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3 药学实践杂志 50 2017 年 1 月 25 日第 35 卷第 1 期 Journal of Pharmaceutical Practice Vol 35 No 1 January 25 2017 线计算 PT X 含量 计算释放百分率 样品处理方 法 加入 2 ml 乙酸乙酯 涡旋 5 min 静置分层后取 上层液体 重复 2 次 合并萃取液 于真空下挥干溶 剂 进样前 加入100 μl乙腈复溶 混匀 2 4 细胞摄取试验 用 PBS 缓冲液分别配制浓度 为 12 5 μg ml 的罗丹明 B 标记的 3 种不同取代度 的载药纳米粒子溶液和浓度为5 μg ml的 Hoechst 33342 溶液 避光保存 备用 取适宜大小的盖玻片 放入 24 孔板中 将肝癌细胞 QGY唱7703 以每孔约 50 000 个的密度接种于 24 孔板中 放入培养箱中孵 育过夜 使细胞贴壁 给予罗丹明 B 标记的载药纳 米粒子溶液 12 5 μl 置培养箱37 下培养 3 h 用 PBS 缓冲液冲洗 3 遍 去除未被细胞吞噬的纳米粒 子 然后加入 4 的甲醛溶液于 4 固定30 min 再 用预冷的 PBS 洗涤 重复 3 次 每孔加入 300 μl Hoechst 33342 溶 液 细 胞 核 染 料 放 入 培 养 箱 37 孵育5 min 对细胞核进行染色 孵育完毕 快 速吸除染液 再用预冷的 PBS 冲洗 3 遍 除去多余 的染料 最后将盖玻片置于载玻片上 依次调节激 光共聚焦显微镜的波长为405 488 nm 其中405 nm 为 Hoechst 33342 的激发波长 488 nm 为罗丹明 B 的激发波长 并分别拍照 2 5 体外细胞毒性试验 用 PBS 缓冲液配制浓度 分别为 6畅 25 10 1 25 102 2 5 102 5 102 1 103 2 103 4 103 8 103 μg ml 的空白纳米粒子 溶液 浓度分别为 6畅 25 10 5 6畅 25 10 4 6畅 25 3 2 1 10 6畅 25 10 6畅 25 10 6畅 25 6畅 25 10 2 6畅 25 10 μg ml 的 PT X 溶液 加入不超过总体积 1 的 DM SO 助溶 及相同浓度的 3 种不同取代度 的载药纳米粒子溶液 按 PT X 含量计 和浓度为 5 mg ml的 M T T 溶液 备用 将处于指数生长期 的肝癌细胞 QGY唱7703 接种于 96 孔板中 每孔约 5000 个细胞 于 37 下在 CO2 培养箱中培养过夜 待细胞完全贴壁后 分别加入 2 μl 上述空白纳米粒 子溶液 PT X 溶液及载药纳米粒子溶液 使得空白 纳米粒子终浓度分别为 0 625 1 25 2 5 5 10 20 40 80 μg ml PT X 溶液及载药纳米粒子终浓度分 7 6 5 别为 6畅 25 10 6畅 25 10 6畅 25 10 6畅 25 10 4 6畅25 10 3 6畅 25 10 2 6畅 25 10 1 6畅 25 μg ml 并设空白对照组 将 96 孔板放入培养 箱继续培养 24 48 h 取出 96 孔板 每孔加入 20 μl M T T 溶液 加毕 放入培养箱中孵育 4 h 后取出 去 除培养基 加入150 μl DM SO 轻轻振摇混匀 采用 酶标仪在 490 nm 波长下检测各孔吸光度值 A 计算 细胞存活率和 IC50 3 结果与讨论 3 1 纳米粒子的表征 3 1 1 形态学表征 纳米颗粒的表面形态如图 1 所示 可见制备的纳米粒子外观较好 基本上呈球状 分布 图1 空白 左 载药 右 纳米粒子形态 3 1 2 纳米颗粒的粒径 Zeta 电位 载药量和包封 率 见表 1 表1 纳米颗粒的粒径 Zeta 电位 载药量和包封率 C HSB 的取 代度 粒径分布 nm Zeta 电位 m V 载药量 包封率 6畅 55 7 30 100 250 5 7 12 99 59 25 120 300 8 87 17 72 72 06 8 95 90 350 3 37 14 07 53 47 所制备纳米粒子的 Zeta 电位绝对值在 3 9 之 间 取代度为 7畅 30 的纳米粒粒径稍大于 6畅 55 的载药纳米粒 载药量与包封率在 3 种纳米粒中最 高 取代度为 8 95 的纳米粒粒径分布最广 并且 载药量与包封率较低 可能是因为疏水性取代基多 疏水性较强 不利于 CHSB 自聚集成纳米粒子 对 药物包裹也比较少 3 1 3 DSC 表征结果 在 3 种不同取代度的纳米 粒中选取取代度为 6畅 55 的 CHSB 进行 DSC 表征 实验 见图 2 图2 PTX 空白纳米粒子及载药纳米 粒子的差示量热扫描 DSC 表征结果 1 P T X 2 空白纳米粒子 3 P T X唱空白 纳米粒子 3 10 4 载药纳米粒子 如图所示 PT X 在 215 出现尖锐的熔点吸热

