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宛干
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1 44 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 研究论文新型环磷酰胺类衍生物 9b 体内外抗肿瘤作用崔朴梅 1, 舒丽 1, 刘菲 1, 杨俊卿 1, 宋杨 2, 孙文娟 1* (1. 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室, 重庆医科大学药学院药理学教研室, 重庆 ; 2. 西南大学药学院, 重庆 ) 摘要 : 探讨新型环磷酰胺类衍生物 4, 6- 二苯基环磷酰胺 (9b) 的体内外抗肿瘤活性及其作用机制体外采用 MTT 法观察 9b 对人肝癌细胞株 HepG 2 人乳腺癌细胞株 MCF-7 人白血病细胞株 K562 的增殖抑制作用 ; 流式细胞仪观察细胞的凋亡率和细胞周期的变化 ; 体内建立肝癌 H 22 荷瘤小鼠模型, 观察 9b 的抑瘤效果结果表明, 9b 对体外培养的 HepG 2 MCF-7 K562 细胞有抑制增殖作用, 且具有剂量和时间依赖性, 9b 处理 HepG 2 MCF-7 K562 细胞 48 h 的 IC 50 分别为 μmol L 1 ; 9b 使 HepG 2 MCF-7 细胞的 G 0 /G 1 期细胞和 K562 细胞的 G 0 /G 1 和 G 2 /M 期细胞明显增加, 细胞凋亡率随药物浓度增加亦呈增长趋势 ; 9b 对 H 22 实体瘤具有明显的抑制作用结果提示, 9b 具有明显的体内外抗肿瘤活性, 其抑瘤机制可能与细胞周期改变和诱导肿瘤细胞凋亡相关关键词 : 环磷酰胺类衍生物 ; 抗肿瘤活性 ; 细胞周期 ; 细胞凋亡中图分类号 : R965 文献标识码 : A 文章编号 : (2014) Anti-tumor effects of a novel cyclophosphamide derivate 9b in vivo and in vitro CUI Pu-mei 1, SHU Li 1, LIU Fei 1, YANG Jun-qing 1, SONG Yang 2, SUN Wen-juan 1* (1. Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology of Chongqing, Department of Pharmacology, Pharmaceutical College, Chongqing Medical University, Chongqing , China; 2. Pharmaceutical College, Xinan University, Chongqing , China ) Abstract: This study is to investigate the anti-tumor activities of a novel cyclophosphamide derivate 4, 6- diphenyl cyclophosphamide (9b) in vivo and in vitro, and its possible mechanism of action. The inhibitory effects of 9b on human hepatoma cell line HepG 2, human breast carcinoma cell line MCF-7 and human myeloid leukemia cell line K562 were measured by MTT assay in vitro. Cell cycle distribution and apoptotic rate were evaluated by flow cytometry. To evaluate the anti-tumor effect of 9b in vivo, mouse model bearing inoculated H 22 tumor was established. The results indicated that 9b could inhibit the proliferation of HepG 2, MCF-7 and K562 cells in a dose and time dependent manner. The IC 50 values of 9b were μmol L 1 to HepG 2 cells, μmol L 1 to MCF-7 cells and μmol L 1 to K562 cells after incubation for 48 h. The results of flow cytometry indicated that after being treated for 48 h with different concentrations of 9b, the ratios of HepG 2, MCF-7 cells at the G 0 /G 1 phase and K562 cells at the G 0 /G 1 phase and G 2 /M phase increased significantly compared with control group, and the apoptotic rate increased with the increase of the concentration of 9b. 9b could significantly reduce tumor weight of H 22 solid tumor mouse model in vivo. To summarize, 9b showed significantly anti-tumor activity in vivo and in vitro, of which the mechanism might be associated with the change of cell cycle distribution and induction of tumor cell apoptosis. Key words: cyclophosphamide derivate; anti-tumor activity; cell cycle; apoptosis 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 中央高校基金科研业务费重点项目 (XDJK2010B008); 国家重大新药创制科技重大专项资助项目 (2010ZX ). * 通讯作者 Tel / Fax: , @qq.com

