774 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jun;32(6) 1.1 主要试剂 isatin 购自上海元吉化工有限公司, 使用少量 DMSO 将其溶解, 母液浓度配制为 5mmol L -1, 于 4 保存, 备用 实验时用无血清培养基稀释至实验浓度

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1 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jun;32(6):773~8 773 网络出版时间 : :39 网络出版地址 :htp:// 论 著 天然活性分子 isatin 经 p53 介导的线粒体途径诱导乳腺癌细胞 MCF 7 凋亡 宋金莲 1, 马中良 2, 迟晓伟 3, 陈艳萍 1 4, 侯琳 (1. 青岛大学附属妇女儿童医院检验科, 山东青岛 ;2. 青岛大学附属医院乳腺外科, 山东青岛 ; 3. 即墨市妇幼保健院检验科, 山东即墨 ;4. 青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室, 山东青岛 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R329.25;R737.9;R979 1 摘要 : 目的探讨吲哚醌 (isatin) 对乳腺癌细胞 MCF 7 的抗肿瘤作用及其具体的调控机制 方法不同浓度 isatin( μmol L -1 ) 作用于乳腺癌细胞 48h 后, 利用细胞荧光染色 RT PCR Westernblot 及流式细胞术等方法检测 isatin 的促凋亡作用 结果不同浓度 isatin 处理 MCF 7 细胞 48h, 荧光显微镜观察到细胞出现核染色质聚集 细胞体积缩小及 DNA 断裂等典型的凋亡形态学改变 RT PCR 和 Westernblot 结果证实, 随着 isatin 浓度的不断增加,p53 Bax mrna 和蛋白表达量也逐渐增加, 而 Bcl 2mRNA 及蛋白表达下降 ; 流式细胞仪结果提示不同药物浓度作用的细胞膜电位出现不同程度的下降,caspase 9 被激活 Westernblot 结果显示 isatin 处理组细胞胞质细胞色素 C 含量明显增加, 相反线粒体中细胞色素 C 含量相应降低 结论 isatin 具有明显诱导乳腺癌细胞 MCF 7 凋亡的作用, 其可能的作用机制是经 p53 的线粒体凋亡通路被激活 关键词 : 吲哚醌 ; 乳腺癌细胞 ; 凋亡 ;p53;bcl 2;Bax; 线粒体膜电位随着长春碱 长春新碱等新型抗肿瘤药物在临床上的应用, 天然吲哚类化合物的抗肿瘤作用日益引起人们的关注, 因其毒性低而迅速成为抗癌药物研究的热点 isatin, 又名靛红, 系天然存在于自然界的吲哚类化合物 [1], 是我国独创 I 类天然抗癌新药靛玉红的单体结构, 存在于人体及多种生物体中, 收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No ); 青岛市卫生局项目 (No2014WJZD135); 青岛市科技局项目 (No nsh) 作者简介 : 宋金莲 (1981-), 女, 博士生, 研究方向 : 肿瘤分子生物学,E mail:songjinlian@126.com; 侯琳 (1962-), 女, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 肿瘤分子生物学, 通讯作者,E mail:qdhoulin@ yahoo.com 也存在于大青叶及清热解毒抗癌中药青黛中, 具有 [2] 广泛的生物学活性和生物学效应 [3] 1999 年, [4] Yue 等首次报告了 isatin 有抗氧自由基作用, 能够保护正常神经细胞, 并可减轻 H 2 O 2 导致的多巴胺 [5] 能细胞损伤 在之后的研究中,Cane 等报道用 i satin 和 5 羟基吲哚处理 N1E 115 神经母瘤细胞系, 可抑制 ERK 2 的磷酸化, 从而抑制细胞增殖 促进细胞凋亡 isatin 的这种既能抗肿瘤, 又可通过抗氧自由基保护正常细胞的特性是目前大多数抗肿瘤药所不具有的重要特征 