第 1 期程成国, 等.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 41 ERCC1 sirnaorbrca2 sirnasuppresedcelproliferationandpromotedcelapoptosisproducedbycis platin.co t

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肯岑
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1 第 27 卷第 1 期 2017 年 1 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.1 Jan.2017 ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性程成国, 李坚, 金君 ( 江苏大学附属医院呼吸内科, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨沉默 ERCC1 和 BRCA2 基因后逆转顺铂耐药肺癌细胞株 (A549/DDP) 对顺铂耐药性的效应及其分子机制方法 : 合成针对 ERCC1 和 BRCA2 基因的 sirnas(ercc1 sirna 和 BRCA2 sirna), 用脂质体转染试剂将其分别或共同转染于 A549/DDP 细胞蛋白质印迹法测定转染前后 A549/DDP 细胞 ERCC1 和 BRCA2 蛋白的表达以确定转染成功, 并检测转染前后 A549/DDP 细胞经顺铂诱导的 FANCD2 单泛素化水平及 BRCA1 和 RAD51 蛋白表达水平 ;CCK 8 法测定转染前后 A549/DDP 细胞对顺铂的敏感性 ;AnnexinV/PI 流式细胞术测定转染前后 A549/DDP 细胞凋亡率 ; 免疫荧光法测定转染前后 A549/DDP 细胞核内 FANCD2 核聚小体和 RAD51 核聚小体的表达结果 : A549/DDP 细胞转染 ERCC1 sirna 和 BRCA2 sirna 后 ERCC1 和 BRCA2 蛋白表达均明显降低 (P<0.05), 表明转染有效转染 ERCC1 sirna 后顺铂诱导的 FANCD2 蛋白单泛素化水平和核聚小体表达均明显降低转染 BRCA2 sir NA 后顺铂诱导的 BRCA1 和 RAD51 蛋白表达及 RAD51 核聚小体表达明显降低与此同时, 转染 ERCC1 sirna 或 BRCA2 sirna 均可增加 A549/DDP 细胞对顺铂的敏感性, 以及增强顺铂诱导的细胞凋亡作用, 共转染 ERCC1 sirna 和 BRCA2 sirna 则进一步增强顺铂对 A549/DDP 的细胞毒性作用结论 : 沉默 ERCC1 和 BRCA2 基因可通过抑制 A549/DDP 细胞株范可尼贫血通路和同源重组通路的 DNA 损伤修复功能, 逆转 A549/DDP 细胞对顺铂的耐药性 ; 两个基因共沉默对顺铂耐药性的逆转作用更为明显 [ 关键词 ] 肺癌细胞 ; 顺铂 ; 耐药 ;ERCC1;BRCA2 [ 中图分类号 ] R734.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 程成国, 李坚, 金君.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(1): Co silencingofercc1andbrca2genesefectivelyreverseresistance ofcisplatinresistantlungcancercelstocisplatin CHENGCheng guo,lijian,jinjun (DepartmentofRespiratoryMedicine,AfiliatedHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectofco silencingofercc1andbrca2genesonreversing cisplatinresistanceinresistantlungcancercela549/ddp.methods:smalinterferencernas(sirnas) targetingercc1andbrca2genes(ercc1 andbrca2 sirna)weretransfectedintoa549/ddpcels usinglipofectamine2000.transfectioneficacywasverifiedbyproteinexpresionsofercc1andbrca2 detectedwithwesternbloting.brca1andrad51proteinsexpresionsaswelasthefancd2monoubiq uitinationinducedbycisplatinweredeterminedbywesternbloting.thecelproliferationandapoptosis rateina549/ddpcelspre andpost treatmentwithcisplatinweremeasuredbycck 8asayandflowcy tometryusingannexinv/pistrain,respectively,beforeandaftertransfection.theformationoffancd2 andrad51nuclearfociweredetectedusingimmunofluorescencestaining.results:cisplatin induced FANCD2monoubiquitinationandFANCD2nuclearlociformationweresignificantlydecreasedaftertransfec tionofercc1 sirna.theexpresionsofbrca1andrad51proteinsandrad51nuclearfociinducedby cisplatinweremarkedlyreducedaftertransfectionofbrca2 sirna(p<0.05).individualtransfectionof [ 作者简介 ] 程成国 (1990 ), 男, 硕士研究生 ; 李坚 ( 通讯作者 ), 教授, 主任医师, 博士生导师,E mail:lijian541226@163.com

