北京大学学报 医学版 : 943 ;"+ 79< < # # : #$ 巨噬细胞加帽蛋白 7 是一种重要的肌动蛋白结合蛋白 可重组肌动蛋白丝 与细胞运动密切相关 7 在肌动蛋白为基础非肌肉细胞的运动控制过程中起重要作用 肿瘤细胞中上述细胞功能往往失去正常的调控 因此 肌动蛋白及

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1 北京大学学报 医学版 : 943 ;"+ 79< < # # : #$ 巨噬细胞加帽蛋白与胃癌细胞增殖及迁移能力的关系 高 翔 陈香梅 $ 张 婷 $ 张 静 陈 茉 郭正阳 $ 石岩岩 鲁凤民 $ 丁士刚 # 北京大学第三医院消化科 北京 $# 北京大学基础医学院病原生物学系 北京 论著 摘 要 目的 探讨巨噬细胞加帽蛋白 7 对胃癌细胞系迁移和增殖能力的影响 方法 采用 " 4 方法检测了 种胃癌细胞 7 7 $ "? $? 中 7 基因的表达情况 选择低表达并且易转染的 7 细胞作为研究对象 设计针对 7 的特异性引物并合成重组质粒 构建可以表达 7 的慢病毒包装系统 通过侵染人胃癌细胞系 7 建立可稳定表达 7 的细胞株 通过 实验分析过表达 7 基因对 7 细胞的生长和增殖能力的影响 细胞划痕以及 小室实验分析过表达 7 基因对 7 细胞迁移能力的影响 结果 过表达 7 后 7 细胞的生长速度略低于对照组 但二者间差异无统计学意义 B$# $ B# 划痕试验显示 7 实验组划痕间距相对于对照组明显缩小 两组平均缩小距离分别为 # 和 # 差异有统计学意义 B # B# 试验显示 7 实验组和对照组穿膜细胞数目分别为 个和 个 7 实验组显著多于对照组 差异有统计学意义 B ## 结论 过表达 基因对胃癌细胞系 7 细胞的生长和增殖无显著影响 过表达 基因能促进胃癌细胞系 7 细胞的迁移 关键词 巨噬细胞加帽蛋白 胃肿瘤 细胞系 肿瘤 细胞增殖 细胞运动 中图分类号 4 #$ 文献标志码 文章编号 $ # 5# # #$ # # $ > 7 $ > 7: +? 79 > $ 6 39 ; $ 87 #8 7 "1 9 5 $#8? L" "1 9? 5 $#$"# 7 # 4 " # 7 # #. 7 7 #. 7 7 #. 7 7 B$# $ B# # # # B # B# # 7. 7;" 7. B # ##". 7 7 #. 7 7 #? 基金项目 国家自然科学基金 $ 资助 ; $ $$$ # 网络出版时间 $ $$$ 网络出版地址 # 1# 1 # #4#$ #$$#$#

2 北京大学学报 医学版 : 943 ;"+ 79< < # # : #$ 巨噬细胞加帽蛋白 7 是一种重要的肌动蛋白结合蛋白 可重组肌动蛋白丝 与细胞运动密切相关 7 在肌动蛋白为基础非肌肉细胞的运动控制过程中起重要作用 肿瘤细胞中上述细胞功能往往失去正常的调控 因此 肌动蛋白及肌动蛋白结合蛋白被认为是一种潜在的促进肿瘤形成因素和抗肿瘤药物的靶点之一 本研究以胃癌细胞系为研究对象 应用 7 表达质粒转染技术 进行 7 表达干预 研究 7 对胃癌细胞系迁移能力的影响 旨在初步探讨 7 在体外对胃癌淋巴结转移的作用 + 材料与方法 +#+ 材料人胃癌细胞株 7 7 $? 和 "? $ 由北京大学基础医学院病原生物学系实验室提供 胎牛血清 ; 购自美国 7 公司 4"? 