362 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3) 1.2 试 剂 马 兜 铃 酸 A(MW:341 27, 纯 度 99 0%) 与 大 黄 酸 (MW:284 22, 纯 度 99 0%), 均 购 自 于 中 国 食 品

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1 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3):361~5 361 网 络 出 版 时 间 : :20 网 络 出 版 地 址 :htp:// 大 黄 酸 对 马 兜 铃 酸 A 引 起 的 斑 马 鱼 肾 脏 损 伤 的 保 护 作 用 王 雪, 刘 可 春, 王 希 敏, 韩 利 文, 张 姗 姗, 何 秋 霞, 陈 锡 强, 韩 建, 王 荣 春 ( 山 东 省 科 学 院 生 物 研 究 所, 山 东 省 科 学 院 斑 马 鱼 药 物 筛 选 平 台, 山 东 省 生 物 传 感 器 重 点 实 验 室, 山 东 济 南 ) doi: /j.isn 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2016) 中 国 图 书 分 类 号 :R 332;R284.1;R322.61;R 摘 要 : 目 的 观 察 大 黄 酸 在 马 兜 铃 酸 A 引 起 的 斑 马 鱼 肾 脏 损 伤 中 的 作 用 方 法 将 肾 脏 发 育 完 成 的 斑 马 鱼 仔 鱼 (4dpf) 用 马 兜 铃 酸 A 处 理 24h, 造 成 马 兜 铃 酸 肾 病 模 型, 同 时 加 入 大 黄 酸 处 理, 然 后 观 察 仔 鱼 的 表 型 变 化 情 况, 并 用 肌 酐 检 测 试 剂 盒 测 定 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 含 量, 利 用 qpcr 对 仔 鱼 组 织 中 的 炎 性 相 关 因 子 (cox2a) 和 致 纤 维 化 因 子 (TGFβ 1) 进 行 定 量 检 测 结 果 马 兜 铃 酸 A 处 理 24h 后, 部 分 仔 鱼 出 现 眼 周 水 肿 及 血 循 环 系 统 异 常, 表 现 为 心 跳 微 弱, 心 腔 缩 小, 血 流 缓 慢 甚 至 停 滞, 发 生 率 具 有 剂 量 相 关 性, 马 兜 铃 酸 处 理 组 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 含 量 比 对 照 组 明 显 升 高,cox2a 和 TGFβ 1 表 达 量 也 比 对 照 组 明 显 上 升, 同 时 加 入 大 黄 酸 能 降 低 异 常 仔 鱼 所 占 比 例, 降 低 组 织 肌 酐 含 量, 并 下 调 cox2a 的 表 达, 但 对 马 兜 铃 酸 引 起 的 TGFβ 1 的 上 升 无 影 响 结 论 大 黄 酸 对 马 兜 铃 酸 引 起 的 斑 马 鱼 肾 脏 损 伤 有 一 定 的 保 护 作 用 关 键 词 : 马 兜 铃 酸 ; 斑 马 鱼 ; 仔 鱼 ; 肾 脏 ; 大 黄 酸 ; 肌 酐 大 黄 酸 (rhein,rhe) 属 单 蒽 核 类 1,8 二 羟 基 蒽 醌 衍 生 物, 是 大 黄 何 首 乌 虎 杖 等 多 种 中 药 的 主 要 有 效 成 分 之 一, 药 理 作 用 广 泛 在 糖 尿 病 肾 病 大 鼠, 大 黄 酸 能 下 调 血 清 中 IL 1β IL 12 和 TNF α 等 细 胞 因 子 的 浓 度, 减 轻 炎 症 反 应, 减 少 糖 尿 病 肾 病 大 鼠 尿 蛋 白 泄 漏, 改 善 血 脂 异 常, 在 糖 尿 病 肾 病 各 期 发 挥 多 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No , ); 山 东 省 自 主 创 新 重 大 专 项 (No2014ZZCX0215) 作 者 简 介 : 王 雪 (1978-), 女, 硕 士, 高 级 工 程 师, 研 究 方 向 : 药 物 毒 性 评 价 及 活 性 筛 选,E mail:wangxue8809@163.com; 刘 可 春 (1964-), 男, 博 士, 研 究 