2 第 1 期程成国, 等.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 41 ERCC1 sirnaorbrca2 sirnasuppresedcelproliferationandpromotedcelapoptosisproducedbycis platin.co transfectionofthetwosirnasfurtherenhancedthecytotoxicityofcisplatintoa549/ddpcels,as comparedtotransfectionofercc1 sirnaorbrca2 sirnaalone.conclusion:silencingofercc1and BRCA2genecouldreversetheresistanceofresistantlungcancercelstocisplatinthroughinhibitionoftheFA pathwayandthehrpathwayrespectively,andthereversionefectofcisplatinresistancewasfurtherpotentia tedbyco silencingofercc1andbrca2genes. [Keywords] lungcancercel;cisplatin;resistance;ercc1;brca2 以铂类为基础的联合化疗方案是晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 的一线治疗方案 [1], 但肿瘤细胞对铂类药物的耐药明显削弱了其疗效, 而 DNA 修复功能的增强是肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性的主要机制之一当交联剂药物如顺铂等进入细胞内, 可进入胞核共价结合于 DNA 复制叉位置, 形成铂 DNA 加合物, 导致链内交联 ( 占 DNA 交联性损伤的 85%~90%) 及链间交联 ( 占交联性损伤不足 5%) 形成 [2], 其中链间交联是对 DNA 最具毒性的损伤类型研究表明细胞内范可尼贫血 (FA) 通路同源重组 (HR) 通路核苷酸切除修复 (NER) 通路等相互协作共同实施对链间交联的修复 [3] FA 通路在链间交联修复中起关键作用链间交联损伤发生时, 由 ATR 激酶激活 FA 通路上游 8 种 FA 蛋白 (FANCA B C E F G L M) 及其他 FA 相关蛋白组成 FA 核心复合体,FA 核心复合体促使 FANCD2/FANCI 单泛素化, 并与其构成 ID 复合体, 定位于 DNA 损伤位点, 继而激活 FA 通路下游蛋白如 FANCD1/BRCA2 BRCA1 RAD51C RAD51 等共同修复链间交联, 以及中间过程中形成的双链断裂 [4-6] 其中同源重组通路在 FA 通路激活过程中起到了稳定复制叉的重要作用 [7-8] FA 通路的中心环节是 FANCD2/I 单泛素化, 依赖于 BRCA1, 所以这一路径又称 FA/BRCA 通路 [6] 本实验采用 sirna 转染技术分别沉默顺铂耐药肺癌细胞 A549/DDP 的 ERCC1 和 BRCA2 基因, 以及共沉默这 2 个基因, 通过测定沉默前后经顺铂诱导的细胞增殖抑制率细胞凋亡率和 FANCD2 单泛素化,BRCA1 和 RAD51 的表达水平以及 FANCD2 核聚小体与 RAD51 核聚小体表达变化, 探讨这种干预逆转 A549/DDP 细胞对顺铂耐药性的可能性, 以及 DNA 损伤修复通路的参与机制 1 材料与方法 1.1 主要材料 A549/DDP 和 A549 细胞株 ( 中科院上海生命科学研究院 );sirna 套装 : 含 ERCC1 与 BRCA2 特异性 sirna 及阴性对照 sirna( 广州锐博生物科技有限公司 ); 高糖 DMEM 及胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ); 顺铂注射液 ( 江苏豪森制药有限公司 );Lipo fectamine TM 2000 试剂盒 TritonX 100(ThermoFisher Scientific);CCK 8 检测试剂盒 ( 日本同仁化学研究所 );AnnexinV FITC/PI 流式细胞凋亡检测试剂盒 ( 美国 BD 公司 );ERCC1 BRCA2 BRCA1 蛋白抗体 ( 美国 CelSignaling 公司 );RAD51 蛋白抗体 ( 美国 SantaCruz 公司 ); 羊抗鼠二抗羊抗兔二抗 PVDF 膜牛血清白蛋白 ECL 发光剂 ( 美国 Milipore 公司 );FANCD2 蛋白抗体 AlexaFluor 594 荧光标记羊抗兔二抗 ( 美国 Abcam 公司 ); 低聚甲醛 DAPI 染色液 ( 上海翊圣生物科技有限公司 ) 1.2 方法细胞培养用 DMEM( 加 15% 胎牛血清 ) 培养 A549 A549/DDP 细胞株, 并置于培养箱 (37, 5%CO 2 饱和湿度 ) 孵育 sirna 转染 sirna 冻干粉瞬时离心, 用去 RNA 酶水配置成 20μmol/L 的液体剂型, 置于 -20 或 -70 保存 6 孔板培养 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ) 在 500μL 空白 DMEM 培养基 ( 不含双抗和血清 ) 中顺序加入 sirna 液体剂型与 Lipofectami ne TM 2000 储存液各 5μL, 混匀并于室温孵育 5min 后, 加入 6 孔板 ( 每孔预加入 1.5mLDMEM 培养基 ) 培养至少 24h 蛋白质印迹法测定各蛋白的表达 6 孔板培养 A549/DDP 细胞和 A549 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ) 在 6 孔板中分别加入含和 20μg/mL 顺铂的 2mL 培养基培养 24h, 加入细胞裂解液裂解细胞 (80μL/ 孔 ) 100 加热 5min 超声破碎 30s 离心 1min(12000 g,4 ), 提取蛋白行电泳 (10% SDS PAGE) 转膜 2.5h 封闭 2h 一抗孵育过夜 (4 ) TBST 洗膜 (5min 3 次 ) 二抗孵育 2h 显

