658 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 207,38(7) 体外研究表明, 通过干扰 RNA 技术敲低 MET, 可抑制 HCC 增殖集落形成和迁移 [] 多种 HCC 细胞系动物皮下成瘤实验中,

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孚献解爱新觉罗
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1 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 207,38(7) 人肝细胞生长因子受体原核载体的构建表达及纯化邱栾, 赵珂 2, 董小明 2, 高瑞 2, 张飞翔 2, 张欣悦, 詹轶群 2, 李长燕 2, 李建雄解放军总医院海南分院放射治疗科, 海南三亚 ; 2 军事医学科学院放射与辐射研究所, 北京摘要 : 目的克隆人肝细胞生长因子受体 (MET) 基因, 构建不同结构域 ( ) 的原核表达载体, 获得其原核表达产物, 并纯化相应蛋白质, 为基于 MET 不同结构域的小分子抑制剂筛选提供依据方法采用 PCR 技术从人肝细胞癌细胞系 Hep G2 cdna 文库中扩增出人 MET 基因 ( ), 将其克隆到 pgex-4t-2 载体中, 在大肠埃希菌 BL2 中表达后, 对原核表达产物进行纯化, 以 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定表达与纯化产物结果从人肝细胞癌细胞系 Hep G2 cdna 文库中扩增获得分别约 524 bp 764 bp 257 bp 58 bp 和 9 bp 的 DNA 片段, 并成功构建在 pgex-4t-2 载体上, 经测序与目的序列完全一致 ; 在 BL2 中诱导表达出相对分子质量约为 82 ku 9 ku 72 ku 82 ku 67 ku 的目的蛋白, 经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白 GST-c-MET 结论成功获得了 MET 不同结构域的重组蛋白 GST-c-MET( ), 为后续研究 MET 小分子抑制剂筛选奠定了实验基础关键词 : 肝细胞生长因子受体 ; 原核表达 ; 纯化中图分类号 :Q 78 文献标志码 :A 文章编号 : (207) DOI :0.3969/j.issn 网络出版时间 : :40 网络出版地址 : Prokaryotic expression and purification of human MET QIU Luan, ZHAO Ke 2, DONG Xiaoming 2, GAO Rui 2, ZHANG Feixiang 2, ZHANG Xinyue, ZHAN Yiqun 2, LI Changyan 2, LI Jianxiong Department of Radiation Oncology, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 57203, Hainan Province, China; 2 Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 00850, China Corresponding author: LI Jianxiong. 30ljx@sina.com; LI Changyan. fmmli@63.com Abstract: Objective To construct the prokaryotic expression vectors of human MET (-507, -587, , , ) and obtain their purified proteins, and provide basis for screening small molecule inhibitors to human MET. Methods Human MET (-507, -587, , , ) coding regions were amplified from human HCC Hep G2 cdna library, and they were inserted into prokaryotic expression vector pgex-4t-2. The recombinant plasmids pgex-4t-2- MET were transformed into E.coli BL2. The expressed products were purified and identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Results The DNA fragments of 524, 764, 257, 58 and 9 bp were successfully amplified by PCR from human HCC Hep G2 cdna library, and they were cloned into pgex-4t-2 and identified by sequencing. The recombinant proteins with size 82, 9, 72, 82, 67 ku were successfully induced and purified, and highly purified recombination protein GST-c-MET was obtained. Conclusion The