培养基购自美国 公司 7 " 4$ -?. 购自北京全式金生物技术有限公司 快速 " 4 扩增的热启动高保真 8 聚合酶试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司 琼脂糖粉购自美国 公司 3. $ 购自美国 公司 +#- 胃癌细胞系的培养胃癌细胞系 7 7 $ "? $? 分别培养于含 体积分数 灭活 ; 的 4"? 培养液中 在 A 体积分数 $ 条件下培养 每 天换一次液 当细胞达到 融合度时用消化液 #$ 胰酶和 # +8 均为体积分数 消化 按 传代 +#. 胃癌细胞系筛选用实时 " 4 " 4 4 " 4 选择 7 表达低的细胞 分别培养上述步骤中的胃癌细胞系 7 7 $ "? $? 用 法提取细胞系总 4 用 4 第 链 8 合成试剂盒合成 8 并以此为模板进行 4 " 4 检测 种胃癌细胞系的 表达水平 引物和内参基因甘油醛 磷酸脱氢酶 1 的引物序列参照文献 引物序列为 ; 内参基因 1 的引物序列为 ; 均由上海生工 公司合成 4 " 4 用 $ 3 的体系 " 4??. $# 3 上 下游引物各 焦碳酸二乙酯 8+" 水补至 $ 3 反应参数 A 预变性 A 变性 A 退火 $ A 延伸 个循环 熔解曲线 A A 持续 每摄氏度取 个点 A 降温 得出各个胃癌细胞系 的相对表达量 比较 7 7 $ "? $? 胃癌细胞系 7 的表达水平 所有实验重复 次 +# 7 胃癌稳转细胞系的构建 +##+ 3+? 7;" 增强绿色荧光蛋白 7 表达质粒的构建 设计可扩增 全长编码序列的特异性引物 以 3 细胞的 8 为模板 利用高保真酶 " 4 进行 " 4 扩增 得到 7 编码序列加上 ; 标签的目的片段 将 " 4 产物进行纯化回收 将其连接至 3+? 7;" 载体 对 3+? 7;" 7 表达质粒进行测序 将 3+? 7;" 7 表达质粒瞬时转染 3 细胞 实验验证 +##- 3+? 7 病毒上清制备 将对数生长期的 $ 细胞接种至 培养皿 密度为 左右 $ 后培养皿内更换为不含抗生素的 8?+? 培养基 用 $ 转染质粒 3+? 7C # C< <7 水疱性口炎病毒 7 质量比为 # # # 对照组用 3+7;" 质粒 后更换新鲜的完全培养基 后取上清 离心 用 # 3 滤膜过滤 分装 冻存于 = A 备用 同时用 实验验证 7 表达情况 +##. 7 慢病毒表达胃癌细胞系的构建 将 7 细胞铺于六孔板内 细胞密度为 左右 $ 后加入含有 3 聚凝胺 的 7 病毒上清 $ 3 后更换完全培养基 $ 后加入筛选药物嘌呤霉素 持续筛选 后 荧光显微镜下观察荧光细胞所占比例 实验验证表达情况 +# 细胞计数试剂盒 1 检测细胞增殖收集对数期生长的 7 过表达胃癌细胞系 7 及对照细胞 以每孔 - $ 3 接种在 孔板中 每组细胞设置 个复孔 共铺 板 每板细胞周边加一圈磷酸盐缓冲液 " 或培养基 在 $ A 培养温箱内培养 每隔 $ 检测 次