42 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷色 (ECL 发光剂 ) Lane1D 凝胶分析软件分析灰度蛋白的相对含量为蛋白的表达与对应 β 肌动蛋白比值,FANCD2 单泛素化水平为 FANCD2 L/ FANCD2 S 比值, 实验重复 3 次 1.2.4 CCK 8 法检测细胞增殖率 96 孔板培养 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约 2000 个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ) 在 96 孔板中分别加入含 0 1.

1.2.5 AnnexinV/PI 流式细胞术检测细胞凋亡率 6 孔板培养 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约 1.5 10 5 个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ), 在 6 孔板中加入含 20μg/mL 顺铂的 2mL 培养基培养 48h, 胰蛋白酶 (0.

3 42 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷色 (ECL 发光剂 ) Lane1D 凝胶分析软件分析灰度蛋白的相对含量为蛋白的表达与对应 β 肌动蛋白比值,FANCD2 单泛素化水平为 FANCD2 L/ FANCD2 S 比值, 实验重复 3 次 CCK 8 法检测细胞增殖率 96 孔板培养 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约 2000 个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ) 在 96 孔板中分别加入含和 20μg/mL 顺铂的 100μL 培养基分别培养 24 48h, 同时设立空白组 ( 只含 DMEM) 进行校正加入 CCK 8 试剂 (10μL/ 孔 ), 培养箱孵育 1~2h, 最后酶标仪检测各孔的光密度 (D) 值细胞增殖率 =[( 实验组 D 平均值空白组 D 平均值 )/( 阴性对照组 D 平均值空白组 D 平均值 )] 100%, 实验重复 3 次 AnnexinV/PI 流式细胞术检测细胞凋亡率 6 孔板培养 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ), 在 6 孔板中加入含 20μg/mL 顺铂的 2mL 培养基培养 48h, 胰蛋白酶 (0.25% 无 EDTA) 消化细胞,PBS 洗细胞 3 次, 离心后弃上清液,PBS 洗细胞, 再离心于流式管加入 100μL 细胞悬液 ( 细胞密度个 /ml), 于室温避光条件下顺序加入 5μL 的 An nexinv FITC 和 5μL 的 PI 同时轻摇混匀,15min 后加入稀释的结合缓冲液 400μL( 去离子水 1 4 稀释 ), 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ( 发射波长 530 nm 激发波长 488nm) 免疫荧光法观察核聚小体的表达 24 孔板培养转染前后的 A549/DDP 细胞并使每孔细胞数一致 ( 约个细胞 / 孔, 每组设置 3 个复孔 ), 设置空白对照组 ( 不加顺铂也不转染 ), 在 24 孔板中加入含 