recombinant proteins of GST-c -MET (-507, -587, , , ) are obtained successfully, which lay a foundation for further research on MET and small molecule inhibitors. Keywords: c-met; prokaryotic expression; purification 原癌基因 MET 在多种恶性肿瘤中异常表达, 其编码的蛋白 c-met 属于受体酪氨酸激酶家族的一员 MET 编码的前原蛋白水解成 α 亚基和 β 收稿日期 : 基金项目 : 国家重点研发计划 (206YFC005700) ; 国家自然科学基金 ( ;800042) ; 北京市科技新星计划 (Z ) Supported by Research and Development Program of China (206YFC ); the National Natural Science Foundation of China ( ; ); Beijing Science and Technology New Star Program (Z ) 作者简介 : 邱栾, 女, 在读硕士研究方向 : 一种酪氨酸激酶抑制剂治疗肝细胞癌的策略 @63.com 通信作者 : 李建雄, 男, 主任医师, 副教授, 硕士生导师 30ljx@sina.com ; 李长燕, 女, 研究员, 硕士生导师亚基, 通过二硫键相互作用形成成熟的受体, 肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor,hgf) 作为 c-met 的配体与其结合 [] 被激活的 c-met 在促进肿瘤细胞生长存活迁移侵袭血管生成中发挥重要作用 [2] 除被 HGF 激活外,c-MET 的磷酸化还可由其他途径引起, 如与表皮生长因子受体相互作用细胞黏附等 [3] 不论以何种形式被激活,c-MET 的二聚化自磷酸化和激酶活性都在细胞恶性转化的过程中发挥重要作用 [4-7] 与正常肝组织相比,30% ~ 00% 的肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,hcc) 组织中 c-met 的转录水平上调, 25% ~ 00% 的 HCC 中 c-met 存在过表达 [8-0]

2 658 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 207,38(7) 体外研究表明, 通过干扰 RNA 技术敲低 MET, 可抑制 HCC 增殖集落形成和迁移 [] 多种 HCC 细胞系动物皮下成瘤实验中, 选择性 c-met 抑制剂表现出抑制肿瘤生长的作用, 但在 c-met 低表达的细胞中这种作用并不显著 [2-4] 这提示 MET 可以作为治疗 HCC 的靶点, 过表达的 c-met 可能帮助预判患者对治疗的反应 c-met 是一个跨膜蛋白分子, 胞内外分别含有 3 个结构域, 胞外结构域 : SEMA 结构域, 由 N- 端的 α 亚基和部分 β 亚基形成的异二聚体, 发挥结合配体的作用 ; 个 PSI 结构域 ;4 个转录因子免疫球蛋白结构域胞内含有参与调节激酶活性的近膜域 ; 带有磷酸化活性位点 (Y234 和 Y235) 的催化活性区域 ;C- 末端区域, 带有参与配体蛋白与转导蛋白相互作用的位点 (Y349 和 Y356) [7] 目前已知的 c-met 抑制剂主要靶向激酶结构域, 通过与 ATP 竞争结合阻断 MET 激酶活性由于 MET 激酶结构域在空间结构上与多种受体型酪氨酸激酶相似, 这也是多种受体型酪氨酸激酶抑制剂特异性不高的主要原因因此, 靶向特异性更高的结构域进行小分子抑制剂的筛选, 可能是开发 MET 特异抑制剂的新策略本研究通过分别构建 c-met 不同结构域的原核表达载体, 并获得不同结构域的表达蛋白质, 为后续基于 MET 不同结构域的小分子抑制剂筛选奠定分子基础材料和方法材料原核表达载体 pgex-4t-2 Hep G2 细胞为本实验室保存 ; 大肠埃希菌 DH5α BL2 购自 Biomed 公司 ; 反转录试剂盒购自 Promega 公司 PCR 试剂购自 TOYOBO 公司 pmd9-t 载体和 DNA 限制性内切酶购自 TAKARA 公司 T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司 ; 质粒提取 PCR 产物回收试剂盒均购自 TIANGEN 公司 ;GST 标签抗体羊抗兔 IgG 购自 Proteintech 公司 ; 引物由生工生物工程有限公司合成 ; 测序由北京擎科生物技术有限责任公司完成 ;Glutathione Sepharose 4B 购自 GE Healthcare 公司 2 人肝细胞癌 cdna 文库的构建从人肝细胞癌细胞 Hep G2 中提取总 RNA, 利用反转录 PCR 的方法反转录出人肝细胞癌细胞 Hep G2 的 cdna 文库反转录条件 :25,5 min ;42,60 min ; 70,5 min 3 人 MET( ) 基因的扩增以 Hep G2 细胞中提取的人肝细胞癌文库作为模板, 根据文献报道的人 MET 基因序列合成引物引物序列见表使用高保真 KOD FX DNA 聚合酶, 按照聚合酶试剂盒操作指南, 利用 PCR 方法扩增 MET( ) 序列扩增产物于 4 保存,% 琼脂糖凝胶电泳后, 切下载体片段, 用胶回收试剂盒回收表扩增人 MET ( ) 基因的引物序列 Tab. Primer sequences of MET ( ) Target gene