复旦学报 医学版 年 月 #!"$(" "!!!-!$ $,$"!!!# % %2"!! "- % $%%#% $$"$ ) &$2 #! % "$2"!!"$ "- $ % $!##$& %!"!! $! ""!" (% "! :!" %!$ %" $ % $! -$$!% $!"

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1 复旦学报 医学版 人源吲哚胺 54 双加氧酶 4 的表达与纯化 李娟娟 李 洋 杨 青 复旦大学生命科学学院生物化学系 上海 云南天然产物与生物制药协同创新中心 昆明 摘要 目的 构建人源吲哚胺 双加氧酶 % 2 #! % 原核表达载体 表达 纯化获得 % 蛋白 方法 采用基因工程手段获得 % 原核表达载体并转化表达菌株 筛选合适的重组质粒及异丙基 硫代半乳糖苷!"" $%#$! 浓度进行蛋白表达 通过亲和层析纯化重组 % 3( 法测定蛋白浓度并计算蛋白收率 (& 电泳检测 % 表达情况 通过软件分析得到蛋白纯度!$, $ 检测目的蛋白特异性 结果 重组质粒经电泳分析 双酶切 ( 测序鉴定表明构建成功 经筛选发现重组质粒 "& % 比 "& % 的 % 表达效果好 (& 电泳及!$, $ 均验证了在相对分子质量 处的特异性目的条带的存在 经测定及计算得出蛋白纯度为 4 蛋白浓度为 # 蛋白收率为 # 结论 成功构建重组质粒用于表达及纯化 % 蛋白浓度 纯度 收率及特异性均较高 关键词 吲哚胺 双加氧酶 人源 蛋白表达 蛋白纯化 中图分类号 文献标识码 (!! #$"!"#$!" %!" "! "54 & "! 4 # ( # " "!" "!%&$"!""" " "2& &$&!$ "" &"2&"" $!!$ $% 2 #! % "8 $ 2"!!$!$ 2"!!,$ "- % %!# #$## $%$,$% "8 $2"!!$!$!-,! " " " 2"!!!$! # % % "$,$ "!!"" $%#$! $$!! -!! %2"!!# (-$% $#"%!! - % "- $ 3( $%!! - "$$$! $ (&$"%!!!! - % 2"!! $$ $$$% "$! $ $% $!-$!$, $!! -!"- $ $$ & $"% $!!,!$ $! #!$! # - $%!!!-!$ $ - % 2"!! $! "& %!- $,, $,$"! $ 2"!!%$% "& %(!"- $# $!$" $ #%$ -,$!! "$!,!,$% (& $"%!!!$, $% "$$$ -%! 4 # 国家自然科学基金 高等学校博士学科点专项科研基金!"#$% & ##-

2 复旦学报 医学版 年 月 #!"$(" "!!!-!$ $,$"!!!# % %2"!! "- % $%%#% $$"$ ) &$2 #! % "$2"!!"$ "- $ % $!##$& %!"!! $! ""!" (% "! :!" %!$ %" $ % $! -$$!% $!" (% "! :5:: ::5 吲哚胺 双加氧酶 2 #! 是继吲哚胺 双加氧酶 2 #! 色氨酸双加氧酶 $ "$"%2 #! 