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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'&! 中医药研究 姜黄素对 细胞增殖和凋亡的影响及其与白消安的协同效应 翁光样 杜 萌 胡亮杉 郭坤元 南方医科大学珠江医院血液内科 广东广州 南方医科大学珠江医院重症医学科 广东广州 广东省第二人民医院检验科 广东广州 摘要 目的 探讨姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞增殖和凋亡的影响以及姜黄素联合白消安对 #$ % #$& ' 细胞的协同效应 方法 流式细胞术检测细胞 #$#$& 表面抗原的表达情况 姜黄素诱导 #$ % #$& ' 细胞的凋亡情况及其对 #$ % #$& ' 细胞周期的影响 法检测姜黄素对 #$ % #$& ' 的增殖抑制作用及其与白消安联合作用的效应 甲基纤维素克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 倒置光学显微镜观察细胞凋亡形态 "(") *+ 检测,*- 蛋白表达水平 结果 细胞株中 #$ % #$& ' 细胞占.& /0 姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞具有增殖抑制作用 呈时间 - 剂量依赖性 并能降低 #$ % #$& ' 细胞的克隆形成能力 姜黄素与白消安相互作用系数 #$1#$ % #$& ' 细胞被姜黄素阻滞于 期 期细胞明显减少 并能诱导 #$ % #$& ' 细胞凋亡 凋亡细胞体积变大 细胞结构不清 胞膜边缘粗糙 姜黄素能下调 #$ % #$& ' 细胞,*- 蛋白表达水平 结论 姜黄素通过降低细胞克隆形成能力 阻滞细胞于 期和诱导细胞凋亡 抑制 #$ % #$& ' 细胞的增殖 姜黄素与白消安具有协同作用,*- 蛋白表达水平下调可能促使姜黄素诱导 #$ % #$& ' 细胞凋亡 关键词 姜黄素 白血病干细胞 协同效应,*- 细胞凋亡中图分类号 文献标志码 文章编号 -&.--!"#$#%&'"'$"&$&"''""!&!"!'&!!'$& &()#!#' 2!3-3 $4 " ( 48!-! $")9"+:5"9+*+3;!735+(7*+:+!") "7*4 7")(7!3+!1"(7"#)"4 7;!735+(7*+:+!") "7*4 7")(7!3+!#*77*6+)+)!3+ 32+)+77*"+*"(5+(7*!3+!#7 *+,-.*-###" % & ' ()#"##*+ % & ' ()#&, "&#()#"######" % & ' ()# *"#"+ * # &! *"-##+ # "##*+ % & ' ()&*"+ ##. &!####*+"*" ###&,/#.*"#"+ 0+& # % & ' ()*.&&/&1 ()#&##"+."".""""##.+ % & ' ()&## "#+*##"+*& % & ' ()#*" ))+ "#$#&!*##"#" % & ' ()#& ##+#+*###""#+& 收稿日期.&.. 修回日期.. 通讯作者 郭坤元 教授 博士生导师 &.-,&# 作者简介 翁光样.&. 男 汉族 医师 硕士在读 主要从事急慢性白血病化疗增敏 免疫增敏的研究 &.&&# 网络出版时间.. 网络出版地址 ***&#&#"&..&&&&&!"!