Primer sequences 5'-TCCCCCGGGATGAAGGCCCCCGCTGTGCTT-3' 5'-CCGCTCGAGCTACCCAGTGATAACCAGTGTGTAGCC-3' 5'- TCCCCCGGG ATGAAGGCCCCCGCTGTGCTT -3' 5'-CCGCTCGAGCTAGTCCCAGCCACATATGGTCAG -3' 5'-TCCCCCGGGAGCGGGACATGGACTCAACAGATC -3' 5'-CCGCTCGAGCTAGCGAACTAATTCACTGCCCAGATC-3' 5'-TCCCCCGGGAGCGGGACATGGACTCAACAGATC -3' 5'-CCGCTCGAGCTAAGCACTGAGGTCAATGTGGAC-3' 5'-TCCCCCGGGGGTTCATGCCGACAAGTGCAG -3' 5'-CCGCTCGAGCTAGCGAACTAATTCACTGCCCAGATC-3' 4 重组 T 质粒的构建利用 Ex Taq 酶在 PCR 产物的 3 末端加一个非模板依赖的 A 碱基, 反应条件 :72,20 min 将末端带有 A 碱基的目的基因片段连接入末端带有 T 碱基的 pmd9-t 载体转化大肠埃希菌 DH5α, 挑选单克隆摇菌, 以菌液为模版做菌落 PCR 鉴定, 产物凝胶电泳, 选电泳条带大小与预期一致的阳性菌液提质粒, 送至北京擎科生物公司测序 5 重组表达质粒的构建及鉴定用 Sma Ⅰ 酶切 pgex-4t-2 载体及测序正确的质粒,30,6 h,% 琼脂糖凝胶电泳后, 胶回收载体与目的基因片段, 回收产物用 Xho Ⅰ 在 37 条件下酶切 6 h,% 琼脂糖凝胶电泳, 胶回收载体与目的基因片段在 T4 DNA 连接酶作用下目的基因连接 pgex-4t-2 载体转化大肠埃希菌 DH5α, 挑选克隆, 摇菌并提质粒, 用 Sma Ⅰ 和 Xho Ⅰ 双酶切鉴定酶切鉴定正确的质粒送北京擎科生物公司测序 6 pgex-4t-2-met 在大肠埃希菌中的表达及鉴定将鉴定正确的重组表达质粒 pgex-4t-2- MET( ) 转化 BL2 感受态细胞, 挑取菌落种于含 Amp + 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养过夜活化以 % 比例转种于同

3 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 207,38(7) 种液体培养基中,37 振荡培养至 OD 600 =0.4 ~ 0.6, 加入诱导剂 IPTG 至终浓度为 0. mmol/l,37 继续培养 9 h 将鉴定正确的重组表达质粒 pgex- 4T-2-MET( ) 转化 BL2 感受态细胞, 挑取单克隆种于含 Amp + 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养过夜活化以 % 比例转种于同种液体培养基中,37 振荡培养至 OD 600 =0.4 ~ 0.6, 加入诱导剂 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/l,37 继续培养 9 h 离心菌液, 留取沉淀加入 2 Loading buffer 收集蛋白, 以鼠源抗 GST 多克隆抗体为一抗, 以 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗进行 Western blot 检测融合蛋白的表达 7 GST-c-MET 的纯化与洗脱将鉴定正确的重组表达质粒 pgex-4t-2-met( ) 转化 BL2 感受态细胞, 挑取菌落种于含 Amp + 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养过夜活化以 % 比例转种于同种液体培养基中,30 振荡培养至 OD 600 =0.4 ~ 0.6, 加入诱导剂 IPTG 至终浓度为 0. mmol/l,20 继续培养 2 h 将鉴定正确的重组表达质粒 pgex-4t-2-met( ) 转化 BL2 感受态细胞, 挑取单克隆种于含 Amp + 的 LB 液体培养基中,37 振荡培养过夜活化以 % 比例转种于同种液体培养基中,30 振荡培养至 OD 600 =0.4 ~ 0.6, 加入诱导剂 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/l,6 继续培养 9 h 离心收集菌体, 按 GE Health 公司提供的方法进行蛋白的纯化 : 加入裂解液, 进行超声破碎, 收集上清, 加入适量 Glutathione Sepharose 4B,4 结合 2 h, 离心收集 GST Beads, 充分洗脱最后以 SDS-PAGE 鉴定纯化与洗脱蛋白结果人 MET 的克隆以人肝细胞癌文库作为模板进行 MET( ) 的扩增, 获得大小分别约 524 bp 764 bp 257 bp 58 bp 9 bp 的 PCR 产物, 产物与预期片段大小一致 ( 图 ) 2 成功构建重组 T 载体质粒 PCR 产物两端加碱基 A 后, 连接入末端带有 T 碱基的 pmd9-t 载体转化大肠埃希菌 DH5α, 挑选单克隆摇菌, 做菌落 PCR 鉴定, 产物凝胶电泳可见大小约为 524 bp 764 bp 257 bp 58 bp 9 bp 的条带 ( 图 2), 表明 MET 基因的 ( ) 序列已连接 T 载体 DNA 序列测定结果显示, 与已知序列完全一致, 无突变发生 3 重组表达载体 pgex-4t-2-met 质粒的鉴定将测序正确的质粒双酶切后与酶切过的 PGEX- 4T-2 载体连接, 转化大肠埃希菌 DH5α, 