员, 通 讯 作 者,Tel: ,E mail:hliukch@sdas.org 靶 点 多 层 次 的 治 疗 作 用 [1] 大 黄 酸 对 肾 脏 纤 维 化 形 成 的 多 个 环 节 有 治 疗 作 用 病 理 状 态 下, 以 转 化 生 长 因 子 TGF β1 为 主 导 的 细 胞 因 子 网 络 激 活 成 纤 维 细 胞 为 肌 成 纤 维 细 胞, 并 能 将 许 多 肾 脏 固 有 细 胞 如 肾 小 管 上 皮 细 胞 内 皮 细 胞 等 转 化 为 肌 成 纤 维 细 胞, 导 致 肾 脏 纤 维 化 发 生 大 黄 酸 能 抑 制 促 纤 维 化 因 子 TGF β1 的 表 达, 阻 止 间 质 成 纤 维 细 胞 的 激 活, 阻 断 肾 间 质 的 纤 维 化 进 程, 在 多 种 肾 脏 疾 病 中 发 挥 肾 保 护 作 用 [2] 在 亚 慢 性 镉 染 毒 小 鼠, 大 黄 酸 对 肝 脏 及 肾 损 伤 表 现 出 一 定 的 保 护 作 用 [3] 马 兜 铃 酸 (aristolochicacid,aa) 对 多 种 动 物 种 属 具 有 肾 毒 性, 主 要 损 伤 肾 小 管 上 皮 细 胞, 导 致 肾 间 质 纤 维 化 及 肾 萎 缩, 并 出 现 低 分 子 蛋 白 尿 严 重 贫 血 症 状, 被 称 为 马 兜 铃 酸 肾 病 实 验 中 用 马 兜 铃 酸 处 理 发 育 早 期 的 斑 马 鱼, 会 引 起 仔 鱼 水 肿 和 肾 脏 形 态 功 能 异 常, 引 起 不 可 逆 性 肾 脏 损 伤 并 终 至 仔 鱼 死 亡 [4] 目 前, 临 床 上 对 马 兜 铃 酸 肾 病 仅 以 预 防 为 主, 尚 未 找 到 有 效 的 治 疗 药 物 和 方 法 本 研 究 在 利 用 马 兜 铃 酸 A 进 行 染 毒 处 理 造 成 斑 马 鱼 肾 脏 损 伤 的 基 础 上, 加 用 大 黄 酸 进 行 干 预, 通 过 检 测 肾 脏 功 能 相 关 指 标 的 变 化, 研 究 大 黄 酸 在 马 兜 铃 酸 肾 病 中 的 作 用, 并 为 利 用 斑 马 鱼 模 型 筛 选 具 有 潜 在 治 疗 肾 脏 损 伤 活 性 的 化 合 物 提 供 方 法 和 思 路 1 材 料 1.1 实 验 动 物 实 验 所 用 为 AB 系 野 生 型 斑 马 鱼, 在 水 温 28 5, 保 持 14h 光 照 /10h 黑 暗 光 照 周 期 条 件 下 养 殖, 每 日 于 9:00am 和 3:00pm 喂 食 两 次 颗 粒 饲 料 排 卵 前 日 将 斑 马 鱼 成 鱼 按 2 1 放 入 具 筛 板 的 产 卵 缸 内, 中 间 放 置 隔 板, 次 日 亮 灯 前 抽 去 隔 板, 在 光 照 刺 激 下 排 卵 后, 收 集 鱼 卵, 用 培 养 水 冲 洗 3 遍, 然 后 放 入 新 培 养 水 中, 在 28 5, 相 同 光 照 条 件 下 发 育 至 4d 大 小

2 362 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3) 1.2 试 剂 马 兜 铃 酸 A(MW:341 27, 纯 度 99 0%) 与 大 黄 酸 (MW:284 22, 纯 度 99 0%), 均 购 自 于 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院, 分 别 用 二 甲 基 亚 砜 (dimethylsulfoxide,dmso) 溶 解 配 制 成 储 液 TR Izol 试 剂 ( 美 国 Invitrogen 公 司 ),PrimeScript TM 1st StrandcDNA 合 成 试 剂 盒 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ),itaquniversalsybrgreensupermix( 美 国 Bio Rad 公 司 ),CreatinineAsaykitab65340 与 10ku SpinColumnab93349(Abcam), 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 胚 胎 培 养 水 成 分 为 :NaCl5mmol L -1,KCl 0 17mmol L -1,CaCl 2 0 