isatin 分子量小 (Mr147), 能口服给药, 具有靶向抑制肿瘤细胞增殖并避免损伤正常细胞的优点, 毒副作用低 ( 已完成急性毒性实验和 6 个月的长期毒性实验, 未发现 isatin 有明显毒性 ), 故认为 isatin 是很有开发价值的天然的小分子化合物类药物 研究表明,isatin 及其衍生物具有抗肿瘤活性, 但这些研究大多限于现象描述, 对抗肿瘤活性机制的研究报道较少, 如 isatin 能明显抑制人类急性骨髓性白血病 (HL60) 肿瘤细胞系的增殖 进一步对 isatin 进行研究评估, 认为 isatin 既可以预防氧自由基诱发肿瘤, 又可以直接诱导肿瘤细胞凋亡 [6] ; 在体外用 isatin 处理中国仓鼠卵巢细胞 (CHO K1) 和人宫颈癌细胞 (HeLa)24h 后, 能够抑制细胞增殖 促进细胞凋亡 [7] ; 课题组前期发表的文章也证实 i satin 对神经母细胞瘤细胞 SH SY5Y 有明显的抑制作用 [8] 迄今为止, 有关 isatin 抗乳腺癌的研究较 [9] 少, 刘娜等的研究认为 isatin 对 DMBA 诱发的大鼠乳腺癌有预防作用 我们前期实验结果显示 :isa tin 能明显诱导乳腺癌细胞 MCF 7 凋亡, 并抑制其增殖 ; 同时使 Bcl 2 蛋白表达下降,Bax 蛋白表达增加 [10] 因此, 本实验的目的是在前期研究的基础上, 进一步证实 isatin 对 MCF 7 细胞的促凋亡作用, 探究其可能的调控机制 1 材料与方法

2 774 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jun;32(6) 1.1 主要试剂 isatin 购自上海元吉化工有限公司, 使用少量 DMSO 将其溶解, 母液浓度配制为 5mmol L -1, 于 4 保存, 备用 实验时用无血清培养基稀释至实验浓度 ( μmol L -1 )(DMSO 浓度控制在 <1%);p53 Bcl 2 Bax 和 β actin 的抗体购自 NewEnglandBiolabs 公司 ;TRIzolRNAisola tionkit 购自 LifeTechnologies 公司 ;ECL 发光试剂购于 AmershamBiosciences 公司 ;Hoechst33258 碘化丙啶 (PI) 染料购自美国 Sigma 公司 1.2 细胞株及其培养乳腺癌细胞系 MCF 7 来自北京协和医学院基础学院细胞中心 细胞用 H DMEM 培养基 (Gibco 公司产品 ), 含 15% 胎牛血清 ( 杭州四季青生物公司 ),5% CO 2 37 饱和湿度条件下培养 1.3 Hoechst33258 荧光染色检测细胞凋亡的形态学改变对数生长期的细胞, 调节细胞密度为每毫升 , 接种于 6 孔板, 并放入包被了多聚赖氨酸的盖玻片 37 5% CO 2 条件下孵育 24h 后更换新培养液, 同时加入不同浓度 isatin, 继续培养 48h 后弃培养液, 用甲醇 冰醋酸 (3 1) 于 4 固定 5 min,pbs 漂洗 2 遍, 终浓度为 5mg L -1 Hoechst 避光染色 10min,PBS 清洗后封片, 在荧光显微镜下观察, 实验重复 3 次 1.4 RT PCR 测定 p53mrna Bcl 2mRNA Bax mrna 的相对表达水平各实验组的细胞收集于 1 5mL 的 Eppendorf 管中,PBS 洗涤 3 次后, 利用 TRIzolRNAisolationkit 提取 RNA, 按试剂盒说明进行 RT PCR p53 的引物序列为 :5 CTGAGGTTG GCTCTGACTGTACCACCATCC 3,5 CTCATTCAGCT CTCGGAACATCTCGAAGCG 3,370 bp; 内参照 GAPDH 的引物序列为 :5 CGTGGAAGGACTCAT GACCA 3,5 TCCAGGGGTCTTACTCCTTG 3,512 bp Bcl 2 的引物序列为 :5 GGAGGATTGTGGCCT TCTTTG 3,5 GGTGCCGGTTCAGGTACTCA 3,120 bp;bax 的引物序列为 :5 TCCACCAAGAAGCT GAGCGAG 3, 5 