结论建立的方法具有较高的灵敏度和重复性, 能满足不同粮食种类中大豆异黄酮含量测定关键词 : 高效液相色谱法 ; 大豆异黄酮 ; 粮食 Determination of 6 kinds of isoflavones in food crops by high performance liquid chromatography HU Li 1,2,3*, JIN Ke-Ting 1,2,3, ZHONG Ling-Li 1,2,3, YANG Xiao-Feng 1,2,3, JIANG Yong-Hong 1,2,3 (1. Center of Analysis and Testing, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu , China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment or Agro-Product (Chengdu), Ministry of Agriculture, Chengdu , China; 3. Food Quality Supervision and Inspection Center of Agricultural Ministry of China (Chengdu), Chengdu , China) ABSTRACT: Objective To establish a method for simultaneous determination of 6 kinds of isoflavones (daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein and genistein) in food crops by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods A certain amount of crushed mixed samples were weighed accurately, followed by extracting with 80% methanol, then the supernatant was filtered through 0.22 µm membrane microfilter for analysis. The samples were separated with a Thermo Syncronis C 18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm) at the flow rate of 0.8 ml/min by gradient elution using 0.5% formic acid water (solvent A), acetonitrile (solvent B) and methanol (solvent C). The temperature of the column oven was maintained at 35 and the signal was detected with ultraviolet detector in 260 nm, and the contents of 6 kinds of isoflavones were quantitatively analyzed by external standard method. Results The 6 kinds of isoflavones were separated within 30 min, each compound showed a good linear relationship between peak areas and 基金项目 : 四川省财政基因工程专项资金 ( 优秀论文基金 ) 项目 (2013LWJJ-012, 2014LWJJ-012) Fund: Supported by the Sichuan Province Financial and Genetic Engineering Special Fund Project (Excellent Paper Fund) (2013LWJJ-012, 2014LWJJ-012) * 通讯作者 : 胡莉, 硕士, 副研究员, 主要研究方向为食品质量标准与检测技术 @qq.com *Corresponding author: HU Li, Master, Associate Professor, Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu , China @qq.com

2 第 11 期胡莉, 等 : 高效液相色谱法同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮 4369 concentrations in the concentration range of 0.2~50 μg/ml (r>0.999). The recoveries of 6 kinds of isoflavones in food crops were 96.9%~107.8% with relative standard deviations () of 0.6%~5.0%. The limits of detection (LODs) were 0.03~0.1 µg/ml and the limit of quantification (LOQs) were 0.1~0.3 µg/ml. Conclusion The established method exhibits high sensitivity and repeatability, which can satisfy the determination of