5μg/mL 顺铂的 1mL 培养基分别培养 24h 48h 后,4% 低聚甲醛固定细胞 30min PBS 洗细胞 (5min 3 次 ) 0.3%TritonX 100 透膜 30min PBS 洗细胞 (5min 3 次 ) 3% 牛血清白蛋白封闭 2h PBS 洗细胞 (5min 3 次 ) 一抗孵育过夜 (4 ) 对应荧光二抗孵育 1h( 室温避光 ) PBS 洗细胞 (5 min 3 次避光 ) DAPI 染核 15min PBS 洗细胞 (5 min 3 次 ), 最后荧光显微镜观察荧光强度 1.3 统计学分析应用 SPSS22.0 统计软件, 实验数据以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 多组比较行单因素方差分析, SNK q 检验进行两组均数比较,Dunnet t 检验行实验组与对照组均数比较,P<0.05 为差异有统计学意义采用 Blis 法计算肺癌细胞增殖的半数抑制浓度 (50% inhibitoryconcentration,ic 50 ) 2 结果 2.1 A549/DDP 细胞转染 sirna 后 ERCC1 和 BRCA2 蛋白的表达蛋白质印迹结果显示,A549/DDP 细胞分别转染 ERCC1 sirna 和 BRCA2 sirna 后,ERCC1 和 BRCA2 蛋白表达均明显低于阴性对照组及空白对照组 (P 均 <0.05); 阴性对照组和空白对照组间蛋白表达差异均无统计学意义, 表明 ERCC1 sirna 和 BRCA2 sirna 转染有效见图 1 和图 2 1: 空白对照组 ;2: 阴性对照组 ;3:ERCC1 sirna;a:p<0.05, 与 ERCC1 sirna 组比较图 1 A549/DDP 细胞转染 ERCC1 sirna 后 ERCC1 蛋白的表达 1: 空白对照组 ;2: 阴性对照组 ;3:BRCA2 sirna;a:p<0.05, 与 BRCA2 sirna 比较图 2 A549/DDP 细胞转染 BRCA2 sirna 后 BRCA2 蛋白的表达 2.2 A549/DDP 细胞转染 ERCC1 sirna 后 FANCD2 单泛素化水平转染前, 经不同浓度顺铂处理 24h 后,A549 细胞的 FANCD2 L/S 比值 ( 即 FANCD2 单泛素化水平 ) 随着顺铂浓度增加呈下降趋势 (F=26.18,P 均 <0.05) 而 A549/DDP 细胞的 FANCD2 L/S 比值随着顺铂浓度增加呈升高趋势 (F=50.05,P 均 <

第期程成国等ＥＲＣＣ和ＢＲＣＡ２基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性在每个顺铂浓度点均明显高于Ａ９细胞组水平均较未转染组明显降低Ｐ均提示Ｐ均表明在ＡＤＤＰ细胞中ＦＡＮＣＤ２ＢＲＣＡ２是调控ＢＲＣＡ及ＲＡＤ表达的重要因素的单泛素化水平即

ＢＲＣＡ２ＲＮＡ转染后ＡＤＤＰ细胞ＢＲＣＡ蛋白表达Ｐ与Ａ９细胞比较ｂＰ与ＡＤＤＰ细胞比较图ＡＤＤＰ细胞转染ＥＲＣＣＲＮＡ后ＦＡＮＣＤ２单泛素化水平ＡＤＤＰ细胞转染ＢＲＣＡ２ＲＮＡ后ＢＲＣＡ和ＲＡＤ蛋白表达水平转染前经不同浓度顺铂处理２ｈ后

两种蛋白胞比较在每个顺铂浓度点均明显高于Ａ９细胞组Ｐ图ＢＲＣＡ２ＲＮＡ转染后ＡＤＤＰ细胞ＲＡＤ蛋白表达均表明ＡＤＤＰ细胞同源重组通路的ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ分别及共转主要成员ＢＲＣＡ和ＲＡＤ蛋白的表达上调与顺铂