GTCCAGCCCATGATGGTTCT 3, 257bp; 内参照 GAPDH 的引物序列为 :5 ACCA CAGTCCATGCCATCAC 3, 5 TCCACCACCCTGTT GCTGTA 3,452bp 取 PCR 反应产物 5μL,1 5% 的琼脂糖凝胶电泳分析, 对照标准分子量检测扩增结果 上海培清凝胶紫外摄像分析系统照相后对条带进行光密度 (A) 扫描, 分别检测各组 PCR 产物与其对应的内参 A 值, 实验重复 3 次 1.5 Westernblot 检测 Bcl 2 Bax p53 蛋白表达 4 条件下收集不同处理组细胞,PBS 洗涤 2 次后, 每管加入 150μL 蛋白裂解液, 冰上裂解 30min, r min -1 离心 5min 后, 收集上清液, 考马斯亮蓝法确定蛋白质浓度 蛋白质样品与样品 Bufer 按 4 1 的比例混匀, 煮沸 3min 每孔加样 40μg,12% SDS PAGE 凝胶电泳分离样品 室温恒流 (40mA)1 5h 将蛋白转至 PVDF 膜, 封闭液 (5% 脱脂奶粉, 溶于 TBS) 室温封闭 2h 后, 将膜与含一抗稀释液 (1% 脱脂奶粉, 溶于 TBS 中 ) 的一抗 ( 兔抗人 β actin 抗体 , 兔抗人 p53 抗体 , 兔抗人 Bcl 2 抗体 , 兔抗人 Bax 抗体 ) 封于塑胶袋中,4 过夜, 再室温孵育 2 h,tbs 洗 15min 3 次, 将膜与含有第二抗体的稀释液 (1% 脱脂奶粉, 溶于 TBS 中 ) 室温孵育 3h, TBST 洗 15min 3 次, 将膜包在保鲜膜中, 加入 ECL 发光试剂, 在暗室曝光, 显影, 定影 X 光底片经扫描后, 永久保存并对结果进行光密度分析 实验重复 3 次 1.6 流式细胞仪检测细胞膜电位收集对照组及不同浓度 isatin 处理组细胞,PBS 洗涤 2 次后, 与含 5μmol L -1 Rhodamine123 的 PBS 室温避光孵育 30min,PBS 清洗 2 次, 离心弃 PBS,PBS 重悬, 用流式细胞仪进行检测 (CantoⅡ,BectonDickinson, USA) 实验重复 3 次 1.7 Westernblot 分别检测胞质和线粒体 Cyto chromec 蛋白表达收集对照组及不同浓度 isatin 处理组细胞, 冰冷的 PBS 洗两次, 将细胞重悬于 BuferA(250mmol L -1 sucrose,1mmol L -1 ED TA,50mmol L -1 Tris HCl,1mmol L -1 DTT,1 mmol L -1 PMSF,1mmol L -1 Benzamidine,280u L -1 apotinin,50mg L -1 leupeptin,and7mg L -1 pepstaina,ph7 4) 中, 转移至 1mL 玻璃匀浆器, 放至冰浴中, 上下抽拉 30 次后离心 (1000g 10min,4 ), 弃沉淀, 将上清移至一新 EP 管中, 再离心 (10000g 20min,4 ), 所得上清和沉淀分别为胞质 线粒体粗品 为排除溶酶体和过氧化物体污染, 需做进一步处理, 将胞质部分转移至超离管中, 离心 ( g,1h,4 ), 所得上清为纯化的胞质蛋白 ; 将线粒体沉淀部分重悬于 BuferB (250mmol L -1 sucrose,1mmol L -1 EGTA,10 mmol L -1 Tris HCl,1mmol L -1 DTT,1mmol L -1 PMSF,1mmol L -1 Benzamidine,280u L -1 apotinin,50mg L -1 leupeptin,and7mg L -1 pep staina,ph 7 4) 中, 离心 (10000 g,10min,