之后 第 个被发现能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径 8 "$% 代谢的限速酶 可催化色氨酸分解产生 犬尿氨酸 喹啉酸等多种具有生 物活性的代谢产物 其中 主要存在于肝脏 中 受糖皮质激素及 色氨酸的诱导 尚未发现 其免疫调节活性 广泛分布于除肝脏以外的其他组织中 是细胞内的一种含亚铁血红素的单 体蛋白质 年首次在兔肠道细胞中被发现 作为 的类似蛋白 & 于 年首次被发现 研究表明 过度活化与抑郁症 阿尔茨 海默病 白内障 癌症等人类重大疾病密切相 关 在机制方面 可以通过介导 细胞 凋亡或 #! 形成从而引起肿瘤免疫逃逸 等研究发现 也可以抑制人类 淋巴细胞的增殖 由 所引起的对 细胞增殖的抑制作用可以由提高色氨酸浓度或加入其抑制剂 甲基色氨酸 $%$ "$"% 而逆转 与 明显不同的是 由 引起的 细胞增殖的抑制作用即使补充高浓度色氨酸或 也不能逆转 这一现象说明 在抑制 细胞增殖的反应中 与 可能存在不同的信号调节通路 并且二者发挥不同的免疫调节作用 $ 等研究发现在 基因敲除小鼠 体内 依赖 的 #! 产生量明显减少 表明 对于 介导的 细胞增殖的抑制或炎性反应是必要的 进一步说明 在免疫过程中十分重要 关于抑制 还是 具有更好的抗 肿瘤效果 等曾在黑色素瘤的研究中发现用 抑制 并与环磷酰胺联用可以显著减小肿瘤 比 抑制 引起的抑瘤效果更 好 不过之后未见类似的报道 以上研究表明 与 关系密切 两者可能共同作用参与肿瘤发生 肿瘤免疫耐受 炎性反应等重大疾病或生理活动 因此 有望成为 以外又一重要的药物发现靶标 在肿瘤的免疫耐受 基因表达 信号转导中的重要作用已被人们所认识 抑制剂因在 介导的具有色氨酸代谢病理学特征的疾病 包括癌症 艾滋病 阿尔茨海默病 抑郁症 白内障等 的治疗中具有潜能而成为研究热点 与被广泛研究的 相比 人们对 的生理生化 免疫等方面的功能了解甚少 究其原因主要是 的表达纯化 结构解析等方面的研究有限 尚未商品化 活性检测系统建立 抑制剂筛选及应用等工作尚未广泛开展 目前国内尚无人源 % % 蛋白在细菌中表达 纯化的相关报道 本研究首次采用基因工程手段构建 % 原核表达载体 通过比较目的蛋白表达情况 筛选出适用于人源 表达的重组质粒及合适的 诱导浓度 通过亲和层析纯化获得高浓度 高纯度 高收率 高特异性的 % 蛋白 为 大规模表达奠定基础 材料和方法 药品与试剂 人源 ( 上海吉玛制药技术有限公司 异丙基 硫代半乳糖苷!"" $%#$! 美国 # (% 公司 氨基乙酰丙酸盐酸盐 ( ( 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 限制性内切酶 日本 公司 ( 2( 聚合酶 日本 公司 重组酶 上海近岸科技有限公司 3 & 菌株 3$ 质粒载体菌种细胞基因保藏中心 凝血

3 李娟娟 等 人源吲哚胺 双加氧酶 的表达与纯化 酶 美国 # (% 公司 人源 一抗 美国 $3$% # 公司 标记二抗 & 显色液 3( 法蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司 仪器与设备 # 高速离心机 美国 %!% 公司 转膜仪 仪 美国 3 公司 洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 恒温摇床 江苏太仓实验设备厂 低温超高压连续流细胞破碎机 广州聚能纳米生物科技股份有限公司 垂直平板电泳仪 北京百晶生物技术有限公司 蛋白纯化镍柱 上海楚知生物科技有限公司 预装蛋白纯化柱 上海生工生物工程有限公司 蛋白超滤管 美国 " 公司 "% 2 脱盐柱 美国 & 公司 型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 2%" 上海勤翔科学仪器有限公司 $!8 酶标仪 超低温冰箱 美国 %!