4mmol L -1,MgSO mmol L -1, 用 去 离 子 水 配 制 荧 光 定 量 PCR 仪 CFX96( 美 国 Bio Rad); 倒 置 显 微 镜 IX51( 日 本 Olympus),SpectraMR 型 酶 标 仪 ( 美 国 Dynex),MICCRAD 1 匀 浆 器 ( 德 国 ART) 2 方 法 2.1 斑 马 鱼 分 组 与 给 药 选 用 6 孔 细 胞 培 养 板 进 行 实 验 吸 取 适 量 马 兜 铃 酸 A 储 液 至 孔 内, 加 入 培 养 水 进 行 稀 释, 分 别 得 到 20μmol L -1 和 40μmol L -1 马 兜 铃 酸 A 溶 液 作 损 伤 组 ; 向 孔 内 同 时 加 入 马 兜 铃 酸 A 与 大 黄 酸 储 液, 用 培 养 水 稀 释 得 到 含 上 述 浓 度 马 兜 铃 酸 A 与 40μmol L -1 大 黄 酸 的 混 合 液 作 为 治 疗 组 ; 马 兜 铃 酸 A 与 大 黄 酸 浓 度 由 预 实 验 结 果 确 定 向 孔 内 加 入 含 DMSO 的 培 养 水 (DMSO 含 量 0 5% V/V) 作 为 溶 剂 对 照 组, 小 心 混 匀 各 孔 溶 液 随 机 选 取 发 育 4dpf 的 斑 马 鱼 仔 鱼, 移 入 上 面 各 孔 溶 液 内, 每 孔 中 放 置 30 尾 仔 鱼, 每 孔 同 时 做 3 个 平 行 重 复, 然 后 放 于 恒 温 控 光 培 养 箱 内, 孵 育 24h 处 理 结 束 后, 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 各 组 仔 鱼 形 态, 记 录 仔 鱼 异 常 情 况 并 计 数, 拍 照 2.2 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 肌 酐 含 量 检 测 肌 酐 是 肌 肉 的 代 谢 产 物, 由 前 体 化 合 物 磷 酸 肌 酸 转 化 而 成, 正 常 情 况 下, 每 日 产 生 的 肌 酐 主 要 由 肾 小 球 滤 过 排 出 体 外 肌 酐 的 含 量 变 化 主 要 由 肾 脏 滤 过 能 力 决 定, 肾 功 能 受 损 时, 肌 酐 在 体 内 蓄 积, 含 量 升 高 实 验 中 收 集 各 处 理 组 与 对 照 组 中 存 活 仔 鱼, 用 纯 净 水 充 分 冲 洗 后, 移 入 2mL 离 心 管, 尽 量 吸 净 水 分, 然 后 向 每 管 加 入 500μL 去 离 子 水, 冰 浴 匀 浆 将 匀 浆 样 品 加 入 10kuSpinColumn 中,4,10000 g, 离 心 10min, 除 去 样 品 中 的 蛋 白 成 分, 收 集 滤 液 然 后 按 CreatinineAsaykit 操 作 步 骤, 吸 取 滤 液 与 肌 酐 反 应 液 混 合,37, 反 应 1h, 于 570nm 处 读 取 OD 值 根 据 肌 酐 标 准 曲 线 回 归 方 程, 计 算 各 样 品 中 的 肌 酐 含 量, 进 一 步 计 算 得 到 各 组 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 含 量 2.3 qpcr 检 测 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 TGFβ 1 cox2a 基 因 的 表 达 量 马 兜 铃 酸 导 致 肾 脏 损 害 的 重 要 特 征 是 肾 间 质 纤 维 化, 同 时 伴 有 炎 症 反 应 发 生 在 利 用 斑 马 鱼 为 模 型 进 行 马 兜 铃 酸 肾 病 研 究 中, 已 检 测 到 促 炎 性 因 子 cox2a 与 致 纤 维 化 因 子 TGFβ 1 表 达 量 上 升, 说 明 TGFβ 1 与 cox2a 这 两 种 因 子 的 表 达 水 平 与 马 兜 铃 酸 肾 病 发 病 机 制 及 病 程 进 展 密 切 相 关 实 验 中 收 集 对 照 组 和 处 理 组 的 存 活 斑 马 鱼 仔 鱼, 用 灭 菌 水 冲 洗 后, 分 别 加 入 TRIzol 试 剂 提 取 仔 鱼 组 织 的 总 RNA, 逆 转 录 成 cdna, 取 1μLcDNA 产 物 进 行 qpcr, 检 测 各 组 