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷,/#.*"*."+ ##& #+" % & ' ()#+ "##.+ #)) ""#&/" *##+*##"+ % & ' ()#&"*.",/#. +#"*##."#" % & ' ()#& / 0., ## ()#$##/#. 白血病干细胞 *"!"97("9"*(6#( 是白血病发病和缓解后复发的重要原因 采取靶向根除 6#( 并且保护正常造血干细胞的白血病治疗策略具 有重要意义 然而 6#( 通常能够抵抗放化疗 常规化疗无法根治白血病 最终导致白血病复发 姜黄为姜科草本植物姜黄的干燥根茎 其味辛 苦 性温 入肝脾二经 是一种常用的中药 而姜黄素是姜 黄发挥药理作用的最重要化学成分 大量研究证明 姜黄素具有抗氧化 抗肿瘤 抗炎 清除自由基等 多方面药理作用 另外 姜黄素在各种实体瘤和白血病中具有化疗增敏和放疗增敏的作用 并在放化疗 过程中保护正常体细胞 其机制可能是干预细胞的多个信号通路 包括细胞周期 凋亡 增殖 生存 侵 袭 转移和血管形成等 白消安目前用于造血干细胞移植的预处理方案 降低白消安使用剂量和增加 6#( 对白消安的敏感性可以减少药物的毒副作用及降低白血病的复发概率 本实验探讨姜黄素对白血病干祖细胞 #$ % #$& ' 细胞增殖和凋亡的影响 并以姜黄素作为化疗增敏剂来探讨其与白消安的协同作用 为临床预防白血病复发及减少白消安的使用剂量提供新策略和理论依据 材料与方法 材料 细胞株由中国医学科学院血液学研究所惠赠 佘妙容等磁珠分选获得 #$ % #$& ' 细胞 南方医科大学珠江医院血液科实验室传代 姜黄素 白消安 甲基纤维素 739 公司 四甲基偶氮唑盐,18 公司 1 培养基 5*+" 公司 胎牛血清 四季青公司 瑞氏吉姆沙染液 "7<-=1#1 细胞凋亡检测试剂盒 南京凯基生物科技发展有限公司 细胞周期检测试剂 江苏碧云天生物技术研究所 小鼠抗人 #$-#$- &- 单克隆抗体,7+*"3" 公司,*- 抗体 - $5 抗体 5- 二抗 #)!,7+"+*+3 1 细胞培养 #$ % #$& ' 细胞用含 966 胎牛血清的 1 培养基 置于 > 966#8 饱和湿度培养箱中培养 每 传代 流式细胞术检测 细胞株 抗 原的表达 用 96 管收集约? 个对数生长期 #$ % #$& ' 细胞 以 )97 离心 97 去上清后用, 洗涤 重复上述操作 次 用 96, 重悬细胞 向上述 管中分别加入小鼠抗人单克隆抗体 #$-#$&-=1# 各 6 于室温避光孵育 97 然后用, 洗涤 次 以 =1# 荧光抗体为同型对照 上流式分析仪检测 实验重复检测 次 -- 法检测姜黄素对 细胞增殖的抑制作用 于. 孔板接种细胞 个 孔 设空白组 不加细胞 对照组 不加药物 和姜黄素组 每组设 个复孔 姜黄素组分别为 &9+*6 分别于 &. 加入 6 继续孵育 后 )97 离心 97 去上清后加入 6$8 溶解结晶 震荡溶解均匀后于波长. 9 酶标仪测吸光度 值 细胞存活率计算公式 药物孔 值 ' 空白孔 值 对照孔 值 ' 空白孔 值?0 姜黄素与白消安协同效应的 -- 检测 # ## 组分别为姜黄素组 &9+*6,,, 组分别为白消安组 &&396 联合组为 #%,#%,#%,#%,#%,# %,#%,#%,#%, 对照组用生理盐水代替药物 每组设 个复孔 法于 & 后检测并计算细胞存活率 计算药物相互作用指数 +":7-7"+:)!37")7+ #$1@,?,, 代表联合用药的细胞存活率 和, 分别代表单药的细胞存活率 #$1 说明两种药具有协同作用 #$1 说明两种药具有显著协同作用 甲基纤维素克隆形成实验 于 孔板接种细胞 个 孔 设盐水对照组和 ### 组 每组设 个复孔 体系总体积 66 细胞悬液 % 636 甲基纤维素 %6 含 966 胎牛血清 1 培养基 培养 后于倒置显微镜下观察并拍照 计算克隆集落数 细胞凋亡形态观察 分组同 将 96 密度为? 96 的对数生长期细胞接种于 孔板中 姜黄素作用 后 直接于倒置光学显微镜下观!"!