% 公司 重组质粒 #,444% 的构建 构建重组质粒 "& % 使用全长," % 目的基因 根据 重组酶技术操作手册设计相应的 引物 该引物包括 端不少于," 与载体同源的序列以及," 的目的基因片段 经过 扩增可使得目的片段两端均有不少于," 的序列与线性化载体的序列一致 重组质粒 "& % 表达的融合蛋白含有 $# 具体引物序列及酶切位点信息见表 表 #,444% 引物序列及酶切位点!-$$ 3 "!" ""! #,444%,$"! "& %! (( (( (((( ( ( (( ((( (( &!!$! "%! $% "& %!#!$ $% 以全长 % 的 ( 为 模板 利用 ( 2( 聚合酶进行 反应获得目的片段 反应条件为 5 预变性 5! 5! 5 个循环 5 延伸 扩增产物进行 4 琼脂糖凝胶电泳鉴定 利用胶回收试剂盒回收扩增片段 然后用 双酶切载体质粒 "& 并回收线性化片段 将回收后的目的 ( 与线性化 "& 按照 的摩尔比加入到 管中 根据操作说明加入适量 重组酶及相应 3- 混合液于 5 水浴 反应结束后立即将重组反应液转化到大肠埃希菌 感受态细胞中并冰浴 然后在 5 恒温水浴中热激! 冰浴 超净工作条件下将转化液均匀涂抹在含 # 氨苄抗生素 ( " 的培养板上 5 恒温培养箱中倒置培养 % 第 天从选择性培养板上挑取单克隆在含 # 氨苄抗生素 的 3 培养基中扩增 当菌液 之后抽提质粒 进行电泳鉴定 并将初步鉴定正确的阳性克隆送至上海华津生物科技有限公司测序 经测序确认构建成功 可用于下一步蛋白表达 融合蛋白,4% 的表达及纯化 用测序正确的 "& % 转化大肠埃希菌表达菌株 3& 并接种到适量氨苄霉素抗性 终浓度 # 的 3 中 5 培养 % 第 天按 的比例将上述培养物接种在 新的 3 培养基中扩大培养 温度及摇床转速不变 当菌液 达到 时将培养温度降至室温并加入 的 ( ( 及终浓度 的 室温 诱导 % 诱导结束后 5# 离心 收集菌体 5 深冷冰箱冻存或用于下一步蛋白纯化实验 用适量预冷! 缓冲液 " 含 咪唑 均匀重悬菌体 低温高压条件下进行菌体破碎 将重悬的菌液匀浆倒入预冷! 冲洗过的细胞破碎仪 仪器利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放 在剪切效应 空穴效应 碰撞效应的作用下 使菌体细胞破碎 均质 乳化 由于进样 破碎 出样全过程都在 5 低温循环水浴中进行 有利于保持原有物质活性和性能 为达到较理想的效果可将菌液反复进样破碎 次 所有操作按说明书指示进行 破碎后收集该匀质液于 5

4 复旦学报 医学版 年 月 # 条件下离心 弃沉淀取上清 然后收集从 柱上洗脱下来的融合蛋白 向其中将上清流经已用 5 预冷保存的结合缓冲液 上海加入适量凝血酶 充分混匀 5 酶切约 % 将酶生工生物工程有限公司 " 平衡的 预切后的蛋白再次重新挂柱 $# 可以特异性结装柱 重组质粒 "& % 表达的融合蛋合到柱料上 而切去了标签的 % 则不能结合 白由于含有 $# 因此会特异性结合到柱料上 收集柱流出液即可得到不带 $# 标签的而杂蛋白则不能结合 用预冷的洗涤缓冲液 上海 最后用预冷的洗脱缓冲液洗脱标签蛋白 取生工生物工程有限公司 " 洗脱下杂蛋白 适量蛋白与等体积 蛋白加样缓冲液混匀 5 