4 第期程成国等ＥＲＣＣ和ＢＲＣＡ２基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性在每个顺铂浓度点均明显高于Ａ９细胞组水平均较未转染组明显降低Ｐ均提示Ｐ均表明在ＡＤＤＰ细胞中ＦＡＮＣＤ２ＢＲＣＡ２是调控ＢＲＣＡ及ＲＡＤ表达的重要因素的单泛素化水平即ＦＡ通路的激活程度与顺铂耐见图图药有关ＲＮＡ转染后不同浓度顺铂处理经ＥＲＣＣＡＤＤＰ细胞２ｈ后ＦＡＮＣＤ２ＬＳ比值均较未转染组明显降低Ｐ均提示ＥＲＣＣ参与了ＦＡＮＣＤ２的单泛素化见图Ｐ与Ａ９细胞比较ｂＰ与ＡＤＤＰ细胞比较图ＢＲＣＡ２ＲＮＡ转染后ＡＤＤＰ细胞ＢＲＣＡ蛋白表达Ｐ与Ａ９细胞比较ｂＰ与ＡＤＤＰ细胞比较图ＡＤＤＰ细胞转染ＥＲＣＣＲＮＡ后ＦＡＮＣＤ２单泛素化水平ＡＤＤＰ细胞转染ＢＲＣＡ２ＲＮＡ后ＢＲＣＡ和ＲＡＤ蛋白表达水平转染前经不同浓度顺铂处理２ｈ后随着顺９细胞的ＢＲＣＡ蛋白表达水平呈铂浓度升高Ａ下降趋势Ｆ８Ｐ均ＲＡＤ蛋白表达水平亦呈下降趋势Ｆ８７Ｐ均而ＡＤＤＰ细胞的ＢＲＣＡ蛋白表达水平呈升高趋６Ｐ均ＲＡＤ蛋白表达水平势ＦＰ与Ａ９细胞比较ｂＰ与ＡＤＤＰ细亦呈升高趋势Ｆ８Ｐ均两种蛋白胞比较在每个顺铂浓度点均明显高于Ａ９细胞组Ｐ图ＢＲＣＡ２ＲＮＡ转染后ＡＤＤＰ细胞ＲＡＤ蛋白表达均表明ＡＤＤＰ细胞同源重组通路的ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ分别及共转主要成员ＢＲＣＡ和ＲＡＤ蛋白的表达上调与顺铂ＤＤＰ细胞对顺铂的敏感性染后Ａ耐药有关顺铂对转染不同ＲＮＡ的ＡＤＤＰ细胞转染ＢＲＣＡ２ＲＮＡ后不同浓度顺铂处理ＡＤＤＰ细胞２ｈ的ＢＲＣＡ及ＲＡＤ蛋白表达增殖的抑制作用ＡＤＤＰ细胞分别转染ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ后经顺铂处理２ｈ

江苏大学学报医学版第２７卷和８ｈ时的ＩＣ较未转染细胞对照组均明显降低Ｐ均同时共转染ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ的ＡＤＤＰ细胞经顺铂处理２ｈ和８ｈ后的ＩＣ不仅较未转染的细胞显著下降也较两个单转染细胞明显降低Ｐ均见表表ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后对顺铂的ＩＣ μｇｍｌ组别未转染组转染２ｈ ± ２转染８ｈ