isoflavones in different food crops. KEY WORDS: high performance liquid chromatography; isoflavones; food crops 1 引言大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物, 属于生物黄酮, 也是一种植物雌激素, 具有抗氧化活性抑菌作用调节细胞周期等性质, 可预防骨质疏松症动脉硬化乳腺癌及前列腺癌等多种疾病 [1,2] 目前发现大豆中天然存在的大豆异黄酮有大豆苷类染料木苷类和大豆黄苷类, 每类分别以游离型葡萄糖苷型丙二酰基葡萄糖苷型和乙酰基葡萄糖苷 4 种形式存在, 共计 12 种形式 [3], 其中 95% 以上异黄酮以各种糖苷形式存在, 且染料木苷和大豆苷含量较高 [4] 鉴于大豆异黄酮具有的生物活性和优点, 目前食品和农产品中关于大豆异黄酮的功能和作用的研究较为热门, 人们对日常的食物中是否含有相应的营养成份十分好奇, 测定粮食中大豆异黄酮的含量就显得十分必要目前关于大豆异黄酮含量的测定方法主要有 : 紫外分光光度法 (ultraviolet-spectrophotometry, UV) [5] 薄层扫描法(thin layer chromatography scanning, TLCS) [6] 气相色谱法(gas chromatography, GC) [7] 毛细管电泳法 (capillary electrophoresis, CE) [8] 高效液相色谱- 质谱联用法 (high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS) [9] 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC) [10,11] 和超高效液相色谱法 (ultra performance liquid chromatography, UPLC) [12,13] 等 UV 操作简便, 但特异性较差 ; TLCS 显色剂用量难于控制, 造成较大的误差 ; GC 进样量少敏感性高选择性好, 但在测定大豆黄素和染料木素时需要制备衍生物, 样品制备过程复杂, 耗时长 ; CE 测试速度快, 选择性高, 但仪器普及度不高 ; HPLC-MS 虽易于定性和定量, 但仪器价格昂贵, 使用成本高昂 ; HPLC 因其具有测定样品种类多范围广样品制备步骤少分离效率高测定结果准确灵敏度高而且可有多种检测器供选择的优点, 在分析检测方面得到了广泛的应用 [5-13] 关于大豆异黄酮含量测定的报道多数只针对大豆苷染料木苷大豆素和染料木素 4 种以内的组分进行检测, 而同时对 6 种大豆异黄酮 ( 大豆苷 (daidzin), 大豆黄苷 (glycitin) 染料木苷(genistin) 大豆素(daidzein) 染料木素 (genistein) 和大豆黄素 (glycitein)) 的含量测定的研究较少, 而且大豆素 (daidzein) 和大豆黄素 (glycitein) 因其结构相似而分离效果较差本文选择 HPLC 同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮的含量, 建立的检测方法能有效分离这几种物质, 并达到准确定性定量分析的目的 2 材料与方法 2.1 仪器与试剂 Waters e2695 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器 ( 美国 Waters 公司 ); HS10260D 超声波清洗机 ( 天津市恒奥科技发展有限公司 ); AE240 电子天平 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 ); ACD U 实验室超纯化水机 ( 美国艾科浦国际有限公司 ) 乙腈甲醇 ( 色谱纯, 美国 Sigma 公司 ); 甲酸 ( 色谱纯, 美国 TEDIA 公司 ); 实验用水均为去离子水 ; 大豆异黄酮标准品均购于上海安谱实验科技股份有限公司 : 大豆苷 ( 纯度 98.6%) 大豆黄苷( 纯度 99.1%) 染料木苷( 纯度 98.0%) 大豆素( 纯度 99.9%) 染料木素( 纯度 99.9%) 大豆黄素 ( 纯度 100%) 2.2 实验方法标准使用液的配制分别准确称取大豆苷大豆黄苷染料木苷大豆素染料木素和大豆黄素标准品各 5.00 mg, 用甲醇溶解并定容至 10.0 ml 容量瓶中, 即为 500 µg/ml 的单标储备液, 于 20 下, 贮存于密闭的棕色玻璃瓶中混合标准使用液的配制 : 将单标储备液混合, 并用 80% 甲醇溶液逐级稀释成和 50.0 µg/ml 的大豆异黄酮混合标准使用液样品前处理将干样粉碎后过 100 目筛, 称取 1.0 g 置于 25 ml 比色管中, 加入提取液甲醇与水混合液 (4:1, V:V), 定容至刻度, 摇匀后超声提取 30 min, 静置 30 min, 取上清液, 用 0.22 μm 有机相滤膜过滤, 待测液相条件色谱柱 : Thermo Syncronis C 18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 µm) 流动相 A 为 0.5% 的甲酸水溶液, B 为乙腈, C 为甲醇 ; 流速 : 0.8 ml/min, 进样体积 : 10 μl, 柱温 : 35 ; 检测波长 : 260 nm; 梯度洗脱程序见表 1