最后用预冷的洗脱缓冲液 上海生工生物工程有限干浴 (& 电泳 考马斯亮蓝 公司 " 洗脱下融合蛋白 % 染色 观察融合蛋白酶切情况,4% 蛋白的酶切处理 由于融合蛋白重组质粒 #!4% 的构建 构建重组 % 带有较大 $# 相对分子质量约质粒 "& % 使用的也是全长," 的 可能会对后续其他实验如酶活性测定 特 % 利用 同源重组技术操作手册设计异性抑制剂筛选或蛋白结晶等产生不良影响 用特相应引物 具体引物序列及酶切位点信息见表 异性酶将其切除 具体操作如下 表 #!4% 引物序列及酶切位点! -$$ 3 "!" ""! #!4%,$"! "& %! (( ( ( (((( ( ( ( ((( (((( &!!$! "%! $% "& %!#!$ $% $ 3 以上述 %( 为 模板 进行高保真 反应 反应条件为 5 预变性 5 变性! 5 复性! 5 退火 个循环 5 延伸 扩增产物用 4 的琼脂糖凝胶电泳分析 并利用胶回收试剂盒回收目的片段 限制性内切酶 $ 3 双酶切质粒 "& 回收线性化载体片段 ( 同源重组连接及 感受态细胞的转化同 "& % 载体构建的操作步骤 然后将转化液均匀涂布在具有卡那霉素抗性的选择性培养板上 5 恒温箱中倒置培养 % 次日挑取单克隆在含相应抗生素的 3 培养基中扩增 提取重组质粒进行双酶切 琼脂糖凝胶电泳分析 将初步鉴定出的阳性克隆送至专业的公司测序 -, 浓度筛选 用测序正确的 "& % 转化大肠埃希菌表达菌株 3& 并接种到适量卡那霉素抗性 终浓度 # 的 3 中 5 培养 % 第 天按 的比例将过夜培养物接种在适量新的 3 培养基中扩大培养 温度及摇床转速不变 当菌液 达到 时将培养温度降至室温并加入 的 ( ( 及不同终浓度的 室温 诱导表达 % 诱导结束后取等量 "& % 转化菌 未加 诱导组及不同终浓度 诱导组 分别加入 加样缓冲液 5 干浴 (& 电泳结束后用考马斯亮蓝染液 染色 脱色检测 观察不同重组质粒转化菌目的蛋白表达情况 重组 % 的表达与纯化 用测序正确的 "& % 转化大肠埃希菌表达菌株 3 & 并接种到适量 # 的 3 中 5 过夜培养 第 天按 的比例将过夜培养物接种在 新的 3 培养基中扩大培养 温度及摇床转速不变 当菌液 达到 时将培养温度降至室温并加入 的 ( ( 及终浓度 的 室温诱导目的蛋白表达 诱导结束后 5# 离心 收集菌体 5 深冷冰箱冻存或直接用于下一步蛋白纯化实验 用适量预冷的! 缓冲液均匀重悬菌体 低温高压条件下进行菌体破碎 实验操作步骤同 % 纯化 破碎结束后 5 # 离心 收集上清 然后将上清流经已用 5 预冷的 3 平衡的 ( 预装柱 重组质粒 "& % 表达的融合蛋白由于含有 个组氨酸构成的 %!$# 因此会特异性结合到柱料

5 李娟娟 等 人源吲哚胺 双加氧酶 的表达与纯化 上 而杂蛋白则不能结合 用预冷的含 咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白 再用含 咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱下目的蛋白 5 条件下 将得到的 % 用 超滤管进行蛋白浓缩 再利用 "% 2 脱盐柱将蛋白缓冲液置换为 的磷酸盐缓冲液 " 得到纯化的 % 蛋白 (& 电泳检测 考马斯亮蓝染液 染色 脱色检测 并用 3! 