!"#$%&%'% 甲双胍己经作为潜在的抗癌药物成为研究的热点 二甲双胍对多种癌细胞株有明显的肿瘤抑制效应 在多种不同类型的肿瘤中有抗癌作用 但目前其对肺癌 细胞株是否有抑制作用尚有待进一步研 究 本项目的研究总体方案思路为通过体外试验 深入探讨二甲双胍促进肺癌 细胞凋亡的效应及其分子机制 然后从整

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1 二甲双胍对肺癌 细胞增殖 迁移 侵袭能力及乳酸生成的影响 谢建将 陈敏东 陈曲海 梁登峰 徐子迅 吕德雄 白文杰 广州市第一人民医院 广东广州 摘要 目的 探讨二甲双胍对肺癌 细胞增殖 迁移 侵袭能力 乳酸生成的影响 方法 应用 和 等标记 流式细胞仪对肺癌 细胞凋亡及周期特异性的检测 运用!"# 的方法检测 #$%&$%'#$%&$% 活化情况!! 检测细胞增殖活力!$% 体外迁移实验检测细胞体外迁移和侵袭能力 并检测乳酸生成情况 结果 二甲双胍诱导的细胞凋亡主要在细胞周期的 期发生 采用二甲双胍凋亡诱导 对照组未做处理 结果显示观察组的 #$%&$%' ()*#$%&$% (+**+ 的表达值显著高于对照组 *+*+'*+-*!$% 结果显示 第 -. 二甲双胍组体外迁移细胞数 * 明显增加 二甲双胍组细胞活力 +'/),/ 下降 二甲双胍组乳酸生成 ))*' 明显降低 结论 二甲双胍诱导的细胞凋亡与肺癌 细胞的细胞周期相关 存在 期细胞周期阻滞的周期特异性 且此过程中发生了 0$%&$% 活化 抑制细胞活性及迁移侵袭能力 降低乳酸的生成 促进肿瘤细胞凋亡 主题词 二甲双胍 肺肿瘤 细胞 细胞凋亡 细胞周期中图分类号 -') 文献标识码 文章编号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肺癌发病率和病死率均呈持续上升趋势 肿瘤在局部呈侵袭性生长并易发生转移 其中肺转移为 其死亡的主要原因 细胞的存活和凋亡是生命的 通讯作者 谢建将 主治医师 硕士 广州市第一人民医院胸外科 广东省广州市越秀区盘福路 号 2$=$$0$>,'+0 收稿日期 -' 修回日期 - 矛盾统一现象 肿瘤的生长和凋亡都不能用细胞的周期和凋亡理论进行单独的完整解释 肿瘤是一类细胞增殖异常的病变 在这一过程中细胞的增殖和凋亡的调控通路受到了破坏 二甲双胍 43 是 型糖尿病患者口服的一线类降糖药物 通过降 ' 低外周组织对胰岛素的抵抗来抑制肝糖异生 二 ''

2 !"#$%&%'% 甲双胍己经作为潜在的抗癌药物成为研究的热点 二甲双胍对多种癌细胞株有明显的肿瘤抑制效应 在多种不同类型的肿瘤中有抗癌作用 但目前其对肺癌 细胞株是否有抑制作用尚有待进一步研 究 本项目的研究总体方案思路为通过体外试验 深入探讨二甲双胍促进肺癌 细胞凋亡的效应及其分子机制 然后从整体水平验证研究二甲双胍抑制肺癌 生长的信号机制 为二甲双胍治疗肺癌 提供理论依据 为将其开发作为抗肺癌 的新的治疗药物提供数据支持 & 材料与方法 主要试剂 细胞与仪器试剂 肺癌 细胞株中国科学院细胞库 含血清的完全培养基及不含血清培养基 美国 ()! 公司 *+ 试剂盒 上海硕盟生物 异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白 武汉博士德,-- 试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 -. 孔培养板 美国 # 公司 &/"0 培养皿 1 孔板 美国 # 公司 含 - 的胰酶 美国 ()! 