5 江苏大学学报医学版第２７卷和８ｈ时的ＩＣ较未转染细胞对照组均明显降低Ｐ均同时共转染ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ的ＡＤＤＰ细胞经顺铂处理２ｈ和８ｈ后的ＩＣ不仅较未转染的细胞显著下降也较两个单转染细胞明显降低Ｐ均见表表ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后对顺铂的ＩＣ μｇｍｌ组别未转染组转染２ｈ ± ２转染８ｈ图６ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后９９± ７用顺铂处理２ｈ的增殖率ＥＲＣＣＲＮＡ组 ± ７９ ± ２ＢＲＣＡ２ＲＮＡ组８７± ２９９２± ６９共转染组６６± ７ｂ７± ６ｂＦ值８６６９Ｐ值Ｐ与未转染组比较ｂＰ分别与ＥＲＣＣＲＮＡ组与ＢＲＣＡ２ＲＮＡ组比较ＡＤＤＰ细胞分别转染ＥＲＣＣＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ后经不同浓度顺铂处理２ｈ和８ｈ图７ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后的细胞增殖率均明显低于未转染组Ｐ均８ｈ的增殖率用顺铂处理且随着顺铂浓度的增高增殖率逐渐降低呈剂量依２ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后凋亡率赖性除了２μｇｍｌ顺铂处理２ｈ时单转染的变化与共转染细胞间的细胞增殖率无明显差异ＰＲＮＡ和ＢＲＣＡ２ＲＮＡ及共转染后ＡＤＤＰ细外其余各顺铂浓度处理２ｈ和８ｈ时共转７２胞的早期凋亡率分别为８９± ８染细胞的增殖率均明显低于两个单转染细胞Ｐ均 ± ± 均明显高于未转染且两个单转染细胞之间的增殖率无明显细胞 ± Ｐ均而且共转差异Ｐ这表明ＥＲＣＣ和ＢＲＣＡ２基因共染细胞的早期凋亡率亦显著高于两个单转染细胞沉默对顺铂的增敏作用较单个基因沉默更为显著Ｐ均见图８该结果与细胞增殖率的测见图６和图７定结果一致流式细胞术检测结果显示单转染ＥＲＣＣ图８ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后经２ μｇｍｌ顺铂处理８ｈ的凋亡率ＡＤＤＰ细胞转染不同ＲＮＡ后ＦＡＮＣＤ２及ＲＡＤ核聚小体表达的变化免疫荧光检测结果显示ＡＤＤＰ细胞株经ｍｌ顺铂处理２ｈ与８ｈ后细胞核内的 μｇＦＡＮＣＤ２核聚小体及ＲＡＤ核聚小体表达均增强ＡＤＤＰ细胞转染ＥＲＣＣＲＮＡ后经 μｇｍｌ

DNA 交联损伤时,DNA 在双链间会发生共价连接, 导致双链不能分离, 从而无法完成转录或复制等细胞增殖的必需过程 [3] 因此,DNA 交联损伤的修复对细胞来说是一个巨大的挑战, 单一的 DNA 修复通路很难完成修复任务 NER 通路是各种大片段 DNA 损伤, 如紫外线损伤和化学致癌物 ( 顺铂 ) 等介导加合物的主要修复通路 ERCC1 为 NER 通路的关键限速酶, 其活性高低可反映