3 中国药理学通报 C P m B 2 6J 2 6 4 重复 次 所得线粒体沉淀于细胞裂解液中 裂解 mm L T HC H 5 5mm L N C 5mm L EDTA T X 去氧胆酸钠 SDS mm L PMS F 2 8 5 5 mrna 蛋白表达量相应增加 差异具有显 增加 著性 P 5 对照组细胞表达一定量的 B 2mR 蛋白 不同浓度 处理组细胞 B 2mRNA NA 5 而 B 蛋白表达量均出现不同程度下降 P L A 5m L m L P 蛋白在各组之间的差异没有明显改变 B 2 mrna A 分装以上蛋白溶液备用 W 步 B 逐渐下降 P 5 见 F 2 骤同 5 中所述 8 流式细胞仪检测 9的活化 收集对照 组及不同浓度 处理组细胞 PBS清洗 2次后 与 FI TC LEHD FMK 9 B 室温避光孵育 m PBS 清洗 2次 离心弃 PBS 再用 PBS重悬 流式细胞仪 进行检测 C D k USA 实验 Ⅱ B 重复 次 9 统计学处理 珋±表 示 利 用 计量资料以 SPS S5统计软件进行单因素方差分析 2 结果 处理后细胞形态学变化 如 F 所示 MCF 细胞与不同浓度 共同孵育 48后 在 荧光显微镜下观察到细胞胞体缩小 胞质发生浓缩 核染色质聚集 并有凋亡小体等典型的凋亡形态学 改变 而对照组细胞核呈现均匀的蓝色荧光 F 2 RT PCR 5 A5 AGAPDH B 2 AB 2 AGAPDH B AB AGAPDH mrna MCF 4 8 w T RNAw m T RNA k RT PCR T m q 珋± w m GAPDH D w m P 5 C T G F A 48 m w MCF M MCF m m L C 2 4 MCF w 5 2 μm L H 25 8 4 DNA m m w B 5μm L C μm 细胞膜电位的变化 细胞膜电位下降是细胞 L D 2 μm L w A 凋亡的早 期 形 态 学 特 征 利 用 特 征 性 探 针 R C m 2 与各组细胞孵育 细胞结合荧光染料的强 度与线粒体膜的极化状态直接相关 流式细胞仪检 2 5 B 2 B mrna及蛋白的相对表达水平 与对照组细胞相比 经5 2 μm L 处理的各组 MCF 细胞 随着 浓度的不断 2 μm L 测的结果是不同浓度 5 处 理 组 细 胞 线 粒 体 膜 电 位 分 别 为 ± 22 4±2 2 6 6±44 明

4 6 中国药理学通报 C P m B 2 6J 2 6 显低于对照组细胞的电位 8 8 4±6 5 P 5 见 F 4 F 4 I D m MCF m C w 4 8w w m 2 F E 5 B 2 B MCF 48 m w W m m w m m T mw w SDS PAGE W w m w mc T m q w m β 珋± D w m P 5 C T mm m L C 2 4 MCF w 5 2 μm L 4 C mc的释放情况 C mc的 释放是凋亡级联反应中关键的一步 因为它可以激 活下游的 如 F 5结果所示与对照组细胞 相比 经不同浓度 5 2 μm L 处 理的 MCF 细胞胞质 C mc含量明显增加 mc 表 达 明 显 下 降 P 相反 线 粒 体 C 5 5 9的活化 众所周知像 C mc 这类的促凋亡蛋白释放后 会激活 级联反 应 本实验用流式细胞仪检测与不同浓度 5 F 5 E mc MCF 4 8 m w w 2μm L 孵育 4 8后的 MCF 细胞中 T mw w S DS PAGE 9的活化情况 如 F 6所示 相比较对照组 W w m w 细胞的 ±2 8 处理的各组细胞活 mc T m q w m β 化 9蛋白水平均有不同程度的增加 2 ± 56 8 ±4 ±26 差异具有显著性 P 5 珋± D w m P T mm 5 m L C 2 4 MCF w 5 2 μm L

5 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jun;32(6) 777 Fig6 Efectofisatinoncaspase 9 activityinmcf 7Cels(representativeexperiment) Celstreatedwithisatinfor48hwereincubatedwithFITC LEHD FMKfor30minandthenmeasuredbyflowcytometry(representativeex periment). 