凝胶图像分析软件分析目的条带纯度 ;( 法测重组 % 蛋白浓度 根据 3( 法蛋白浓度测定试剂盒的技术手册进行操作 首先取蛋白标准配制液 加入到蛋白标品 3 ( 中 得到 # 的蛋白标准液 然后等比稀释得到 # 共 个浓度 根据样品数量 按 的体积比将 3( 试剂 ( 与 3( 试剂 3 充分混匀 得到适量 3( 工作液 取一个 孔酶标板 各孔分别加入 3( 工作液 然后按 孔分别加入蛋白标准液或者适当稀释的待测蛋白 % 用移液器轻轻吹打混匀或者放在酶标仪上震荡!5 静置 后取出酶标板 用酶标仪在波长 下读取每孔的吸光度值 以蛋白浓度 # 为横坐标 为纵坐标 绘制蛋白标准曲线 根据所测样品的 值及标准曲线上的公式计算得到相应的蛋白浓度 # 重组 % 蛋白 2 $" 鉴定 取 纯化后的 % 蛋白稀释 倍 然后取适量与 加样缓冲液于 &"" - 管中混匀 5 干浴后取等量 % 及蛋白 8 上样 (& 电泳 抽提重组质粒 以环状空质粒 "& 为阴性对照 $ 4 琼脂糖凝胶电泳分析 由于重组质粒含有," 的目的基因 因此其相对分子质量会比空质粒的大 电泳过程中迁移的速度慢 据此原理可以粗略判断重组质粒构建情况 图 然后将初步鉴定出的阳性克隆送专业公司测序 测序结果经比对软件分析 重组质粒中的基因序列完全正确 表明上述重组质粒构建成功 $ "& &2$ $ "& % 图 #,444% 质粒电泳验证 $#%$"!" #,444% 融合蛋白,4% 的表达 纯化及酶切处理取等量未加 诱导菌体总蛋白 诱导菌体总蛋白 柱流出液 洗涤缓冲液 洗脱缓冲液分别上样进行 ((& 电泳检测 从结果可以看出 诱导组菌体总蛋白及洗脱缓冲液的泳道在相对分子质量 左右处均有特异性融合蛋白 % 条带 相对分子质量大小包括约 的 标签蛋白及约 的 % 而未诱导组及其他杂蛋白组的泳道则没有该目的蛋白条带 图 泳道 表明融合蛋白表达成功 但是也存在一些问题 从泳道 可以看出从亲和层析柱上洗脱的蛋白中不仅含有融合蛋白 还含有一定量的 标签蛋白 对蛋白纯度造成一定影响 结束后利用转膜仪将凝胶中的蛋白转印到 : 膜上 4 3 配制 的脱脂牛奶常温封闭 % 加入适量人 一抗 兔源 稀释 5 孵育过夜 3 含 4 的 3 溶液 溶液洗膜 每次 洗 次 后再加入相应的二 抗 山羊抗兔 室温震荡孵育 %3 再次洗膜后用 & 化学发光试剂盒在 2 %" 仪器中显色 结 果 重组质粒 #,444% 的构建 挑取 "& % 转化的 单克隆大量扩增 $ 8 % $$ "$, -$ % $$ "$ -$ $ $%!- $%#%- $$ $,!%#,- "$ $, $,- " -$ $%,#!$ $#-$ $%,#!$ 图,4% 蛋白纯化及其酶切处理结果 -$!"!" %$ " ",4%

6 复旦学报!医学版"!!"#$ 年 ( 月# %&! %"! ($!! 由于融 合 蛋 白 带 有 相 对 分 子 质 量 较 大 的 H,? 标签#对 后 续 <=N! 酶 活 性 测 定 <=N! 抑 制 剂 筛 选等实验可能会产 生 不 良 影 响#因 此 我 们 用 凝 血 酶 对 H,? <=N! 进 行 了 酶 切 处 理& 酶 切 结 果 如 图! 所示#从泳道 $-( 我们可以看出标签蛋白切除效果 不太理想!# H,? $5 没有切 完全#造 成得 到的目 的 蛋白 <=N! 有较大损失%延长酶 切时 间及改 变 酶切 温度重复实验也没有明显改善&综合蛋白纯度及酶 切后蛋白浓度考虑#后 续 实 验 中 没 有 再 使 用 4H8M %? # <=N! 这一重组质粒& 重组 质 粒 5%KJ3 R!":K 的 构 建! 