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 TGFβ 1 cox2a 基 因 的 表 达 情 况, 以 β actin 作 为 内 参 基 因 qpcr 反 应 体 系 为 20μL, 反 应 条 件 为 :95 30s, 95 5s,60 40s,40 个 循 环 采 用 2 - Cq 法 分 析 基 因 的 相 对 表 达 量 : Cq( 处 理 组 )=Cq( 处 理 组 目 的 基 因 )-Cq( 对 照 组 内 参 基 因 ), Cq( 对 照 组 )= Cq( 对 照 组 目 的 基 因 )-Cq( 对 照 组 内 参 基 因 ), Cq= Cq( 处 理 组 )- Cq( 对 照 组 ), 以 2 - Cq 表 示 处 理 组 目 的 基 因 的 表 达 倍 数 β actin:forward5 AGAGCTATGAGCTGCCT GACG3 ;reverse5 CCGCAAGATTCCATACCCA3 ; cox2a:forward5 ATCCTGTTGTCAAGGTCCCA3 ;re verse5 CAAGGGTGCGGGTGTAAT3 ;TGFβ 1:for ward 5 GAACTCGCTTTGTCTCCA 3 ;reverse 5 TACAGTCGCAGTATAACCTCA3 2.4 统 计 学 分 析 采 用 SPSS13 0 对 实 验 数 据 进 行 分 析, 各 组 均 值 用 x±s 珋 表 示, 采 用 独 立 样 本 t 检 验 法 比 较 组 间 差 异 的 显 著 性 3 结 果 3.1 不 同 处 理 组 斑 马 鱼 仔 鱼 的 表 型 与 存 活 情 况 发 育 4dpf 的 斑 马 鱼 仔 鱼 经 马 兜 铃 酸 A 处 理 24h 后, 部 分 仔 鱼 出 现 明 显 的 眼 周 水 肿 表 现, 发 生 率 与 马 兜 铃 酸 A 浓 度 呈 相 关 性 当 马 兜 铃 酸 A 浓 度 升 高 至 40μmol L -1 时, 除 眼 周 水 肿 外, 斑 马 鱼 仔 鱼 的 血 循 环 系 统 也 出 现 中 毒 症 状, 表 现 为 心 跳 微 弱 心 腔 缩 小, 血 流 缓 慢 甚 至 停 滞 (Fig1), 仔 鱼 的 活 动 能 力 明 显 降 低 用 40μmol L -1 大 黄 酸 与 马 兜 铃 酸 A 同 时 对 斑 马 鱼 仔 鱼 进 行 处 理,24h 后, 出 现 上 述 异 常 的 仔 鱼 比 例 较 损 伤 组 均 有 显 著 降 低 处 理 时 间 为 24h 时, 各 处 理 组 仔 鱼 的 死 亡 率 与 对 照 组 比 较 差 异 无 显 著 性 (Tab1) 3.2 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 肌 酐 含 量 在 发 育 5dpf 时, 正 常 对 照 组 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 含 量 值 为

3 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3) 363 Tab1 Defectivephenotypesandmortalityofzebrafishlarvaeafterexposuretoaristolochicacidandrhein Group Mortality/% Periocularedema/% Defectivebloodcirculation/% Control 13.5± μmol L -1 AA 10.8± ± μmol L -1 AA +40μmol L -1 Rhe 12.7± ±3.0 # 0 40μmol L -1 AA 15.2± ± ±8.1 40μmol L -1 AA+40μmol L -1 Rhe 14.5± ±4.1 # 31.4±5.6 # P<0 05vsthecontrolgroup; # P<0 05vsonlyaristolochicacidtreatedgroup. Fig1 Phenotypesofzebrafishlarvaeafteraristolochicacidtreatment (A-C):Thelateralviewsofzebrafishlarvaeafterexposuretovariousconcentrationofaristolochicacid.