2 崔朴梅等 : 新型环磷酰胺类衍生物 9b 体内外抗肿瘤作用 45 恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的常见病多发病目前化学治疗在肿瘤的治疗中占有极为重要的地位, 但多数抗肿瘤药在杀伤癌细胞的同时, 也杀伤正常细胞, 不良反应广泛严重环磷酰胺是一类临床常用的氮芥类抗肿瘤药物, 抗瘤谱广, 对恶性淋巴瘤疗效显著, 对急性或慢性淋巴细胞白血病多发性骨髓瘤乳腺癌等也有较好疗效 [1] 环磷酰胺在体外并无抗肿瘤活性, 进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺, 而醛磷酰胺不稳定, 在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛, 酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用 [2] 但是使用环磷酰胺会带来常见的不良反应, 如胃肠不能耐受骨髓受抑制脱发无菌性膀胱炎以及依赖性地引起肝损伤等 [3] 目前一致认为, 这些不良反应是其代谢产物丙烯醛所致代谢过程中, 丙烯醛的产生导致了严重的膀胱毒性, 限制了临床的使用为了使环磷酰胺在抗肿瘤的同时降低丙烯醛的产生, 减少膀胱毒性, 增加适用 [4] 范围, 西南大学宋杨等合成了一系列 4, 6- 二苯基环磷酰胺类衍生物, 且前期研究显示, 9b ( 图 1) 致 SD 大鼠的膀胱毒性明显低于环磷酰胺为了进一步了解 9b 的体内外抗肿瘤活性, 本文初步研究了 9b 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞和 H 22 实体瘤的抑制作用及其作用机制, 为其进一步应用研究提供理论基础 Figure 1 Chemical structure of novel cyclophosphamide derivative 4, 6-diphenyl cyclophosphamide ( 9b) 材料与方法药品试剂和仪器 9b 由西南大学药学院宋杨老师提供, 纯度 99% 噻替哌 (THT) 注射液 ( 上海旭东海普药业有限公司 ); 环磷酰胺 (CTX, 山西普德药业股份有限公司 ); RPMI 1640 培养基 DMEM 培养基胎牛血清 ( 美国 Hyclon 公司 ); 二甲基亚砜 (DMSO) 和胰蛋白酶 (Amresco 公司 ); PBS 液 ( 北京鼎国生物技术公司 ); MTT ( 美国 Sigma 公司 ); 细胞周期检测试剂盒 ( 南京凯基生物科技发展有限公司 ); Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒 ( 杭州隆基生物技术有限公司 ) 3111 型二氧化碳培养箱 ( 美国 ThermoForma 公司 ); 超净工作台 ( 北京昌平长城空气净化工程公司 ); 倒置荧光显微镜 ( 日本 Nikon 公司 ); 多管架自动平衡离心机 TD5A-WS ( 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 ); BIO-RAD550 型自动酶标读数仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ); FACS Calibar 流式细胞仪 ( 美国 Becton-Dickins 公司 ); 细胞计数器 ( 北京六一仪器厂 ) 细胞株及动物人肝癌 HepG 2 细胞株人乳腺癌 MCF-7 细胞株由重庆医科大学生物化学与分子药理学实验室惠赠 ; 人白血病 K562 细胞株由重庆医科大学分子生物学重点实验室惠赠 ; 小鼠肝癌 H 22 细胞株由重庆医科大学超生研究所惠赠 SPF 级昆明种小鼠购自重庆医科大学实验动物中心 ( 动物许可证号 : SCXK ( 渝 ) ), 4~6 周龄, 体重 (18~22) g, 雌雄各半细胞培养取 HepG 2 K562 H 22 细胞, 培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液, 置于 37 5% CO 2 培养箱, 每 1~2 天更换 1 次培养液 ; MCF-7 细胞于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中常规培养, 每 1~2 天更换 1 次培养液培养 3 天左右进行传代, 取对数生长期细胞进行实验 MTT 比色法检测细胞抑制率取对数生长期的 HepG 2 MCF-7 K562 细胞, 接种于 96 孔板, 每孔 100 μl ( 含个细胞 ), 待细胞贴壁后分别加入各种终浓度的 9b, 每个浓度设 5 个平行复孔, 并设溶剂对照组和空白对照组, 噻替哌 (THT) 作为阳性药物对照组分别于药物作用及 72 h 后, 加入 MTT 溶液 20 μl, 继续培养 4 h, 弃去培养液, 加入 DMSO 150 μl, 振荡 10 min, 酶标仪测定 490 nm 波长处活细胞的 OD 值, 计算抑制率 (IR) 和 IC 50 IR = (1 实验组 OD 