从 转 化 的 =>) 扩增菌中提取重组质粒#然后用?"< Q,)< 双酶切重组质粒 48?!$ <=N!#酶切产物用 #R 的 琼脂糖凝胶进 行 电 泳 检 测!图 &#泳 道!"& 发 现 在 #!""D4 左右出现特异 性 =J@ 条 带 大 小 与 预 测 一 致&测序结 果 显 示 重 组 质 粒 中 的 基 因 序 列 完 全 正 确#酶切及测序结果表明该重组质粒构建成功& % :$ 2V 2%K$%!$? $ 4 2 % B "!! K$%#$C2 %#" %% K$%&$? $ 4 2 %$ E 2 %#" %B " ":: K K<C?H% K$%%$? $ 4 2 %$ E 2 %#" %B " # :: <C?H 图 U! 不同浓度!E%D!":K 诱导表达效果筛选 I ( -4, 3 )4),!":KT5 )4 4(2 (8 FU!! (,, -4!E%D )4-4 3 )4 导组 相 比# K<C?H 诱 导 后#菌 体 总 蛋 " " :: 白 K 咪 唑 洗 脱 液 在 相 对 分 子 质 量 约!" :: %"""处 可 见 到 特 异 的 目 的 蛋 白 条 带#而 未 诱 导 组 K 咪 唑 洗 脱 液 则 无 此 特 异 条 菌体总蛋白 %" :: 带#表明 <=N! 表达成功&利用凝胶图像分析软件 Q$%#3 $% " 分析泳 道 #目 的 条 带 <=N! 的 灰 度 与该泳道所 有 蛋 白 条 带 灰 度 的 比 值 即 为 <=N! 的 纯 度#通 过 软 件 计 算 得 出 <=N! 纯 度 达 到 了 )( #R #纯度非常高& =J@ $ 2V 2% K$%!$ <=N!!!K$%#$ 48?!$ 图 S! 重组质粒 5%KJ3 R!":K 的酶切验证 I ( -4, 3 )4),5%KJ3 R!":K8 FS!! )4-4()42? 3 -( )4 F & %可以看!!!E%D 浓度筛选! 比 较 图 % 泳 道! 出#与 未 加 <C? 诱 导 组!泳 道!"相 比#重 组 质 粒 <=N! 转 化 的 表 达 菌 株 在 " " 及 48?!$ K两个 浓 度 的 <C?H 诱 导 下!分 别 为 泳 " #:: 道 & 和 %"均 有 <=N! 的 表 达#且 <C?H 浓 度 为 K时目的 蛋 白 表 达 量 更 高#即 该 浓 度 的 " ":: <C?H <=N! 诱导 表 达 效 果 更 好#因 此 下 一 步 实 验 中 <=N! 的扩大表达均用该浓度的<C?H& 重组!":K 蛋白 P 4? ) 鉴 定! 由 图 Q 看出#与阴性对照!未诱导组菌体总蛋白"相比#上样 纯化后的 <=N! 的泳 道在 相对 分子 质量 %""" 处 有非常明显的蛋白条带#且无任何杂条带#表明纯化 后的 <=N! 特异性很强& Y@& 法测重组!":K 蛋白浓度! 根据 Q@ 浓 度测定试剂盒的说 明 书 进 行 操 作#以 蛋 白 标 品 浓 度 对每个浓度的!$! 值 绘 制 蛋 白 标 准 曲 线#趋 势 线 的 F! %" )))#表 明 标 曲 线 性 较 好& 将 待 测 <=N! 的! 值带入标准曲线 上 的 公 式#计 算 得 到 蛋 白 浓 度 为!":5:K&再利用获得 目 的 蛋 白 的 总 量 与 总 诱 导 表达菌量的比值计算出 <=N! 的收 率为 # :5K# 重组!":K 的 表 达 与 纯 化!48?!$ <=N! 蛋白浓度及收率 均 达 到 较 高 水 平& 经 计 算#本 实 验 转化 QK!#=8& 菌株 诱 导 表 达#将 菌 体 破 碎 的 上 清 纯化的 <=N! 比活力为 $) %%: -# :5-# & 流经 J J?@ 亲 和 层 析 柱 进 行 蛋 白 纯 化#,=, 电 泳 检 测 结 果 见 图 & 由 图 看 出 # 与 未 诱