4 药学实践杂志 2017 年 1 月 25 日第 35 卷第 1 期 Journal of Pharmaceutical Practice Vol 35 No 1 January 25 2017 峰 空白纳米粒子无明显吸热峰 载药纳米粒子的图 谱显示 PT X 的特征几乎消失 而 PT X唱空白纳米粒 子 3 10 的物理混合物的图谱上 PT X 在 215 的 吸收 峰 只 是 有 所 减 弱 DSC 图 谱 表 明 PT X 与 CHSB 之间并非是简单的物理混合 而是药物被包 载于载体材料内部 3 1 4 药物的体外释放 3 种不同取代度的载药 纳米粒的体外释放 见图 3 图3 不同取代度 CHSB 制备的 载药纳米粒子的体外释放情况 从试验数据可以看出 药物的释放分为两个阶 段 即快速释放阶段和缓慢释放阶段 3 个取代度 的 CHSB 制备的载药纳米粒子在 1 h 内释放量均小 于 40 取代度为 7 30 的 C HSB 制备的载药纳 图4 51 米粒子缓释效果最好 取代度为 8 95 的 CHSB 制 备的载药纳米粒子在前期释放最快 3 种载药纳米 粒子在96 h内释放量均达到 95 0 以上 3 2 细胞摄取试验 通过激光共聚焦显微镜观察 纳米颗粒在细胞内的内吞和分布 见图 4 罗丹明 B Rhodamine B 标记的载药纳米粒子 与 QGY唱7703 细胞共孵育 3 h 在激发波长 488 nm 下可观察到明显的红色荧光 见图 4 Rhodamine B 项 经 Hoechst 33342 细 胞 核 染 色 后 在 405 nm 下 可观察到蓝色荧光 见图 4 Hoechst 33342 项 将前两个通道重叠后 观察到红色荧光在蓝色荧光 周围 见图 4 Over lay 项 说明纳米颗粒主要分布 在细胞核周围 纳米颗粒被内吞进入了 QGY唱7703 细胞 3 3 体外细胞毒性试验 细胞毒性试验显示 所制 备的空白纳米粒子在设定的浓度范围内 细胞活性 接近 100 几乎无毒性 见图 5 表 明 载 体 材 料 CHSB 具备良好的生物安全性 适宜于作为药物载 体 载药纳米粒子在设定浓度范围内对 QGY唱7703 细胞有杀伤性 且呈剂量依赖性 杀伤力随浓度的增 大而增强 随时间的延长而增大 载药纳米粒子相对 于同浓度的药物溶液来说 细胞毒性更大 见图 6 这可能是由于细胞对纳米粒子的摄取比游离药物 多 载药纳米粒比游离药物更易进入细胞内 另外 QGY唱7703 细胞对载药纳米粒子摄取的电镜图

5 药学实践杂志 52 2017 年 1 月 25 日第 35 卷第 1 期 Journal of Pharmaceutical Practice Vol 35 No 1 January 25 2017 图5 空白纳米粒子对 QGY唱7703 细胞的活性影响 A 为 24 h 时 B 为 48 h 时 n 6 倡 P 0 05 倡 图6 倡 P 0 01 与空白对照组 CO N 比较 载药纳米粒子对 QGY唱7703 细胞的活性影响 A 为 24 h 时 B 为 48 h 时 n 6 倡 P 0 05 倡 通 过 SPSS 22 统 计 软 件 得 到 表 2 可 知 3 种 CHSB 的IC50 远 小 于 游 离 紫 杉 醇 其 中 取 代 度 为 倡 P 0 01 与空白对照组 CO N 比较 8 95 的 载 药 纳 米 粒 抑 制 肿 瘤 效 果 最 好 IC50 为 0 88 μg ml

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