值 / 对照组 OD 值 ) 100% Annexin V-FITC 双染法检测细胞凋亡分别取处于对数生长期的 HepG 2 MCF-7 K562 细胞, 制成单细胞悬液, 以细胞数 / 孔接种于 6 孔板, 每孔 2 ml; 待细胞贴壁 (24 h) 后, 用终浓度为 0 1/2 IC 50 IC 50 的 9b 处理细胞 48 h, PBS 洗涤 2 次, 收集细胞, 按 Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒说明书进行操作 : 加入 Annexin V-FITC 5 μl 混匀后, 加入碘化丙啶 (PI) 5 μl, 混匀 ; 室温避光反应 10 min, 采用流式细胞仪检测, 分析细胞凋亡比率流式细胞仪检测细胞周期分别取处于对数生长期的 HepG 2 MCF-7 K562 细胞, 制成单细胞悬液, 以细胞数 / 孔接种于 6 孔板, 每孔 2 ml; 待细胞贴壁 (24 h) 后, 用终浓度为 0 1/2 IC 50 IC 50

3 46 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 的 9b 处理细胞 48 h, PBS 洗涤 2 次, 收集细胞, 用 0.7% 冷乙醇固定, 4 保存过夜弃去乙醇, 再次悬浮细胞于 PBS, 溴化丙啶 (PI, 10 mg L 1 ) 染色 5 min, 4 避光 30 min, 采用流式细胞仪检测细胞周期, 得出细胞周期分布图荷瘤小鼠模型的建立分组与给药分别取对数生长期的小鼠肝癌 H 22 细胞, 制成细胞数为 /ml 的单细胞悬液, 接种于小鼠腹腔 (0.2 ml/ 只 ), 1 周后出现明显腹水时断颈处死小鼠 ; 在无菌条件下抽取适量腹水细胞, 用 PBS 洗涤 3 次后, 调整细胞数为 /ml, 接种于小鼠右腋下 (0.2 ml/ 只 ) 于接种后的第 2 天将小鼠随机分为 5 组并给药, 每组 10 只, 雌雄各半且分笼饲养 : 9b 高剂量组 (30 mg kg 1 d 1 ) 中剂量组 (10 mg kg 1 d 1 ) 低剂量组 (3 mg kg 1 d 1 ) 环磷酰胺组 (20 mg kg 1 d 1 ) 生理盐水组 (10 ml kg 1 d 1 ); 每组均连续腹腔注射给药 10 天药物抑瘤作用评价于末次给药后次日断颈处死小鼠, 剥离肿瘤组织, 称取瘤重, 并按下式计算抑瘤率 : 抑瘤率 (%) = (1 实验组瘤重 / 对照组瘤重 ) 100% 统计学处理所得实验数据以 x ± s 表示, 经 SPSS17.0 统计软件包处理, 两组间比较采用 t 检验和单因素方差分析结果 1 9b 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞的体外增殖抑制作用结果 ( 图 2A~C) 显示, 不同浓度的 9b 分别作用于 HepG 2 MCF-7 K562 细胞和 72 h, 均表现出一定程度的抑制作用, 且呈剂量和时间依赖性, 作用 48 h 的 IC 50 分别为及 μmol L 1 阳性对照噻替哌 (THT) 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞均有明显的抑制作用 ( 图 2D~F), 作用也呈剂量和时间依赖性, 作用 48 h 的 IC 50 分别为及 160 μmol L 1 2 9b 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞凋亡的影响 FCM 检测细胞凋亡率结果 ( 图 3 和表 1) 显示, HepG 2 MCF-7 K562 细胞经各自 1/2 IC 50 IC 50 的 9b 处理 48 h 后, 与空白对照组比较, 各细胞均出现明显凋亡 (P < 0.05, P < 0.01), 凋亡细胞数随浓度增大而增多, 呈浓度依赖性 9b 诱导 MCF-7 和 K562 细胞凋亡更明显 3 9b 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞周期的影响 FCM 检测细胞周期结果 ( 图 4 和表 1) 显示, HepG 2 MCF-7 K562 细胞经各自 1/2 IC 50 IC 50 的 9b 处理 48 h 后, 与空白对照组比较, HepG 2 MCF-7 细胞 G 0 /G 1 期细胞含量明显增多, K562 细胞 G 0 /G 1 期和 G 2 /M 期细胞含量明显增多, 差异有统计学意 Figure 2 The growth inhibition effect of 9b and thiotepa (THT) on HepG 2, MCF-7 and K562 cells. A C: Cells were treated with 9b (3.7, 11.1, 33.3, 100 and 300 μmol L 1 for HepG 2; 18.7, 37.5, 75, 150 and 300 μmol L 1 for MCF-7; 37.5, 75, 150, 300 and 600 μmol L 1 for K562) for 24, 48 and 72 h, separately ( n = 3); D F: Cells were treated with THT (102, 204, 408, 816 and μmol L 1 ) for 24, 48 and 72 h, separately (n = 3)