3 4370 食品安全质量检测学报第 8 卷表 1 流动相梯度程序 Table 1 Mobile phase gradient program 时间 (min) A B C 曲线线性线性线性线性线性线性线性线性线性 3 结果与讨论 3.1 样品提取条件优化目前大豆异黄酮提取方法有浸提法 ( 醇浸提丙酮酸性溶液浸提 ) 水解法( 酸法水解酶法水解 ) 超声波提取法高压湿法和超滤法等 [14-16] 基于文献的报道和本实验室原有的工作基础, 以黄豆为代表性样品, 用不同浓度的甲醇和丙酮进行提取效果对比, 每组提取液做 3 个平行黄豆样品称样量 1.0 g 左右, 分别用不同比例的提取液定容到 25 ml, 超声提取 30 min 后静置 30 min, 取上清液, 过 0.22 µm 有机相滤膜上机测定采用不同提取液的提取效果如图 1 所示结果表明, 80% 甲醇和 90% 甲醇提取效果最佳, 相对偏差也最小, 提取率最高最稳定 80% 甲醇和 90% 甲醇提取效率接近, 但经检测发现 90% 甲醇提取杂质含量较高, 导致色谱图杂质峰较多此外, 由于丙酮的紫外截止波长为 330 nm, 其在检测波长为 260 nm 处有很强的吸收峰, 不便于色谱峰的定量分析, 综合考虑到检测成本以及有机溶剂的毒性, 确定提取液为 80% 甲醇 3.2 液相色谱方法的确定 [17] 查阅文献并结合光谱扫描得知 6 种大豆异黄酮在紫外可见波长 260 nm 处均有较大吸收, 故选取 260 nm 作为检测波长, 同时选取可耐低 ph 的 Thermo Syncronis C 18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 µm) 作为分离液相色谱柱, 考虑到分离效果及柱压, 将流速设为 0.8 ml/min, 进样量为 10.0 µl 分离结构和性质相近的 6 种大豆异黄酮, 如果只选择两相作为流动相, 会导致分离效果不好, 使大豆苷和大豆黄苷大豆素和黄豆素不能实现基线分离, 因此选择了 0.5% 的甲酸水溶液甲醇和乙腈 3 种流动相进行分离在分离分析过程中, 由于样品杂质出峰时间在 6 min 以内, 出现干扰峰较多, 而出峰时间晚于 15 min 后, 出峰会展宽为确保 6 种大豆异黄酮能达到基线分离, 并使标准物质出峰尖锐, 经过分离条件优化, 最后确定分离的梯度洗脱程序见表 1, 在此色谱分离条件下, 6 种大豆异黄酮混合标准溶液的分离色谱图如图 2 所示由于液相色谱分离条件梯度洗脱中起始条件有机相占的比例为 28%, 而样品提取最佳条件为 80% 甲醇, 为避免溶剂效应, 进样体积不应大于 10 µl 如果进样体积大, 会导致保留时间靠前的物质峰形变差 3.3 方法的线性范围检出限及定量限用标准储备溶液经逐级稀释 ( 溶剂为 80% 甲醇 ), 得到浓度为 µg/ml 的标准使用液, 依次进液相色谱进行分析以峰面积为纵坐标 (Y), 标样浓度为横坐标 (X) 进行回归分析, 结果表明, 标准物质在 0.2~50 µg/ml 浓度范围内, 呈良好的线性关系, 线性方程及相关系数 r 值见表 2 检出限(limit of detection, LODs) 在 0.03~0.10 µg/ml 之间, 定量限 (limit of quantification, LOQs) 为 0.10~0.30 µg/ml 之间 Fig. 1 图 1 不同提取液提取结果 Contents of isoflavones with different extraction solvents

4 第 11 期胡莉, 等 : 高效液相色谱法同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮 4371 注 : 1. 大豆苷 ; 2. 大豆黄苷 ; 3. 染料木苷 ; 4. 大豆素 ; 5. 黄豆素 ; 6. 染料木素图 2 6 种大豆异黄酮标准溶液 HPLC 色谱分离图 Fig. 2 HPLC chromatograms of 6 kinds of isoflavones standard 表 2 6 种大豆异黄酮回归方程相关系数检出限和定量限 Table 2 Regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 6 kinds of isoflavones 名称线性方程相关系数 r LOD(µg/mL) LOQ(µg/mL) 大豆苷 (daidzin) Y=47.905X 大豆黄苷 (glycitin) Y=51.10X 染料木苷 (genistin) Y=69.39X 大豆素 (daidzein) Y=77.86X 大豆黄素 (glycitein) Y=66.53X 染料木素 (genistein) Y=94.36X 干扰及回收率试验为了评价方法的可靠性, 选取红豆小米和黄豆为代表进行干扰和回收率试验准确称取一定质量的样品, 按样品前处理方法进行处理并分别加入 1 2 和 5 µg/ml 3 个浓度的混合标准溶液对比, 每个浓度进行 6 个平行实验样品加标图谱及空白样品对照图谱见图 3 其中红色线条表示样品加标后的色谱图, 黑色线条表示样品基质的图谱从图 3 可以看出, 样品中的杂质峰与目标化合物完全分离, 对定性定量不产生干扰大豆异黄酮各组分在基质中经提取后, 回收率在 96.9%~107.8%, 相对标准偏差 (relative standard deviation, ) 在 0.6%~5.0%( 见表 3) 结果表明, 此方法检测结果准确可靠, 重复性好, 可用于粮食中大豆异黄酮含量的测定 3.5 实际样品测定在市场上购买黄豆黑豆红豆荞麦燕麦高粱西米等样品共 16 个品种, 用建立的检测方法进行样品测定每个样品平行测定 3 次从检测结果可以看出, 黄豆黑豆红豆以及荞麦中含有大豆异黄酮黄豆中含有所检测的 6 种大豆异黄酮, 黑豆中含有除大豆黄素以外的 5 种, 荞麦中染料木苷和大豆黄素含量最高, 红豆中含有染料木苷 4 结论本文建立了同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮含量的高效液相色谱法样品经 80% 甲醇提取后经 Thermo Syncronis C 18 柱分离, 采用 0.5% 的甲酸水溶液乙腈和甲醇 3 相梯度洗脱, 可以得到较好的分离效果该方法操作简单检测灵敏度高, 样品中的杂质峰与目标化合物完全分离, 检测结果重复性好通过对市场上购买的多种粮食样品进行检测, 发现粮食中大豆异黄酮含量差异较大, 除黄豆黑豆红小豆和荞麦中含有大豆异黄酮外, 大多数粮食作物不含有大豆异黄酮, 检测结果可以为食品加工和其它研究提供数据支持