3 高 翔 等 巨噬细胞加帽蛋白与胃癌细胞增殖及迁移能力的关系 +#1 细胞划痕实验在 孔板每孔的底面用记号笔对称画 条线 间隔 左右 培养生长状态良好的 7 稳定转染细胞系 接种至预先画好标记线的 孔板内 每孔接种约 $ - 个细胞 过夜培养细胞贴壁后汇合率达 以上 第 $ 天用无菌 3 枪头在每孔中央划一条直线 枪头要垂直 用力需均匀 随后 用 " 轻柔操作 清洗细胞表面 去掉脱落的细胞及细胞碎片 孔内更换为无血清培养基 放入培养箱内 $ 后在倒置显微镜下观察细胞划痕情况并拍照 然后放入细胞培养箱内继续培养 在随后的 $ $ 和 时间点分别拍照记录 拍照前若有悬浮死细胞 则用 " 清洗换液后再进行拍照 最后用 : 软件测量细胞划痕间的宽度 定量比较细胞迁移的速度 +# 小室实验实验前 $ 将处于对数生长期的实验组及对照组细胞的培养基更换为无血清培养基 +# #+ 小室制备 在 $ 孔板内加入 3 含 体积分数 血清的完全培养基 将小室轻轻放入 $ 孔板内 使小室下层浸润于液面下 避免液面与小室下层之间产生气泡 +# #- 细胞准备 胰酶消化细胞 " 洗两遍 计数 取 # - 个细胞 $ 离心 弃上清 加入 3 不含血清的培养基重悬细胞 然后移入 小室内轻轻混匀 +# #. 固定 染色 培养 后用棉签擦去小室上部未穿膜的细胞 在 $ 孔板内加入 3 体积分数 多聚甲醛室温固定 " 洗 $ 次 然后加入 # 体积分数 结晶紫染液室温染色 " 洗 $ 次 +# # 镜下观察 在倒置显微镜下观察并拍照 计算穿过小室膜的细胞数 +# 统计学分析本研究所有的统计学分析均采用 # 软件实现 实验和 实验均采用配对 检验 # 为差异有统计学意义 图 + 胃癌细胞系中 基因的表达检测 +8. -#- 7 慢病毒表达系统的构建本实验目的片段 编码序列加上 ; 标签的理论值为 而 " 4 扩增产物经电泳后可见约 的条带 个条带均为加上 ; 标签后的目的片段 7 图 $ 与理论值相符合 质粒经酶切 连接 转化后得到白色单克隆菌 图 $ 测序结果证实 3+? 7;" 7 表达质粒序列正确 将 3+? 7;" 7 表达质粒瞬时转染 3 细胞 实验证实 3+? 7;" 7 表达质粒可以成功表达带有 ; 标签的 7 蛋白 图 $ - 结果 -#+4 " 4 检测胃癌细胞系中 7 的表达 4 " 4 检测结果如图 所示 7 基因在 种胃癌细胞系中均有表达 其中在 7 $ 细胞中表达水平最高 在 7 表达水平最低 因此 在后续实验中选择 7 细胞作为过表达 7 基因功能研究的细胞株 7 7. # 7 7;" # 图 - 3+? 7;" 7 表达质粒的构建 - 3+? +7;" 7. 用含有 3+? 7 的病毒上清侵染 $

4 $ 北京大学学报 医学版 : 943 ;"+ 79< < # # : #$ 细胞后 经 实验验证 $ 细胞中瞬时表达 7 的情况 结果如图 所示 7 慢病毒表达系统构建成功 病毒侵染 $ 细胞后可在 $ 细胞中成功表达 7 蛋白 为构建稳定表达外源 7 的胃癌细胞系 用 7 病毒液侵染 7 细胞 $ 后加入筛选药物嘌呤霉素 持续筛选 后 在荧光显微镜下观察 7;" 病毒液的侵染效果 荧光细胞所占比例约为 图 侵染效果良好 实验检测细胞表达外源 7 的情况 用外源 7 蛋白的标签抗体能够在 7 细胞中清楚检测到外源 7 蛋白结果 图 可证实过表达外源 7 的稳定转移胃癌细胞系构建成功 -#. 