(D-I):Theenlargefiguresofthelocalre gionsfrom(a-c)takenfromlateralview(d-f)anddorsalview(g-i),respectively.arow:periocularedema;arowhead:cardiac Fig2 Creatininevalueinzebrafish larvaeofdiferenttreatmentgroups P<0 05vsthefirstgroup. 每 50 尾 (153 51±7 1)nmoL 4dpf 的 斑 马 鱼 仔 鱼 经 马 兜 铃 酸 A(20μmol L -1 ) 和 大 黄 酸 (40μmol L -1 ) 处 理 24h 后, 损 伤 组 与 治 疗 组 仔 鱼 组 织 中 肌 酐 含 量 值 与 对 照 组 相 比 无 明 显 变 化 在 40μmol L -1 马 兜 铃 酸 A 处 理 组, 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 肌 酐 含 量 值 升 高 至 每 50 尾 (183 30±8 2)nmoL, 高 于 对 照 组, 差 异 有 显 著 性 大 黄 酸 治 疗 组 仔 鱼 组 织 肌 酐 值 为 每 50 尾 (159 23±5 6)nmoL, 比 损 伤 组 有 明 显 降 低 3.3 斑 马 鱼 仔 鱼 TGFβ 1 cox2a 基 因 的 表 达 经 20μmol L -1 马 兜 铃 酸 A 处 理 24h 后, 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 cox2a 表 达 水 平 为 对 照 组 的 (4 43±0 475) 倍, 差 异 有 显 著 性, 同 时 加 入 大 黄 酸 能 明 显 降 低 cox2a 表 达 水 平, 但 与 对 照 组 相 比, 仍 有 明 显 升 高 在 马 兜 铃 酸 A 浓 度 为 20μmol L -1 时, 损 伤 组 与 大 黄 酸 治 疗 组 TGFβ 1 的 表 达 量 与 对 照 组 均 无 明 显 差 异 马 兜 铃 酸 A 浓 度 为 40μmol L -1 时, 处 理 24h 后, 仔 鱼 组 织 中 cox2a TGFβ 1 的 表 达 量 比 对 照 组 均 有 明 显 升 高, 分 别 为 对 照 组 的 (9 55±0 407) 和 (1 59±0 074) 倍, 大 黄 酸 治 疗 组 cox2a 的 表 达 仍 保 持 在 较 高 水 平, 与 损 伤 组 差 异 无 显 著 性 见 Fig3 4 讨 论 目 前 已 知, 服 用 含 马 兜 铃 酸 成 分 的 中 药 材 会 严 重 损 害 肾 脏 功 能, 并 导 致 肾 脏 癌 变 发 生 马 兜 铃 酸 引 起 肾 脏 损 伤 的 机 制 随 剂 量 不 同 而 有 差 别, 在 大 剂 量 下, 马 兜 铃 酸 直 接 引 起 肾 小 管 上 皮 细 胞 急 性 坏 死, 进 而 发 生 肾 间 质 纤 维 化 ; 长 期 小 剂 量 摄 入 时, 马 兜 铃

4 364 中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3) Fig3 ExpresionlevelsofTGFβ 1andcox2agenes inzebrafishlarvaeofdiferenttreatmentgroups P<0 05vsthefirstgroup. 酸 与 细 胞 DNA 形 成 AA DNA 加 合 物, 引 起 DNA 断 裂, 导 致 肾 小 管 损 伤 和 肾 间 质 纤 维 化 实 验 中 发 现, 用 马 兜 铃 酸 处 理 发 育 早 期 的 斑 马 鱼 胚 胎, 会 引 起 胚 胎 肾 脏 形 态 发 育 异 常 和 肾 脏 功 能 受 损 [4] 斑 马 鱼 发 育 周 期 短, 受 精 72hpf 时, 肾 脏 发 育 已 经 完 成, 具 备 成 熟 的 滤 过 排 泄 功 能 在 胚 胎 期, 斑 马 鱼 肾 脏 在 进 化 阶 段 上 属 于 前 肾, 前 肾 结 构 相 对 简 单, 仅 由 一 对 肾 单 位 组 成, 但 在 分 子 水 平 和 生 物 功 能 上 与 哺 乳 动 物 类 相 似, 是 进 行 