3 讨论乳腺癌是目前女性发病率最高的恶性肿瘤, 是导致女性死亡的主要原因之一 [11] 到目前为止, 尽管系统的化疗方案已常规用于临床治疗, 但化疗耐药及化疗所带来的副作用仍是困扰乳腺癌治疗的严峻问题 [12] 而天然化合物毒副作用小, 具有靶向杀伤肿瘤细胞的特点, 是目前抗肿瘤研究的热点 isa tin 作为一种天然活性物质, 已经被证实具有明显的抗肿瘤作用 课题组前期的研究认为 isatin 能明显诱导乳腺癌细胞 MCF 7 凋亡, 同时明显降低 Bcl 2/ Bax 比值 [10], 但对具体的调控机制未做进一步研究 isatin 是如何调控 Bcl 2/Bax 的,Bcl 2/Bax 又是通过什么样的途径诱发凋亡的? 肿瘤的生成是细胞增殖和凋亡调控失衡的结果, 通过诱导肿瘤细胞凋亡来杀死肿瘤细胞已成为一种有效的肿瘤治疗途径 因此抑制肿瘤细胞生长, 可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来完成 本研究通过细胞荧光染色进一步证实不同浓度的 isatin 能明显诱导 MCF 7 细胞凋亡, 荧光显微镜下观察到 isatin 处理组细胞发生典型的凋亡形态学改变 : 胞体缩小 胞质浓缩 核染色质聚集, 并有 DNA 碎片 而对照组细胞无变化 作为肿瘤抑制基因,p53 主要通过激活其下游靶基因进一步控制细胞的生长与死亡 [13], 其次是在细胞周期的 G 期监视 DNA 的完整性 在依赖 p53 蛋白的凋亡中,p53 蛋白能特异地抑制 Bcl 2 蛋白的表达, 但对 Bax 蛋白的表达有明显促进作用, 在这类细胞中 p53 蛋白的积累和活化引起了线粒体膜的去极化, 进而引发细胞凋亡 有研究表明, 人乳腺癌细胞 MCF 7 表达 wild p53 蛋白, 且通过一些抗肿瘤药物的诱导, 能明显增强其表达量, 进而诱导细胞凋亡 [14,15] 课题组前期的研究认为,Bcl 2 家族蛋白中 Bcl 2 Bax 蛋白在 isatin 的抗肿瘤作用中不可或缺 isatin 作用后可以导致 Bcl 2 蛋白表达降低,Bax 蛋白表达增加 因此推测 p53 可能是 isatin 作用 Bcl 2 的上游靶分子之一 实验结果表明 isatin 作用后,p53mRNA 及蛋白表达均明显增加 众所周知,Bcl 2 家族蛋白存在于线粒体膜上, 与细胞凋亡密切相关 该家族蛋白的表达情况可能会影响到细胞膜电位的变化 本研究利用流式细胞仪检测不同浓度 isatin 处理组细胞膜电位, 结果显示除对照组细胞外, 其他各组细胞膜电位均出现不同程度下降 线粒体膜电位改变是细胞凋亡发生的早期特征, 在膜电位发生改变后通常会释放一些促凋亡蛋白, 像 CytochromeC,smac 等 Westernblot 的结果显示 isatin 作用后线粒体 CytochromeC 表达下降, 而胞质中浓度增加 CytochromeC 等促凋亡蛋白会进一步作用, 激活下游的 caspase 家族, 引发凋亡 依照上述的结果, 我们推测 caspase 家族中的 caspase 9 会被顺序激活, 因此我们利用流式细胞仪检测了不同组别细胞 caspase 9 的活化情况, 结果与预想的一致, 经 isatin 作用后, 活化的 caspase 9 表达增加 综上所述, 有充分的理由认为 isatin 诱导乳腺癌 MCF 7 细胞凋亡可能是通过 p53 介导的线粒体凋亡途径 ( 致谢 : 本实验是在青岛市妇女儿童医院检验科及青岛大学生物化学与分子生物学教研室完成 感谢马中良 迟晓伟及陈艳萍在实验过程中的协助 ) 参考文献 : [1] RayD,PaulBK,GuchhaitN.Diferentialbindingmodesofanti cancer,anti HIV drugsbelongingtoisatinfamilywithamodel transportprotein:ajointrefinementfromspectroscopicandmolec ularmodelingapproaches[j].jphotochem PhotobiolB,2013, 127: [2] PakravanP,KashanianS,KhodaeiMM,HardingFJ.Biochemi calandpharmacologicalcharacterizationofisatinanditsderiva

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