3 期 翁光样 杜 萌 胡亮杉 等 姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞增殖和凋亡的影响及其与白消安的协同效应 察细胞形态并拍照 流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化 于 孔板中接种对数生长期细胞约? 个 分组同 后离心收集全部细胞 用 96, 重悬 取出 96 细胞悬液 用, 洗涤 综上所述 说明姜黄素对 #$ % #$& ' 有增殖抑制作用 结合图 分析 姜黄素对 #$ % #$& ' 增殖抑制作用具有一定时间和剂量依赖性 966 冰乙酸重悬细胞 '> 固定过夜, 洗涤 次 去上清加入 6 $2 染液 含碘化丙啶 9362 酶? 46> 避光染色 97 然后, 洗涤 次 上流式细胞仪检测细胞周期 另取 96 细胞用, 洗涤 次后去上清 加入 6 结合缓冲液重悬细胞 分别加入 - "7 <-=1# 和 1 各 6 室温避光孵育 97 后上流式细胞仪检测细胞凋亡 实验重复检测 次 0!$')" 检测 +21 蛋白表达 分组同 细胞培养 后收集细胞总蛋白 用考马斯亮蓝法 测定蛋白浓度 取等量蛋白质溶液进行 $- 电泳后转印到硝酸纤维膜 封闭后加入,*- 单抗 396 轻摇孵育, 洗涤 次 结合 5- 二抗 396 室温轻摇 后 曝光 显影和拍照 3 统计学处理 实验计量资料以 / 表示 数据均符合正态性 采用 统计软件进行分析 两独立样本均数比较采用 检验 细胞增殖抑制作用采用双因素方差分析 克隆形成实验 细胞周期分布结果以及细胞凋亡率比较采用单因素方差分析 方差分析前使用 6""" 检验方差齐性 若方差齐 使用 6$- 检验 若方差不齐 则使用 $! " 检验进行统计 为差异有统计学意义 1 结 果 1 细胞 表面抗原的表达情况 实验重复测量 次 计算 #$ % #$& ' 的比例为.&/0 图 确认该 细胞株处于白血病干祖细胞发育阶段 可作为髓系白血病干细胞模型 11 姜黄素对 细胞的增殖抑制作用 各姜黄素组对 #$ % #$& ' 细胞的增 图 细胞表面 表达 =73)"((7+(+:#$#$&"*(7 "*( 图 1 姜黄素对 细胞的量效曲线图 =73 $+("-":"!)"(+:!)!97 7 #$ % #$& ' "*( /@ 与对照组比较 1 姜黄素诱导 细胞凋亡的形态学改变 姜黄素作用 #$ % #$& ' 后在倒置光学显微镜下观察细胞凋亡形态 如图 所示 正常细胞的细胞壁光滑完整 胞质透亮 体积小 而凋亡细胞体积变大 细胞壁边缘不齐 细胞呈碎裂状态 表 因为 6""" 检验不满足方差齐性 故各组两两比较使用 $! " 检验进行统计 与对照组比较 除了 图 组外 其他各组细胞存活率均比对照组低 图 各时间点的比较可见 & 组比. 而 组与. 组差异无统计学意义 图 凋亡的 细胞形态 =73"9+)+*+3+:++7#$ % #$& ' "*(? 对照组细胞,&9+*6 姜黄素组 箭头所指为凋亡细胞!"!

4 & 西安交通大学学报 医学版 第 卷 1 姜黄素与白消安的协同效应 根据表 中的 #$1+":77"+:)!37")7+ 结果发现 除 # %, 组和 #%, 组外 其他各组药物联合均有协同效应 当姜黄素浓度达到 #9+*6 时 联合用药均有协同作用 另外 #%, 组协同效应最强 #$1@ 表 而且 # 和, 联合用药的细胞存活率要比单药低 表 综上所述 姜黄素与白消安联合作用 #$ % #$& ' 细胞具有一定的协同效应 表 药物作用 ( 后的药物相互作用系数 #+":77"+:)!37")7+ +:#$ % #$& ' &:"))!3977()7+ 0/@ 药物组 细胞存活率 #4,4 #4%,4 #$1 #%,./.&&/ &./.& #%,./.&/ &/. #%,./ &&/ &/. #%, &/.&&/ &./ #%, &/.&/./. #%, &/ &&/ /.. #%,./.&&/ /. #%,./.