化 合 物 肾 脏 毒 性 研 究 的 理 想 模 型 本 实 验 中, 发 育 4dpf 的 斑 马 鱼 仔 鱼 经 马 兜 铃 酸 A 处 理 24h 后, 仔 鱼 出 现 明 显 的 眼 周 水 肿 水 肿 是 肾 脏 疾 病 患 者 的 常 见 症 状, 是 由 于 肾 功 能 受 损 致 使 水 分 无 法 排 出, 潴 留 在 组 织 间 隙 引 起 已 有 实 验 发 现, 在 肾 脏 功 能 发 生 损 伤 时, 斑 马 鱼 也 会 出 现 局 部 或 [5] 全 身 水 肿 表 现 在 Zhou 等 实 验 中, 用 甲 硝 唑 处 理 Tg(pod::NTR mchery) 斑 马 鱼, 诱 导 肾 脏 足 细 胞 发 生 凋 亡, 导 致 肾 脏 功 能 受 损 后, 胚 胎 出 现 明 显 的 眼 周 水 肿 表 现 但 另 一 方 面, 在 基 于 斑 马 鱼 模 型 进 行 的 化 合 物 毒 性 实 验 中, 水 肿 是 一 种 较 为 常 见 的 表 型 改 变, 可 继 发 于 多 种 器 官 毒 性 损 伤, 而 非 肾 脏 损 伤 特 异 为 进 一 步 确 认 肾 脏 损 伤 情 况, 实 验 中 选 取 了 与 肾 脏 功 能 相 关 的 特 异 指 标 进 行 检 测 肌 酐 是 肌 肉 组 织 的 代 谢 产 物, 每 日 产 生 的 肌 酐 均 由 肾 脏 排 出 体 外, 肾 脏 功 能 受 损 时, 肌 酐 在 体 内 蓄 积 在 临 床 上, 检 测 血 肌 酐 值 是 诊 断 肾 脏 疾 病 的 常 用 手 段 由 于 斑 马 鱼 仔 鱼 体 积 小, 不 易 获 取 血 液 样 本, 本 实 验 中 对 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 进 行 提 取 检 测 结 果 发 现, 在 40μmol L -1 马 兜 铃 酸 A 处 理 组, 斑 马 鱼 仔 鱼 组 织 中 肌 酐 含 量 值 较 正 常 组 有 明 显 提 高, 说 明 仔 鱼 的 肾 脏 功 能 受 到 损 害, 肌 酐 排 泄 受 阻, 致 使 肌 酐 在 体 内 出 现 蓄 积 作 为 多 种 中 药 材 的 有 效 成 分 之 一, 大 黄 酸 具 有 抗 炎 降 低 纤 维 化 等 药 理 活 性, 能 降 低 糖 尿 病 肾 病 鼠 的 尿 蛋 白 水 平, 减 轻 肾 脏 肥 大 为 观 察 大 黄 酸 对 斑 马 鱼 马 兜 铃 酸 肾 病 中 的 保 护 作 用, 在 本 实 验 中, 在 用 马 兜 铃 酸 A 处 理 造 成 肾 脏 损 伤 的 同 时 加 入 大 黄 酸 作 为 治 疗 组, 结 果 发 现, 治 疗 组 仔 鱼 眼 周 水 肿 和 血 循 环 系 统 异 常 的 发 生 率 较 相 应 损 伤 组 均 有 明 显 降 低, 同 时, 大 黄 酸 能 降 低 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 仔 鱼 组 织 的 肌 酐 值, 说 明 大 黄 酸 在 马 兜 铃 酸 所 致 的 肾 脏 损 伤 中 具 有 肾 脏 保 护 作 用 马 兜 铃 酸 导 致 肾 脏 损 害 的 一 个 重 要 特 征 是 肾 间 质 发 生 纤 维 化, 同 时 伴 有 炎 症 反 应 的 发 生, 因 此, 本 实 验 中 对 各 组 仔 鱼 组 织 的 炎 性 相 关 因 子 cox2a 和 致 纤 维 化 因 子 TGF β1 的 基 因 表 达 量 进 行 了 检 测 发 现 马 兜 铃 酸 A 处 理 组 cox2a 和 TGF β1 基 因 的 表 达 水 平 较 对 照 组 有 明 显 升 高, 并 具 有 剂 量 相 关 性 在 马 兜 铃 酸 A 低 浓 度 (20μmol L -1 ) 处 理 组, 合 并 加 入 大 黄 酸 后 能 明 显 降 低 cox2a 的 表 达 水 平, 但 在 马 兜 铃 酸 A 高 浓 度 (40μmol L -1 ) 组, 大 黄 酸 对 cox2a 表 达 量 的 影 响 并 不 明 显, 损 伤 组 与 治 疗 组 cox2a 的 表 达 水 平 均 明 显 高 于 对 照 组 以 往 在 糖 尿 病 肾 病 大 鼠 模 型 中 观 察 到 大 黄 酸 能 够 下 调 TGF β1 表 达 水 平, 抑 制 肾 