4 崔朴梅等 : 新型环磷酰胺类衍生物 9b 体内外抗肿瘤作用 47 Figure 3 Effect of 9b on apoptosis rates of HepG 2, MCF-7 and K562 cells detected by flow cytometry. Cells were treated with different concentrations of 9b for 48 h, separately (n = 3) Table 1 Effect of 9b on cell cycle distribution and the apoptosis rate of HepG 2, MCF-7 and K562 cells. n = 3, x ± s. ** P < 0.01 vs control group * P < 0.05, Cell line Concentration /μmol L 1 Apoptosis/% Cell cycle G 0/G 1 (%) S (%) G 2/M (%) HepG 2 Control 7.44 ± ± ± ± ± 0.21 * ± 2.16 * ± 1.07 * 8.24 ± 1.76 * ± 0.31 ** ± 1.10 * ± ± 0.41 * MCF-7 Control ± ± ± ± ± 3.40 ** ± 1.27 * ± ± ± 0.89 ** ± 2.37 ** ± 1.50 ** 5.64 ± 1.36 * K562 Control 5.80 ± ± ± ± ± 0.91 ** ± ± 3.02 * 8.55 ± 1.11 * ± 0.45 ** ± 2.03 ** ± 1.34 ** ± 1.83 ** 义 (P < 0.05, P < 0.01) 结果说明, HepG 2 MCF-7 细胞被阻止于 G 1 期, K562 细胞被阻止于 G 1 期和 G 2 期 4 9b 对荷瘤小鼠 H 22 肿瘤的抑制作用结果 ( 表 2) 显示, 9b 对小鼠肝癌 H 22 实体瘤具有抑制作用, 且呈剂量依赖性 9b 高中低剂量组和环磷酰胺组较生理盐水组平均瘤重均明显降低, 其抑瘤率分别为 39% 32% 31% 和 30%, 差异有统计学意义 (P < 0.01, P < 0.05), 9b 与环磷酰胺的抑瘤作用相当环磷酰胺组给药后与给药前比较, 体重明显减轻 (P < 0.05), 9b 高中低剂量组给药前后体重均无显著性差异

5 48 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): Figure 4 Effect of 9b on the cell cycle distribution of HepG2, MCF-7 and K562 cells detected by flow cytometry. with different concentrations of 9b for 48 h, separately ( n = 3) Table 2 Effect of 9b on the tumor weight of mice bearing H 22 xenografts vs before administration Group 9b n = 10, x ± s. * P < 0.05, Body weight/g Cells were treated ** P < 0.01 vs NS group; Dose /mg kg 1 d 1 Before administration After administration ± ± ± 0.31 * ± ± ± 0.25 * ± ± 2.93 CTX ± ± 2.05 NS ± ± 3.19 Average tumor weight/g 0.69 ± 0.28 ** P< Inhibition rate/% ± 0.22 * ± 0.40 临床上使用较广泛的抗肿瘤药物本实验结果显示, 讨论恶性肿瘤严重威胁着人类的生命药物治疗在肿 9b 对体外培养的 HepG2 MCF-7 K562 细胞有明显瘤的治疗中占有重要的地位, 发展速度也最快尽管的增殖抑制作用, 作用呈时间和剂量依赖性, 48 h 的细胞毒类抗肿瘤药物存在治疗窗窄毒副作用大的缺 IC50 分别为 μmol L 1; 表明 9b 点, 但目前或在相当长一段时期内, 传统细胞毒类药不需经体内代谢活化, 可直接在体外发挥抗肿瘤作物仍将是肿瘤药物治疗的主体 [5, 6] 环磷酰胺是目前用, 优于环磷酰胺

6 崔朴梅等 : 新型环磷酰胺类衍生物 9b 体内外抗肿瘤作用 49 细胞凋亡 (apoptosis) 属生理性的细胞程序化死亡, 不同于细胞的病理性死亡细胞坏死 (necrosis) 肿瘤细胞发生凋亡后, 自然失去恶性增殖的活性 [7] 细胞凋亡可被多种因素诱导发生, 具有特殊的形态和生化变化迄今发现, 大多数抗肿瘤化学药物都能引起肿瘤细胞凋亡 [8, 9] 诱导凋亡可能是不同抗肿瘤药物发挥作用的共同通路, 因此认为诱导癌细胞凋 [10, 11] 亡发生是寻找抗癌药物的新靶点和评估抗肿瘤药物作用能力的一项重要指标 [12] 本实验结果表明, 9b 可诱导 HepG 2 MCF-7 K562 细胞凋亡, 呈剂量依赖性但 9b 诱导 HepG 2 细胞的凋亡作用较弱, 具体机制还需进一步研究细胞周期调控异常是肿瘤发生的一个重要原因, 细胞周期调控既影响其分裂增殖又可诱发凋亡在细胞周期调控中, 有 G 1 /S 和 G 2 /M 两个关键调控点, G 1 /S 期调控点是细胞对复杂的细胞内外信号及 DNA 损伤情况等进行整合和传递, 决定细胞进入分裂程序, 发生程序性死亡, 还是进入静止的 G 0 期, 是启动细胞周期调控的关键 [13] ; G 2 /M 期调控点是细胞内外信号传递整合收集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点 [14] 目前临床上使用的大部分细胞毒类药物均为细胞周期非特异性药物, 存在严重的毒性反应, 因此研究开发毒性低的细胞周期特异性药物具有重大意义大量实验表明, 许多抗癌药对细胞周期有特异性阻断作用 [15] 本研究采用流式细胞术分析 9b 对 HepG 2 MCF-7 K562 细胞周期的影响, 结果显示, 不同浓度的 9b 处理 48 h, 可引起 HepG 2 MCF-7 的细胞周期阻滞在 G 1 期, K562 的细胞周期阻滞在 G 1 期和 G 2 期, 提示细胞周期阻滞可能是 9b 抑制肿瘤细胞生长增殖的机制之一体内实验结果显示, 9b 对 H 22 实体瘤具有明显的抑制作用, 其作用强度与环磷酰胺相当, 说明 9b 具有良好的体内抗肿瘤活性同时, 给药前后环磷酰胺组动物体重明显减轻, 9b 各剂量组的动物体重无明显变化, 说明 9b 的毒性低于环磷酰胺综上所述, 9b 在体内外均具有明显抗肿瘤活性, 其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞有关, 更深入的作用机制有待于进一步研究 References [1] Baumann F, Preiss R. Cyclophosphamide and related anticancer drugs [J]. 