公司 凋亡相关基因 ) 美国 公司 仪器 细胞培养超净台 2 苏州净化 3 培养箱 2 美国 4 $ 0 3 倒置相差显微镜 2 日本奥林巴斯 3 高转速冷冻离心机 2 德国 )# 35/6 冰箱 2 日本松下 3 高压消毒箱 2 美国 -37 流式细胞仪 美国 ) 公司 *+ 仪 2 澳大利亚 + #3 细胞培养与传代人肺癌 细胞培养于含 &/8 胎牛血清及双抗的,, 培养基中 置于 8! 9: 孵箱中传代培养 当细胞密度达到 &/ 1 以上时进行传代 清洗培养基后 用含 //8 - 的胰蛋白酶进行细胞消化 倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化 加入同体积的有血清培养基 吹打 &/ /// ;0 离心 0 弃上清 取细胞悬液 计数后接种到新的培养瓶中 本研究的所有实验均重复 9 次 细胞处理待细胞贴壁生长至 & 1 当细胞处于对数生长期时予二甲双胍凋亡相关基因 ) 刺激 & 后进行细胞收集 加入 * 刺激 & 细胞 对照组未 加 * 刺激 然后加入 )&#;0 的刺激 后收集细胞 +-5*+ 半定量逆转录聚合酶链反应 方法取人肺癌 细胞定量 &//0# 提取总 + 取 # 总 + 行逆转录 " 取 / 作为反应体系 *+ 反应由逆转录产物 以及 & + 和 " 9" 的引物共同组成 反应过程按照标准的 +-5*+ 进行 首先预变性的反应条件为 0 接着进行梯度变性反应 9/ 1/ 9/ :1/ ::0 递减 共进行 9/ 次的循环 然后对所得到的 *+ 产物进行琼脂糖凝胶电泳 通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析 内参选择 & + 作为参照 同样完成以上 *+ 系统的成像 对得到的半定量结果进行对比分析 通过量化的吸光度积分值进行分析 值 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞的凋亡周期采用 ';*( 的方法进行凋亡的检测 细胞离心去除培养基之后冷却至 进行细胞洗涤 调整浓度至 &/1;0 取 &// 的细胞悬液加入 '7(- 和 *( 避光 &0 之后进行流式检测 采用 *( 的方法检测细胞的凋亡周期 对收集的细胞加入 '7(- 室温避光 9/0 以后用 进行洗涤 次 加入不换甲醇的甲醛 &0 进行细胞固定 洗涤 次 加入 *( 染色剂 静置 & 之后进行流式细胞的检测 $" ; 双标流式细胞仪分析人肺癌 细胞的周期特异性 对收集的细胞采用乙醇固定过夜 将固定后的细胞用 *) 冲洗 次 用 -&// 处理 0 次 用 *) 清洗 次 用 ) 稀释抗体 过夜 第 加用羊抗鼠 (# 室温静置 /0 *) 洗涤之后 加入 *( 和 + 进行 染色 进行流式细胞检测,-- 法检测细胞活力将细胞接种于 1 孔板 当细胞汇合度达到 /8 时 给予二甲双胍 &/ 二甲双胍 后 加入 / 0#;0,-- 继续培养 后吸弃培养液 每孔加入 &/,! 震荡使结晶物充分溶解 于酶标仪 1/0 处测! 值 细胞相对活力 8 实验组!; 对照组! 值 &//8 -. 体外迁移体系于种板前 & 血清饥饿 & 常规消化 离心收 9