6 第 1 期程成国, 等.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 45 顺铂处理 24h 后细胞核内的 FANCD2 核聚小体表达较未转染细胞明显下降转染 BRCA2 sirna 后, 细胞核内的 RAD51 核聚小体表达亦显著下降见图 9 图 9 A549/DDP 细胞转染不同 sirna 后 FANCD2 及 RAD51 核聚小体的表达 ( 20) 3 讨论当顺铂进入细胞内引起 DNA 交联损伤时,DNA 在双链间会发生共价连接, 导致双链不能分离, 从而无法完成转录或复制等细胞增殖的必需过程 [3] 因此,DNA 交联损伤的修复对细胞来说是一个巨大的挑战, 单一的 DNA 修复通路很难完成修复任务 NER 通路是各种大片段 DNA 损伤, 如紫外线损伤和化学致癌物 ( 顺铂 ) 等介导加合物的主要修复通路 ERCC1 为 NER 通路的关键限速酶, 其活性高低可反映 NER 通路修复活性的水平 [9] 同时 ERCC1 也参与了顺铂诱导的链间交联的修复 FA 通路激活后首先促使 FANCD2/I 单泛素化, 然后单泛素化的 FANCD2/I 与 FA 通路上游蛋白形成 ID 复合物, 定位并募集 FA 通路下游蛋白包括 XPF ER CC1 等到达 DNA 损伤部位, 在链间交联的一侧由 XPF ERCC1 等核酸内切酶切开 DNA [10-13] 体内外研究表明 ERCC1 高表达与多种肿瘤对顺铂的耐药性相关, 而降低 ERCC1 表达可增强顺铂对癌细胞的细胞毒性 [14-16] 本实验应用 sirna 转染技术沉默 ERCC1 基因后 FANCD2 单泛素化水平和核聚小体的表达明显下降, 表明 ERCC1 在 FANCD2 单泛素化及核聚小体的核定位过程中也起到重要作用,ER CC1 在 FA 通路上游也参与了 FANCD2 的激活研究证明一些 FA 通路下游蛋白同时也是同源重组通路蛋白,FA 通路和同源重组通路在 DNA 修复过程中有着复杂的交互作用 [3] 在链间交联修复过程中,BRCA2 既是 FA 通路蛋白也是同源重组通路蛋白在同源重组通路中,RAD51 是关键蛋白, 敲除 RAD51 会引起广泛的染色体断裂, 导致细胞凋亡 [17] 研究发现 BRCA2 蛋白通过 N 末端片段与 PALB2 连接后, 可与 BRCA1 组成 BRCA1 PALB2 BRCA2 稳定复合物, 通过 8 个 BRC 基序与 RAD51 相互作用 [18] BRCA1 介导的双链断裂切除及随后的 RAD51 定位需要 BRCA2 的参与,BRCA1 RAD51 需要 BRCA2 协同才能在同源重组修复中发挥最大作用 [19-20] FA 通路激活过程亦需要 BRCA1 PALB2 BRCA2 复合物等通过调控同源重组来稳定复制叉 [3,21] 其中 BRCA2 能直接与单泛素化的 FANCD2 相互作用, 共同促进 BRCA1 和 RAD51 定位到染色质 DNA 损伤部位 [22-23] 本实验沉默 BRCA2 基因后 BRCA1 与 RAD51 蛋白表达及 RAD51 核聚小体表达均明显下降, 证明 BRCA2 调控 BRCA1 与 RAD51 的表达及 RAD51 核定位, 在同源重组通路的 DNA 修复过程中是不可或缺的我们发现, 分别沉默这两类基因均显著增加 A549/DDP 细胞对顺铂的敏感性, 结合上述结果, 表明沉默 ERCC1 基因后对顺铂的增敏效应主要是通过抑制 FA 通路和 NER 通路的 DNA 修复功能介导的, 而沉默 BRCA2 基因后的顺铂增敏效应主要源自于同源重组通路双链断裂修复功能的抑制当 FA 通路和同源重组通路被抑制, 顺铂对肺癌细胞的杀伤作用必然增强, 这与已报道的研究结果相吻合 [16,24-25] 值得注意的是, 当共沉默这两种基因