7 对胃癌细胞系 7 增殖的影响采用 实验检测稳定表达外源 7 的 7 细胞与对照细胞间的细胞增殖速度差异 并绘制生长曲线 结果显示 过表达 7 后 7 细胞的生长速度略低于对照组 B# 但二者之间差异无统计学意义 提示过表达 7 并不影响 7 细胞的生长和增殖 图 -# 过表达 7 对胃癌细胞系 7 迁移能力的影响采用细胞划痕实验和 小室实验检测稳定表达 7 的 7 细胞的迁移能力 划痕 $ 后 对实验组和对照组细胞的迁移距离进行统计 表 过表达 7 的 7 细胞的划痕间距明显小于对照组细胞 B# 图 提示 7 过表达可明显促进细胞的迁移速度 进一步通过 小室实验比较过表达 7 组与对照组细胞的穿膜细胞数目 并对实验组和对照组细胞的穿膜数目进行统计分析 表 $ 结果表明 过表达 7 实验组穿膜细胞数目显著多于对照组 B# 图 过表达 7 能显著促进胃癌细胞系 7 的迁移能力 表 + 划痕实验的细胞迁移距离 # + 7 $? 7 #$ $# $# # $ #$ # #$ # 8 # # $ #$ # 7;" #$ # $# #$ $ $#$ #$$ # $ # 8 #$ $# # # ; $# 表 - 迁移实验的细胞穿膜数目 # - 7;" 7 $ $? ; $#. 讨论 近年来 细胞骨架蛋白在肿瘤转移中的关键性影响逐渐被人们所重视 细胞骨架重组是肿瘤细胞移动 进而发生肿瘤侵袭和转移的重要因素 本课题组前期研究曾应用蛋白质组学方法 比较伴或不伴淋巴结转移胃癌组织中蛋白表达的差异 结果发现 7 在伴淋巴结转移组的胃癌组织中表达高于不伴有淋巴结转移的胃癌组织 并已通过 4 " 4 和免疫组织化学研究证实了该结果的可靠性 研究还发现脱离原位癌灶的肿瘤细胞 7 免疫组织化学染色强度更强 说明与非侵袭性肿瘤细胞相比 侵袭性肿瘤细胞高表达 7 因此 推测 7 有可能促进胃癌细胞转移 最近日本学者应用蛋白质组学技术 同样发现 7 在胃癌淋巴结转移组织中高表达 认为 7 可能与胃癌淋巴结转移有关 $ 但机制不详 7 最初发现于人肺泡巨噬细胞 由 个氨基酸构成 是一种重要的肌动蛋白结合蛋白 其作为 $ C 依赖性肌动蛋白结合蛋白 通过对微丝加帽 切割而调控肌动蛋白的长度 在特定的条件下将纤丝组装成致密的网络 促进肌动蛋白交联 导致细胞骨架重组 7 分布在细胞质和细胞核 呈棕黄色颗粒 具有 个凝溶胶蛋白样同源性结构域 在正常组织特别是巨噬细胞广泛表达 7 是一种肌动蛋白结合蛋白 由 个氨基 酸组成 1 等研究发现 7 是受体介导的巨噬细胞胞膜运动所必需的 推测 7 可能是机体调节巨噬细胞介导的炎症反应的一个有用的靶标 已有研究发现 成纤维细胞和内皮细胞中 7 过表达均可导致细胞的运动性增强 4 等研究发现 7 通过维持细胞形态 调节细胞迁移 黏附和生长来参与多种肿瘤细胞的迁移和侵袭 7 过表达可提高成纤维细胞的运动能力 同时也可调节内皮细胞的运动 本研究发现 7 能够促进肿瘤细胞的迁移 但不影响肿瘤细胞的增殖能力 这一观察结果与 等的 7 不影响肝癌细胞增殖但促进肝