3 集细胞 用低血清 培养液 含 混悬成密度为 的单细胞悬液 将!"#$%&' 培养池放入 孔培养板中 上室内加入 细胞悬液 约 细胞 下室内加入 含 的 培养液 置于 孵箱培养 后 ( 洗 次 用棉球小心擦去上室内细胞 多聚甲醛固定 )*$( 洗 次 结晶紫染色 *$( 洗 次 去掉多余染料 显微镜下观察拍照 棉签吸掉多余水分 用 十二烷基硫酸钠 溶解细胞 *$ 完全溶解后 取 细胞裂解液 放入 孔板细胞培养板中 $ 酶标仪测定吸光值 乳酸生成检测运用酶联免疫吸附法 -./ 法 对细胞培养 后培养基中的乳酸含量进行测定 深圳晶美有限公司 由我院检验科完成 统计学处理所有采集的数据应用 ( 统计软件进行分析 其中对符合正态分布资料的数据采用 % 表 示 应用 #$$0&*1$' 检验进行两两数据之间比较 ( 为差异有统计学意义 肺癌 /+ 细胞加入 1(/ 以后进入细胞周期出现了 ) 期的细胞 如 *"' 细胞周期特异性二甲双胍诱导肺癌 /+ 细胞发生在 期 二甲双胍诱导 1(/ 刺激的肺癌 /+ 细胞 细胞周期发生在 期 对照组未加 1(/ 没有明显的凋亡发生 *$2/ 双标流式细胞术对细胞周期的分析肺癌 /+ 细胞处在 期 1(/ 刺激之后出现在 早 晚 期 加入二甲双胍诱导之后 *$ 表达下降 细胞阻滞存在 期 肺癌 /+ 细胞中 #%3#%'#%3#%'+ 42/ 表达情况观察组采用二甲双胍诱导 对照组未做处理 观察凋亡相关基因 #%3#%'#%3#%'+ 42/ 的表达 结果显示观察组的 #%3#%'#%3#%'+ 42/ 的表达值显著高于对照组 且差异均具有统计学意义 ( 随着作用时间延长 观察组细胞凋亡指数逐渐升高 与对照组比较差异有统计学意义 ( 均 5 见!#6 ' )*"' 结果 细胞凋亡情况对数生长的肺癌 /+ 细胞加入二甲双胍诱导 凋亡细胞增加了, 加入 1(/ 刺激的肺癌 /+ 细胞再加入二甲双胍诱导 凋亡增加至 加入 1(/ 刺激对人肺癌 /+ 细胞凋亡影响较只加入二甲双胍诱导的凋亡效果更明显 见 *"' *"' 鉴定加入 的肺癌 细胞进入细胞周期检测肺癌 /+ 细胞加入 1(/ 刺激后细胞增殖的情 况 结果显示 处于静止期的 9$1! "## '$%$% "' $#% %& &%" # "'" 7 -/88-/! "## '$%$% "' $#% %& &%" #' # "'"! "## $%#&'% %& # "'" "## '& #'% 9$1 7 -/88-/

4 !"#$%&%'% 二甲双胍对肺癌 1-/ 细胞活力的影响 与 组 /.+ 比较 二甲双胍组 -,/-/. 中肺癌 1-/ 细胞活力显著降低 差异有统计学意义 - 肺癌 1-/ 细胞体外迁移能力 体外迁移实验结果显示 经二甲双胍干预之后肺癌 1-/ 细胞体外迁移的能力明显降低 - 第 + 对照组体外迁移细胞数目明显高于二甲双胍组 - 见, ( )! "! " # $!% # & '!! #!# & # 乳酸生成的影响 2341 法对乳酸含量进行测定 二甲双胍组乳酸生成明显降低 - 见 ()* +-. &/&, ).-,,-,.,& & -., 0, 讨论, / ) ()*, -., +. /, 近半个世纪来 发达国家特别是工业发达国家 肺癌发病率和病死率均呈持续上升趋势 随着我国逐渐步入老龄人口社会以及工业化进程加快 肺癌 ( *!! ++#!% + %""!+ + 的发病率和死亡率还将持续上升 该 1))" :; 病预后较差 目前主要的治疗方法是,. 手术及全身化疗的综合治疗方法 但 ) -,-./, +- ()*,-/ 是还是存在复发和转移的可能 由 )7"* ) ") #8-9 "* ),8- 于肺癌发病隐匿 进展很快 很多患 者就诊时已达晚期 同时目前还缺乏肺癌 1-/ 的, 诊断和治疗靶标 因此寻找生物学靶标对于疾病的 诊治至关重要 本研究探求肺癌的侵袭机制 寻找靶 / 点基因与疾病的相关性 对其的治疗和预后判断提.5 供一定的指导价值! " # $!% # & '!!! #!# & # ( $ 1 ( " +% #!! #!# & #!,+ + ()*,./-. ) /.,.,+,- ( * ""#+! +* #+# #% #+! 