挑选的阳性克隆质粒, 经酶切鉴定, 凝胶电泳可见约 524 bp 764 bp 257 bp 58 bp 9 bp 的条带和与载体 pgex-4t-2 大小 4900bp 相当的条带 ( 图 3), 表明 MET 基因的 ( ) 序列已插入到 pgex-4t-2 的多克隆位点中 DNA 序列测定结果显示, 与已知序列完全一致, 无突变发生 4 pgex-4t-2-gst-c-met 蛋白的诱导表达及鉴定将鉴定正确的重组表达质粒转化 BL2 感受态细胞, 经过小量诱导后, 收集菌体,Western blot 检测发现, 空载体 pgex-4t-2 和重组载体 pgex- 4T-2-GST-c-MET( ) 蛋白获得正确表达 ( 图 4) 5 蛋白 GST-c-MET 的纯化与洗脱利用 Glutathione Sepharose 4B 亲和珠纯化后的融合蛋白, 经还原型谷胱甘肽多次洗脱, 考马斯亮蓝染色结果显示, 获得一定量纯度较高的 GST-c-MET( ) 蛋白 ( 图 5) 图目的基因的 PCR 扩增 M: DNA marker;: MET (-507) ; 2: MET (-587) ; 3: MET ( );4: MET ( );5: MET (08-390) Fig. The target gene amplification by PCR M: DNA marker; : MET (-507); 2: MET (-587); 3: MET ( ); 4: MET ( ); 5: MET (08-390) 图 2 菌落 PCR 鉴定 M:DNA marker;:met (-507);2:MET (-587);3: MET ( );4:MET ( );5:MET (08-390) Fig. 2 PCR results of colony M: DNA marker; : MET (-507); 2: MET (-587); 3: MET ( ); 4: MET ( ); 5: MET (08-390)

4 660 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 图 3 重组质粒的酶切鉴定 M DNA marker; : MET ( -507); 2: MET (-587); 3: MET ( ); 4: MET ( ); 5: MET (08-390) Fig. 3 Restriction enzyme digestion of the recombination plasmid M: DNA marker; : MET ( -507); 2: MET (-587); 3: MET ( ); 4: MET ( ); 5: MET (08-390) 图 4 pgex-4t-2-gst-c-met 蛋白的 Western blot 分析 pgex -4T-2-GST 2 c-met (-507) 3 c-met (-587) 4 c-met ( ) 5 c-met ( ) 6 c-met(08 390) Fig. 4 Expression of pgex-4t-2 -GST-c-MET detected by western blot : pgex-4t-2 -GST; 2: c-met (-507); 3: c-met (-587); 4: c-met ( ); 5: c-met ( ); 6:c-MET(08390) 图 5 蛋白纯化后的 SDS-PAGE 分析 GST-c-MET (-507) 2 GST-c-MET(-587) 3 GST c-met ( ) 4 GST-c -MET ( ) 5 GST-c MET (08-390) 6 GST M protein ladder Fig. 5 SDS-PAGE showing puriﬁed protein : GST-c-MET ( -507); 2: GST-c-MET ( -587); 3: GST-cMET ( ); 4: GST-c-MET ( ); 5: GST-c-MET (08-390); 6: GST; M: protein ladder 讨论 c-met 胞外域与其配体 HGF 结合后发生磷酸化促进胞内的 C- 端多功能结构域与多种细胞间质因子结合如 GAB( 生长因子受体结合蛋白 -) GAB2( 生长因子受体结合蛋白 -2) 等进一步激活 RAS/MAPK PI3K/AKT JAK/STAT 等通路 [5-6] 在调控细胞的生长迁移增殖和存活中发挥重要作用 [4] 在多种人类恶性肿瘤如膀胱癌胃癌肺癌乳腺癌中发现异常高水平表达的 c-met c-met 通路异常活化促进了肿瘤的发生发展 [7] 此外 c-met 与膜受体之间的相互作用还参与激酶抑制剂靶向治疗耐药性的形成 [8] 有研究表明 MET 或 HGF 异位过表达的细胞系在裸鼠实验中表现出致瘤性和转移性而 MET 表达下调则降低了细胞的致瘤潜能 [9] MET 或 HGF 转基因小鼠发生转移性肿瘤 [20] 在许多种实体瘤中发现了异常表达的 MET( 通常是过表达 ) 与不良预后相关 [5] 肿瘤中的异常活化的 MET 可由于不同的分子水平变化引起如过表达基因扩增自分泌活化活化位点突变或 MET 靶向性 mirna 的下调虽然除了与 HGF 结合以外过表达也可以使 MET 活化但在大多数情况下受体的完全激活仍然需要配体参与 [2] 由于肿瘤的病因及发病机制复杂靶向 MET 的分子治疗取得的进展有限 MET 激酶结构域在空间结构上与多种受体型酪氨酸激酶相似因此多种受体型酪氨酸激酶抑制剂往往特异性不高我们针对 MET 胞外的 SEMA 和 PSI 结构域构建了重组质粒 pgex-4t-2-met( ) 针对转录因子免疫球蛋白结构域和跨膜区域构建了重组质粒 