5 =$O 高翔"等巨噬细胞加帽蛋白与胃癌细胞增殖及迁移能力的关系 癌细胞侵袭的研究结果一致$ ;.U的表达已在多 种恶性肿瘤中报道 J a""+ 除了分子水平上的表征和临床材料的观察外" ";.U在胰腺癌乳腺癌和 在转移过程中 ;.U的主要性能仍有待阐明$ ;.U 前列腺 癌 中 均 被 发 现 与 肿 瘤 细 胞 迁 移 和 侵 袭 相 关 $""6+ "与 本 研 究 结 果 一 致$ Q -等 "O+ 在上述多种恶性肿瘤中异常表达"与肿瘤的恶性特 报 道 称" 征相关"因此";.U可能在肿瘤进展中起基础性作 ;.U被缺氧诱导因子H " 所诱导"表明 ;.U在缺氧.U的表达差异如何影响肿瘤细胞的 用"但关于 ; 条件下具有促进肿瘤细胞存活的作用$ 表型还有待进一步研究$ 1BB BB 图 HDk + B 验证稳定表达 ;.U的 1U] 细胞 图 Dk + B 验证瞬时表达 ;.U的 6$O<细胞 L> HDk + B? > B. +;.U + 1U] L> Dk + B? ;.U + 6$O< 1BB 图 GD荧光显微镜下观察慢病毒的侵染效果 E"### 图 ID过表达 ;.U对 1U] 细胞增殖的影响O 次重复实验# L> GD<> B? + 9.\ E"### L> IDC. +;.U+. +.?. 9 + # 1U] O 1BB " > D" + _. 9 +O.?. 9 + # 5"P#5 ##" $ = UY45 图 JD过表达 ;.U对胃癌 1U] 细胞系迁移能力的影响 L> JDC. +;.U U]

6 北京大学学报 医学版 : 943 ;"+ 79< < # # : #$ 7 是一种细胞骨架蛋白 细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络结构 细胞骨架蛋白可能通过某种机制与细胞骨架相互作用 出现细胞骨架系统异常 恶性转化的细胞常表现为微管减少和解聚 细胞骨架异常可增强癌细胞的运动能力 研究表明 微丝束及其末端黏着斑的破坏以及肌动蛋白小体的出现与肿瘤细胞的浸润和转移特性有关 7 是凝溶胶蛋白 绒毛蛋白家族肌动蛋白调节蛋白 它通过在肌动蛋白丝的两端加帽来控制以肌动蛋白为基础的运动 此外 3 等和 等研究发现 核 7 蛋白通过核运输受体 ;$ 和 4 7 " 进入细胞核 可促进肿瘤侵袭转移 但核 7 如何通过下游靶基因影响细胞骨架 进而影响肿瘤细胞的迁移和侵袭 目前尚未见相关文献报道 本研究观察到 7 在各种胃癌细胞株中的表达水平不同 这些细胞系将会成为在胃癌中进行 7 研究的非常有价值的资源 7 的功能特性及其在具有转移潜能的肿瘤细胞中独特的表达还有待进一步研究 以便了解胃癌转移的分子背景 参考文献 ". 8 " # 7 : #: $ $ $ =$ # $ 1 #3 : #:" 4 $ $ = # : # : #: $ = # 陈水云 黄河 李黎 等 # 人外周血造血干细胞低温保存方法的实验研究 : # 浙江医学 $$ $ $ =$ # 4 : 3#? : # 8 $ = # 陈茉 丁士刚 刘琳娜 等 # 胃腺癌伴淋巴结转移的蛋白质组学分析 : # 中国微创外科杂志 $$ $ = # 5 8 #" : #:" $ $ = # 9 # 1. : #? $ # ;: " #". : #7 $ = # " 3 3 #; 1 : # : $ $ $ =$ #?: #" : #:" 4 $ = # $ < 8 < < #8 : # 3 $ $ = # 3 > 6 6 #". : #" $ = $# #+ 3 3". 1. : #:" $ $ = # :8?? # 1 1? : # $$ = # $ $ 收稿 本文编辑 赵 波

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