小 管 上 皮 细 胞 的 转 分 化, 阻 止 纤 维 化 发 生 但 本 实 验 结 果 显 示, 在 马 兜 铃 酸 引 起 的 肾 脏 损 伤 中 大 黄 酸 对 TGF β1 的 表 达 [6] 水 平 几 乎 没 有 影 响 苏 健 等 用 慢 性 移 植 肾 肾 病 (CAN) 大 鼠 模 型 研 究 大 黄 酸 对 抗 纤 维 化 因 子 的 影 响, 发 现 随 着 CAN 病 程 的 进 展, 肾 组 织 TGF β1 的 表 达 明 显 增 加, 加 入 大 黄 酸 未 影 响 CAN 进 展 过 程 中 TGF β1 的 表 达 由 此 可 见, 在 不 同 类 型 的 肾 脏 疾 病 中, 大 黄 酸 对 TGF β1 产 生 不 同 作 用, 这 也 提 示 我 们, 大 黄 酸 对 TGF β1 的 下 调 及 阻 抑 并 不 是 其 发 挥

5 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Mar;32(3) 365 抗 纤 维 化 活 性 的 唯 一 机 制 综 上 所 述, 在 斑 马 鱼 马 兜 铃 酸 肾 病 模 型 中, 加 入 大 黄 酸 进 行 处 理, 能 减 少 异 常 发 生 率, 降 低 仔 鱼 组 织 中 的 肌 酐 含 量, 显 示 出 一 定 的 肾 脏 保 护 作 用 大 黄 酸 安 全 性 高 药 理 活 性 广 泛, 尤 其 在 糖 尿 病 肾 病 治 疗 中 的 独 特 疗 效 已 得 到 实 验 验 证, 目 前 国 内 已 将 单 体 大 黄 酸 列 为 一 类 新 药 进 行 重 点 研 究, 相 信 经 过 体 内 活 性 实 验 及 临 床 疗 效 确 证, 大 黄 酸 将 能 在 肾 脏 功 能 保 护 及 肾 脏 损 伤 治 疗 方 面 得 到 更 为 广 泛 的 应 用 本 实 验 利 用 斑 马 鱼 肾 脏 损 伤 模 型 评 价 化 合 物 的 活 性, 充 分 利 用 了 斑 马 鱼 产 卵 量 大 发 育 周 期 短 的 优 势, 可 以 快 速 筛 选 获 得 具 有 肾 脏 保 护 作 用 的 活 性 成 分, 极 大 提 高 了 新 药 发 现 和 研 发 效 率 ( 致 谢 : 本 实 验 全 部 于 山 东 省 科 学 院 生 物 研 究 所 药 物 筛 选 研 究 室 完 成, 在 此 表 示 衷 心 感 谢!) 参 考 文 献 : [1] 李 晓 红, 李 蒙, 陶 艳 蓉. 大 黄 酸 及 其 衍 生 物 药 理 作 用 研 究 新 进 展 [J]. 现 代 药 物 与 临 床,2010,25(6): [1] LiXH,LiM,TaoYR.Developmentofpharmacologicalefects ofrheinanditsderivatives[j].drugsclin,2010,25(6): [2] 许 科, 张 犁. 大 黄 酸 抗 肾 脏 纤 维 化 研 究 进 展 [J]. 新 中 医, 2012,44(5): [2] XuK,ZhangL.Progresioninstudyontheanti renalfibrosis efectofrhein[j].jnewchinmed,2012,44(5): [3] 付 静 波, 付 丽 红, 潘 飞, 等. 大 黄 酸 对 亚 慢 性 镉 染 毒 小 鼠 肝 和 肾 损 伤 的 保 护 作 用 [J]. 中 国 煤 炭 工 业 医 学 杂 志,2013,16(7): [3] FuJB,FuLH,PanF,etal.Protectiveefectofrheinonliver andkidneyforsub chroniccadmiumiumtoxicityinmice[j].chin JCoalIndMed,2013,16(7): [4] DingYJ,ChenYH.Developmentalnephrotoxicityofaristolochic acidinazebrafishmodel[j].toxicolapplpharmacol,2012,261 (1): [5] ZhouW,HildebrandtF.Induciblepodocyteinjuryandproteinuria intransgeniczebrafish[j].jamsocnephrol,2012,23(6): [6] 苏 健, 殷 立 平, 张 鑫, 等. 