肿瘤的发生发展是一个复杂的过程 肿瘤细胞的生存凋亡与细胞周期有关 细胞周期具有高度的保守性 凋亡不会对正常机体需要的细胞产生威胁 能够对不必要的细胞产生精确的生理调控 凋亡与细胞增殖之间有着潜在相关性 很多与增殖关系密切的癌基因与细胞凋亡密切相关 随着对细胞凋亡认识的深入 临床研究发现肿瘤的预后与组织药物反应明显相关 提示了化疗在肺癌 1-/ 治疗中的重要作用 而肺癌 1-/ 的治疗在近, 年的时间里进入了平台期 患者的长期生存率并没有明显提高 且有部分患者对目前使用的药物不敏感 探索新的 有效的化疗药物显得尤为重要 细胞的凋亡具有周期性的特征 往往凋亡的发生是细胞被阻滞在细胞周期的其中一个时相当中 绝大多数的肿瘤化疗是采用该理论诱导细胞在特定的周期内发生凋亡 以 /5 杀伤肿瘤细胞 肺癌 1-/ 细胞在人体炎症和外伤的时候会急剧增殖 当人体的炎症病灶消退以后其状态又趋向 稳定 我们在体外对肺癌 1-/ 细胞株进行培养 在未经刺激的情况下 细胞处于 期的状态 当细胞被二甲双胍诱导之后 发生凋亡的细胞较少 细胞不进入细胞周期 而在此基础上采用人骨肿瘤中组织型纤溶酶原激活剂 )1 可以激活肺癌 1-/ 细胞进入细胞周期 促使细胞增殖 细胞进入了 4 6( &,& 期 细胞凋亡率明显增加 可见细胞凋亡的发生只有在进入到细胞中期之后才被检测到 这也与临,.

5 床放化疗的治疗作用有一定的相似之处 放化疗对细胞产生打击 使细胞进入细胞周期 细胞的凋亡率 远高于静止期的肿瘤细胞 细胞的凋亡是否具有周期特异性 我们通过 的方法进行检测二甲双胍诱导的细胞凋亡情况 在凋亡的早期细胞凋亡出现伴随着膜外翻的现象 的方法就是利用 与此现象的相结合 通过细胞核染色 对凋亡周期特异性进行判断 结果显示 二甲双胍诱导的细胞凋亡与周期特异性的凋亡主要发生在细胞周期的 期 细胞的周期蛋白是一类在细胞周期中特异性表达的蛋白质 可以通过刺激细胞周期的依赖性蛋白激酶使细胞有特异性周期表现 周期蛋白最大的特点是时相性!"#$%& 双标流式细胞术对细胞周期的分析主要是将细胞!"# 的表达与细胞处的位置结合分 ' 析 可以得到细胞的详细周期信息!"# 完全在 期合成 期不会出现!"# 其中以晚 期表达最强!"# 可以完全将 很好的分开 根据本实验结果可见二甲双胍诱导的细胞凋亡对肺癌 细胞!"# 的表达是下降的 细胞在 期被阻滞 此过程也伴随着凋亡相关蛋白!! 的高表达及活化 同时 ()"" 结果显示 第 * 二甲双胍组体外迁移能力明显加强 二甲双胍组细胞活力下降 二甲双胍干预后可明显降低乳酸生成 说明细胞的糖代谢受到了一定抑制 综上所述 肺癌 细胞在静止期并没有启动周期进程 进入周期后细胞凋亡才会变得敏感 二甲双胍诱导凋亡与肺癌 细胞的周期有密切关系 可抑制细胞活性及迁移侵袭能力 降低乳酸生成 参与细胞凋亡 在特定的时相中 这样也对细胞凋亡和周期特异性做了一个很好的解释 从一方面说明了凋亡的周期性 细胞凋亡在恶性肿瘤中具有重要作用 本研究对二甲双胍诱导凋亡做了探索性的研究 对肿瘤的诱导凋亡和治疗来说有着一定的临床指导意义 参考文献 -./0(*1 ("! %1// %/ ". 1( 1!((1/ 1."/!/*!( 2/ / %(! 2: / "//.1(!// * 1 1. ( *.!/ *." 9/ """; (!/( * 2"!( (445'67 +', 0:09 2/ " 9 ( """; (!/( / *"1/ ".9!!( / ("1 ( /.*.(" (!/!" 2*! 赵卉 何凤莲 方明 等 高表达的 "" 样受体在肺癌发生发展中的初步探讨 实用医学杂志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