7 46 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷后,A549/DDP 细胞对顺铂的敏感性较单基因沉默进一步增强, 提示 ERCC1 和 BRCA2 虽然都参与了 FA 通路和同源重组通路的 DNA 损伤修复, 但它们作用的位点并不重叠在一个完全相同的路径上, 因而在抑制肺癌细胞 DNA 修复的作用上产生了叠加或协同效应, 有效逆转了顺铂耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性综上所述,FA 通路和同源重组通路的充分激活和表达是肺癌细胞对顺铂耐药的重要分子生物学基础沉默关键基因 ERCC1 和 BRCA2 可抑制相应通路下游 FANCD2 和 RAD51 的激活及核定位, 进而抑制对链间交联及双链断裂的有效修复, 增强了肺癌细胞对顺铂的敏感性共沉默 ERCC1 和 BRCA2 基因可有效逆转 A549/DDP 细胞对顺铂的耐药性 [ 参考文献 ] [1] SiegelRL,MilerKD,JemalA,etal.Cancerstatis tics,2015[j].cacancerjclin,2015,65(1):5-29. [2] 姜贺果, 戴春华, 李坚, 等.siRNA 沉默 FANCD2 基因增加肺癌 A549/DDP 细胞对顺铂化疗的敏感性 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2014,24(3): [3] DeansAJ,WestSC.DNA interstrandcroslinkrepair andcancer[j].natrevcancer,2013,11(7): [4] KimH,D AndreaAD.RegulationofDNA cros link repairbythefanconianemia/brca pathway[j]. GenesDev,2012,26(13): [5] AliAM,PradhanA,SinghTR,eta1.FAAP20:anovel ubiquitin bindingfa nuclearcore complexproteinre quiredforfunctionalintegrityofthefa BRCADNAre pairpathway[j].blood,2012,119(14): [6] 苏晋豫, 李坚, 陈永昌, 等.RADl8 基因敲除增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2015,25(2): [7] AIAboM,DejsuphongD,HirotaK,etal.Compensa toryfunctionsandinterdependencyofthedna binding domain ofbrca2 with the BRCA1 PALB2 BRCA2 complex[j].cancerres,2014,74(3): [8] BhatacharyyaA,EarUS,KolerBH,etal.Thebreast cancersusceptibilitygenebrca1isrequiredforsubnu clearasemblyofrad51andsurvivalfolowingtreat mentwiththednacros linkingagentcisplatin[j].j BiolChem,2000,275(31): [9] 王小杰, 许崇安.ERCC1 与 XPD 基因多态性对 NSCLC 化疗敏感性影响的研究进展 [J]. 现代肿瘤医学,2012,20(5): [10] BhagwatN,OlsenAL,WangAT,etal.XPF ERCC1 participatesinthefanconianemiapathwayofcros link repair[j].molcelbiochem,2009,29(24): [11] WangQE,MilumK,HanC,etal.Diferentialcontrib utoryrolesofnucleotideexcisionandhomologousrecom binationrepairforenhancingcisplatinsensitivityinhu manovariancancercels[j].molcancer,2011,10 (1):1-12. [12] UsanovaS,Piée StafaA,SiedU,etal.Cisplatinsen sitivityoftestistumourcelsisduetodeficiencyininter strand croslinkrepairandlowercc1 XPFexpresion [J].MolCancer,2010,9(1):1-11. [13] KleinDD,BoonenRA,LongDT,etal.XPF ERCC1 actsinunhookingdnainterstrandcroslinksincoopera tionwithfancd2andfancp/slx4[j].molcel, 2014,54(3): [14] SanjeevaniA,AnbarasiK,KristinT,etal.Downregu lation ofxpf ERCC1 enhancescisplatin eficacyin cancercels[j].dnarepair,2010,9(7): [15] NiedernhoferLJ,OdijkH,BudzowskaM,etal.The structure specificendonucleaseercc1 XPFisrequired toresolvedna interstrandcros link induceddouble strandbreaks[j].molcelbiol,2004,24(13): [16] McCabeKM,HemphilA,AkkariY,etal.ERCC1is requiredforfancd2focusformation[j].molgenet Metab,2008,95(12): [17] YongQ,MitsuyoshiY,KoujiH,etal.Theepistatic relationshipbetweenbrca2andtheotherrad51medi atorsinhomologousrecombination[j].plosgenetics, 2011,7(7): [18] ZhangF,FanQ,RenK,etal.PALB2functionaly connectsthebreastcancersusceptibilityproteinsbrca1 andbrca2[j].molcancerresmcr,2009,7(7): [19] JenkinsC,KanJ,HoatlinME.TargetingtheFanconi anemiapathwaytoidentifytailoredanticancertherapeu tics[j].anemia,2012,2012(12):1-7. [20] KotemannMC,SmogorzewskaA.Fanconianemiaand therepairofwatsonandcrickdnacroslinks[j].na ture,2013,493(7432): [21] ClausonC,SeharerOD,NiedernhoferL.Advancesin understandingthecomplexmechanismsofdna inter strandcros linkrepair[j].coldspringharbperspect Biol,2013,5(10): ( 下转第 52 页 )

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第 1 期 程成国, 等.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 41 ERCC1 sirnaorbrca2 sirnasuppresedcelproliferationandpromotedcelapoptosisproducedbycis platin.co t

第 1 期程成国, 等.ERCC1 和 BRCA2 基因共沉默有效逆转耐药肺癌细胞对顺铂的耐药性 41 ERCC1 sirnaorbrca2 sirnasuppresedcelproliferationandpromotedcelapoptosisproducedbycis platin.co t