2001, 764: J Chromatogr B Biomed Sci Appl, [2] Shi C, Liao MY. Analysis of metabolic characteristic of cyclophosphamide and ifosfamide in vivo [J]. Pharm J Chin PLA ( 解放军药学学报 ), 2001, 17: [3] Wang C, Wang YT, Wei X. The clinical application status of cyclophosphamide [J]. J Clin Exp Med ( 临床和实验医学杂志 ), 2008, 7: [4] Song Y, Song EQ, Li XY. Cyclophosphamide derivatives and the use of as antineoplastic: CN, A [P] [5] Zhuang YY, Zhou CH, Wang YF, et al. Advances of nitrogen mustard compounds in antitumor agents [J]. Chin Pharm J ( 中国药学杂志 ), 2008, 43: [6] Zhang WN, Liao ZY. Advances in anti-tumor drug innovation [J]. Chin J New Dr ( 中国新药杂志 ), 2010, 19: , [7] Gerschenson LE, Rotello RJ. Apoptosis: a different type of cell death [J]. FASEB J, 1992, 6: [8] Gartel AL. Mechanisms of apoptosis induced by anticancer compounds in melanoma cells [J]. Curr Top Med Chem, 2012, 12: [9] Mahalingam D, Oldenhuis CN, Szegezdi E, et al. Targeting TRAIL towards the clinic [J]. Curr Drug Targets, 2011, 12: [10] Saleh M, Vaillancont JP, Graham RK, et al. Differential modulation of endotoxin responsiveness by human caspace-12 polymorphisms [J]. Nature, 2004, 429: [11] Thiantanawat A, Long BJ, Brodie AM. Signaling pathways of apoptosis activated by aromatase inhibitors and antiestrogens [J]. Cancer Res, 2003, 63: [12] Ulivi P, Zol W, Fabbri F, et al. Cellularbasis of antiproliferative and antitum or activity of the novel camptothecin derivative, gimatecan, inbladder carcinomamodels [J]. Neoplasia, 2005, 7: [13] Liu LL, Chen N, Yuan X, et al. The mechanism of alteronol inhibiting the proliferation of human promyelocytic leukemia HL-60 cells [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2012, 47: [14] Imoto Y, Yoshida Y, Yagisawa F, et al. The cell cycle including the mitotic cycle and organelle division cycles, as revealed by cytological observations [J]. J Electron Microsc (Tokyo), 2011, 60: [15] Umemura S, Takekoshi S, Suzuki Y, et al. Estrogen receptornegative and human epidermal growth factor receptor 2-negative breast cancer tissue have the highest Ki-67 labeling index and EGFR expression: gene amplification does not contribute to EGFR expression [J]. Oncol Rep, 2005, 14:

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