7 李娟娟 等 人源吲哚胺 双加氧酶 的表达与纯化 ("$8 $% $$ "$, -$$% $$ "$ -$ $$% "$ $ $ "$ $ $3!$, $-% 图 % 纯化过程中 4-, 检测及 2 $" 鉴定结果 4-,!"! &!" 2 $" %#$!" 讨 论 作为催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的关键限速酶 广泛分布于人和动物的多种组织 和细胞中 机体在正常状态下呈低水平表达 但在某些特殊或病理状态下 如妊娠 器官移植 慢性感染以及肿瘤等 其表达水平会显著上升 主要通过引起局部微环境色氨酸耗竭及生成神经毒性代谢产 物等机制 直接或间接对 细胞 神经细胞产生 影响 参与介导局部的免疫抑制反应 并与神经系统疾病 如阿尔兹海默症 抑郁症等 也有着非常密切的联系 引起了人们的广泛关注 鉴于 在免疫调控和多种人类重大疾病发生过程中不可替代的作用 已成为上述疾病治疗的重要靶 标 抑制剂作为极具开发前景的药物也吸 引了众多研究者和制药工作者的目光 与 相比 蛋白的分布范围相对局限 小鼠体内表达 蛋白最丰富的器官是肾 其次是副睾 肝脏 在某些组织中 和 均有表达 但是却定位于不同的细胞中 例如在肾脏中 的表达主要定位于肾血管而 却只表达 于肾小管 尽管与 在表达分布 底物亲和性 酶活性高低 " 等方面具有一定差异 但 与 在功能上是保守的 即 也是催化色氨 酸降解的限速酶之一 参与了多种生理和病 理的免疫调节 本研究采用基因工程手段构建了 个 % 原核表达载体 "& % 和 "& % 并通过比较目的蛋白表达情况筛选出 % 表达效果较好的重组质粒及 浓度 通过亲和层析方法获得了纯化的 % 经测定及计算得出蛋白纯度为 4 蛋白浓度为 # 蛋白收率为 # ((& 电泳检测及!$, $ 分析均发现在相对分子质量约 处有特异性目的条带 综上所述 本实验成功获得了高浓度 高纯度 高收率 高特异性的 % 蛋白 所用质粒载体 菌株均为一般实验室常用易得的原材料 方法简单易行 为 大规模表达奠定基础 通过这一方法获得的 蛋白可以广泛用于研究其体内酶活性 特异性抑制剂筛选 蛋白结晶 也为进一步探寻 的正常生理功能 参与疾病发生的机制等重要课题提供非常有价值的研究对象 参 考 文 献 3( ( ( ( 2 #! $% 8 "$% " "

8 复旦学报 医学版 年 月 李剑欣 张绪梅 徐琪寿 色氨酸的生理生化及其应用 氨基酸和生物资源 刘燕玲 王红梅 闵卫平 色氨酸 双加氧酶 的生物学特性及其在免疫调节与肿瘤治疗中的作用 细胞与分子免疫学杂志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孔令雷 匡春香 杨青 抑制剂的研究进展 中国药物化学杂志 (! -$ "$$% $!! "$ $ %,$! - 2 #! $%$% " $$$! # $, # #$ 收稿日期 编辑 王蔚 &&( ( & "$"%

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