&/ / && #%,./ &&/ / & #$1 药物相互作用指数 #$1@#,#?,#$1@ 代表相加效应 #$1 代表拮抗效应 #$1 代表有协同作用 #$1 代表 & 显著协同作用 #4 姜黄素,4 白消安 #, 与其联合用药比较 1 姜黄素抑制 细胞克隆形成能力 经 6""" 故使用 6$- 检验进行两两比较 与对照组比较 除 # 图 图 说明姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞的克隆形成能力具有抑制作用 并且与姜黄素的浓度相关 低浓度时抑制作用不明显 随着姜黄素浓度增加 #$ % #$& ' 细胞克隆形成能力受到抑制 另外 # 比 # 图 然而 # 与 # 及 # 与 # 的克隆集落数差异无统计学意义 综上所述 姜黄素达到一定浓度时 对 #$ % #$& ' 细胞克隆形成能力具有抑制作用 #$ % #$& ' 的克隆集落镜下形态如图 的,# 所示 1 姜黄素阻滞 细胞于 3 表 图 姜黄素对 细胞克隆能力的影响 =73 :"( +:!)!97 + +*+ 7*7 +: #$ % #$& ' "*( ### 分别为姜黄素 &9+*6 组 姜黄素各浓度组对细胞作用 后 接种于甲基纤维素克隆体系培养 比较各组克隆集落数,# 克隆集落镜下形态?, 对照组 ## 组 对照组克隆集落密度明显高于 # 组 各细胞周期分别采用 6""" 表 故各姜黄素组间两两比较采用 6$- 检验 结果显示 期的细胞比例各姜黄素组均比对照组高 表 期的细胞比例各姜黄素组均比对照组低 表 期的细胞比例 # 表 其他两组与对照组差异有统计学意义 表 综上所述 姜黄素阻滞 #$ % #$& ' 细胞于 期 而 期的细胞显著减少 这也可能是姜黄素抑制 #$ % #$& ' 细胞增殖的机制之一 细胞周期改变同样可从图 直观分析 其他 组的 期细胞比例明显较对照组少 表 1 细胞周期分布比例 $7()7!7+ +:"**" 细胞周期分组 对照 / /./ # / / / # / / /& #./ &/ &/ &. 各细胞周期分别进行单因素方差分析 两两比较采用 6$- 检验 各姜黄素组分别与对照组比较 外 其他!"!

5 期 翁光样 杜 萌 胡亮杉 等 姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞增殖和凋亡的影响及其与白消安的协同效应. 图 姜黄素对 细胞周期的影响 =73:"(+:!)!97 + "**"+:#$ % #$& ' 实验重复测量 次 计算 / 1 流式细胞术测细胞凋亡情况 9+*6 组姜黄素不能增加 #$ % #$& ' 细胞的凋亡 图, 但是 &9+*6 组 9+*6 组的细胞凋亡率均比对照组细胞凋亡率高 图, 这说明姜黄素浓度到一定程度可以诱导 #$ % #$& ' 细胞凋亡 而且姜黄素浓度越高细胞凋亡率越高 图, 图 姜黄素对 细胞凋亡的影响 =73:"(+:!)! (7(+:#$ % #$& ' "*( 姜黄素组作用细胞 后 流式细胞术检测细胞凋亡率 /@, 凋亡率的比较 与对照组比较 两两比较 1 姜黄素降低 细胞的 +21 蛋白表达水平 姜黄素能够降低 #$ % #$& ' 的,*- 蛋白表达水平 并且具有一定的浓度依赖性 在 #9+*6 组,*- 蛋白表达水平最低 图 图 细胞的 +21 蛋白表达 =73")+"7-")"((7+ +:,*-7 #$ % #$& ' ### 分别为姜黄素 &9+*6 组 9+*6 姜黄素作用 #$ % #$& ' 后的 "(") *+ 检测结果 讨 论目前临床上治疗白血病的主要手段是化疗和造血干细胞移植 两者最终都面临白血病复发 耐药以及药物毒副作用过大等问题 迫切需要找到解决这些问题的办法 采用低毒或者无毒的多酚类化合物作为治疗药物和化疗增敏剂是一个有潜力的新途径 姜黄素能够帮助肿瘤细胞重拾 被遗忘 的凋亡 在各个水平调节药物靶点 抑制肿瘤细胞逃避死亡的通路 最重要的是对肿瘤干细胞 ##( 同样有一定作. 用 因此 本研究采用姜黄素作为潜在的药物来研究其对白血病干祖细胞 #$ % #$& ' 细胞的增殖和凋亡的影响 并且初步探讨姜黄素与白消安联!"!