大 黄 酸 对 慢 性 移 植 肾 肾 病 大 鼠 肾 组 织 抗 纤 维 化 因 子 表 达 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 与 治 疗 学,2011,16(10): [6] SuJ,YinLP,ZhangX,etal.Influencofrheininterventionon theexpresionofhgfandbmp7inrenaltisueofratswithchron icalalograftnephropathy[j]. Chin JClin PharmacolTher, 2011,16(10): Protectiveefectofrheinonaristolochicacid inducedrenalinjuryinzebrafish WANGXue,LIUKe chun,wangxi min,hanli wen,zhangshan shan, HEQiu xia,chenxi qiang,hanjian,wangrong chun (BiologyInstituteofShandongAcademyofSciences,ZebrafishDrugScreningPlatformofShandongAcademyofSciences, KeyLaboratoryforBiosensorsofShandongProvince,Jinan ,China) Abstract:Aim Tostudytheefectofrheinonrenal damageinducedbyaristolochicacid.methods Ze brafishmodelofaristolochicacidnephropathy,genera tedbytreatingzebrafishlarvaewitharistolochicacid for24h,wastreatedwithrheinsimultaneously.mor pholigicalchangeswereobservedandthecreatinine levelinlarvaetisuewasmeasured.andmrna ex presionlevelsofinflammatoryfactorcox2aandfibrosis factortgf β1 inlarvaetisueweredetected using qpcr.results Somelarvaeshowperiocularedema andcirculationsystemdefectione.g.weakheartbeat, narowcardiacvesicle,decreasedbloodflowandeven blockage,withadose responserelationshipafterexpo suretoaristolochicacidfor24h.thecreatininelevel inlarvaetisueofthetreatedgroupwassignificantly higherthanthatofthecontrollarvae.andtheexpres sionlevelsofcox2aandtgf β1inlarvaetisueofthe treatedgroupwerealsosignificantlyincreased.per centageofabnormallarvaeandcreatininelevelinlar vaetisueweredecreasedwhentreatedwithrheinsim ultaneously.andtheexpresionlevelsofcox2awas down regulatedbyrheincomparedwiththearistolochic acidtreatedgroup.butrheinhadnoefectontgf β1 expresion.conclusion Tosomeextentrheincan protectrenalfrom damage induced by aristolochic acid. Keywords:aristolochicacid;zebrafish;larvae;kid ney;rhein;creatinine

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