5 4372 食品安全质量检测学报第 8 卷 Fig. 3 图 3 红豆小米和黄豆样品加标前后色谱图对比 (5 µg/ml) HPLC chromatograms of blank samples and samples spiked at 5 µg/ml 样品黄豆红豆小米添加水平 (µg/ml) 回收率大豆苷 (daidzin) 表 3 6 种大豆异黄酮的加标回收率和相对标准偏差 (n=6) Table 3 Spiked recoveries and s of 6 kinds of isoflavones (n=6) 大豆黄苷 (glycitin) 回收率染料木苷 (genistin) 回收率大豆素 (daidzein) 回收率大豆黄素 (glycitein) 回收率染料木素 (genistein) 回收率

6 第 11 期胡莉, 等 : 高效液相色谱法同时测定粮食中 6 种大豆异黄酮 4373 表 4 实际样品检测结果 (n=3) Table 4 Test results of actual samples (n=3) 样品名称大豆苷 (daidzin) 大豆黄苷 (glycitin) 染料木苷 (genistin) 大豆素 (daidzein) 大豆黄素 (glycitein) 染料木素 (genistein) 黄豆黑大豆 ND 荞麦 ND ND ND ND 红小豆 ND ND ND ND ND 高粱米 ND ND ND ND ND ND 大麦米 ND ND ND ND ND ND 白云豆 ND ND ND ND ND ND 小白云豆 ND ND ND ND ND ND 西米 ND ND ND ND ND ND 燕麦米 ND ND ND ND ND ND 红皮花生 ND ND ND ND ND ND 花芸豆 ND ND ND ND ND ND 糙米 ND ND ND ND ND ND 薏仁 ND ND ND ND ND ND 玉米渣 ND ND ND ND ND ND 黑米 ND ND ND ND ND ND 注 : ND 表示未检出参考文献 [1] Uifălean A, Schneider S, Ionescu C, et al. Soy isoflavones and breast cancer cell lines: Molecular mechanisms and future perspectives [J]. Molecules, 2015, 21(1): E13. [2] Villares A, Rostagno MA, García-Lafuente A, et al. Content and profile of isoflavones in soy-based foods as a function of the production process [J]. Food Bioprocess Technol, 2011, 4(1): [3] 高秀芝, 刘慧, 丁雪莲, 等. 大豆异黄酮的研究与应用进展 [J]. 食品科学, 2004, 25(11): Gao X Z, Liu H, Ding XL, et al. Progress on the study and application of soybean isoflavones [J]. Food Sci, 2004, 25(11): [4] 徐颖. 高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量 [J]. 粮油食品科技, 2006, 14(6): Xu Y. Determination of the soybean isoflavone content by HPLC [J]. Sci Technol Cereals, Oils Foods, 2006, 14(6): [5] 都启晶, 王艺颖, 丁君, 等. 大豆发芽过程中维生素 C 异黄酮含量变化及其抗氧化性的研究 [J]. 食品安全质量检测学报, 2015(9): Du QJ, Wang YY, Ding J, et al. Changes of vitamin C, isoflavone and antioxidant activity during the germination of soybean [J]. J Food Saf Qual, 2015(9): [6] Yuan D, Chen Y, Bai X, et al. TLC and HPLC analysis of soy isoflavones in semen Sojae praeparatum [J]. Asian J Tradit Med, 2006, (3-4): [7] Adlercreutz H, Van DWJ, Kinzel J, et al. Lignan and isoflavonoid conjugates in human urine [J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 52(1): [8] 张海军, 王英, 王庆钰. 大豆异黄酮检测方法研究概述 [J]. 粮食与油脂, 2011, (3): Zhang HJ, Wang Y, Wang QY. Survey on methods of detection for soybean isoflavone [J]. Cereals Oils, 2011, (3):

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.