6 西安交通大学学报 医学版 第 卷 合用药的效果 值得指出的是 本株 #$ % #$& ' 干性 明显 其中 #$ % #$& ' 占.& /0 而且实验证实该株细胞具有自我更新潜能 并具有化疗和免疫治疗抵抗性 其可以作为白血病干细胞的模型 这也是本实验的核心之一 探索姜黄素对于白血病干细胞的影响更能体现临床应用的价值和可行性 使用不同浓度姜黄素处理 #$ % #$& ' 细胞 并用 法和甲基纤维素克隆形成实验检测发现 该株细胞对姜黄素较敏感 并且具有剂量依赖性 这对进一步动物实验和临床研究中姜黄素使用剂量有指导意义 目前报道较多的是姜黄素在实体 瘤中的研究 62 等对 株食管癌细胞株研究发现 姜黄素对肿瘤细胞和肿瘤干细胞均有抑制作用 且具有剂量依赖性 并且能降低 干性标志物 6$5 和 #$ 分子 本实验未能就 干性水平 研究姜黄素对 #$ % #$& ' 细胞的影响 略显不足 姜黄素与白消安联合用药具有协同效应 这对于临床应用非常有价值 既可以降低白消安剂量 减少毒副作用 又能增强白血病干细胞对白消安敏感性 降低白血病复发率 本实验只是初步探讨 方法和指标偏单一 需要再进一步补充研究 通过细胞凋亡和细胞周期分布的检测发现 姜黄素对 #$ % #$& ' 具有诱导凋亡和阻滞细胞于 期的作用 这也能一定程度上解释姜黄素对其增殖抑制效应 目前认为 线粒体凋亡途径是药物诱导肿瘤细胞凋亡的重要途径 其中,*- 蛋白家族又是该途径中非常重要的分子 通过下调,*- 基因表达和上调,,7 等基因表达能够诱导肿瘤细胞凋亡 本研究发现 姜黄素能下调,*- 蛋白表 达 刘波等在多发性骨髓瘤细胞株中已经发现姜黄素能下调,*- 92 表达 但是 58< 等在 6 细胞系中发现 姜黄素并不能下调,*- 表达 反而下调, 的表达 这与本研究结果不一致 原因可能与细胞株不同 作用浓度不同 作用时间差异等因素有关 本研究发现姜黄素对细胞周期作用明显 应该是姜黄素抑制 #$ % #$& ' 增殖的重要机制之一 有文献报道 在其他肿瘤细胞株中 姜黄素阻滞细胞于 期和 期 本实验结果发现阻滞细胞于 期 这可能与 #$ % #$& ' 本身处于干祖细胞水平有关 也可能与姜黄素下调 #*7$#*7 相关 本研究较好证实姜黄素对白血病干祖细胞的增殖抑制作用 下一步将继续研究姜黄素针对白血病干祖细胞的各种分子机制 比如内外源凋亡途径的相关分子机制 并进行动物体内实验和相关临床研究 参考文献 /2'' 3(&4# ". -"# # #&'!"...& $3$3$'2!/43!&$ *. "&/"&.& /$$42&#&3#.&.& 赵鹏 蔡辉 & 姜黄素药理作用研究进展 & 中医药临床杂志 &.&& 郑玉强 邓立普 & 姜黄素药理作用研究进展 & 辽宁中医药大学学报.& )2))0//&#"# 3" #- " "- "##""#. &'#...& ''5$'! 4'3$&#" ##"."*."&# &.& & 杜正彩 邓家刚 李好文 & 芒果苷与顺铂联用对肝癌细胞 4) 增殖及 5( 活性的影响 & 广西中医药..&.$4$43(6 /4466 5& + "*##-".& ##.&& $4!'3 4' &##. #!#()#."" #,# &#&..&!'')$7!!$/3&###..### #&/!!".& 刘波 白庆咸 陈协群 等 & 姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞表达 $/#./, 的影响 & 中国实验血液学杂志.& 5$(42% $(4'3'!$73'$(3)5&. ##+### ###""+". # "#&'# &.&& 编辑 国 荣!"!

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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