pgex-4t-2-met( ) 针对胞内的酪氨酸激酶结构域构建了重组质粒 pgex-4t-2-met(08-390) 以 pgex-4t-2 的标签蛋白 GST 为标准在原核细胞中成功表达了这些针对 MET 不同结构域的重组质粒并纯化出相应蛋白质本实验成功构建人肝细胞生长因子受体基因不同结构域的原核表达载体 pgex-4t-2met( ) 为继续深入研究 MET 小分子抑制剂筛选奠定了实验基础参考文献 Goyal L Muzumdar MD Zhu AX. Targeting the HGF/c-MET pathway in hepatocellular carcinoma J. Clin Cancer Res Trojan J Zeuzem S. Tivantinib in hepatocellular carcinoma J. Expert Opin Investig Drugs Hassan B Akcakanat A Holder AM et al. Targeting the PI3kinase/Akt/mTOR signaling pathway J. Surg Oncol Clin N Am Choi KJ Baik IH Ye SK et al. Molecular Targeted Therapy for

5 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jul 207,38(7) 66 Hepatocellular Carcinoma :Present Status and Future Directions[J]. Biol Pharm Bull,205,38(7): Breunig C,Mueller BJ,Umansky L,et al. BRaf and MEK inhibitors differentially regulate cell fate and microenvironment in human hepatocellular carcinoma[j]. Clin Cancer Res,204,20(9): Chen J,Gao J. Advances in the study of molecularly targeted agents to treat hepatocellular carcinoma[j]. Drug Discov Ther,204,8(4): Cui JJ. Targeting receptor tyrosine kinase MET in cancer :small molecule inhibitors and clinical progress[j]. J Med Chem,204, 57(): Wu F,Wu L,Zheng S,et al. The clinical value of hepatocyte growth factor and its receptor--c-met for liver cancer patients with hepatectomy[j]. Dig Liver Dis,2006,38(7): Scagliotti GV,Novello S,von Pawel J. The emerging role of MET/ HGF inhibitors in oncology[j]. Cancer Treat Rev,203,39(7): Blumenschein GR Jr,Mills GB,Gonzalez-Angulo AM. Targeting the hepatocyte growth factor-cmet axis in cancer therapy[j]. J Clin Oncol,202,30(26): Zhang SZ,Pan FY,Xu JF,et al. Knockdown of c-met by adenovirus-delivered small interfering RNA inhibits hepatocellular carcinoma growth in vitro and in vivo[j]. Mol Cancer Ther,2005, 4(0): Salvi A,Arici B,Portolani N,et al. In vitro c-met inhibition by antisense RNA and plasmid-based RNAi down-modulates migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells[j]. Int J Oncol, 2007,3(2): Xie B,Xing R,Chen P,et al. Down-regulation of c-met expression inhibits human HCC cells growth and invasion by RNA interference [J]. J Surg Res,200,62(2): You H,Ding W,Dang H,et al. c-met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma[j]. Hepatology,20,54(3): Comoglio PM,Giordano S,Trusolino L. Drug development of MET inhibitors :targeting oncogene addiction and expedience[j]. Nat Rev Drug Discov,2008,7(6): Gherardi E,Birchmeier W,Birchmeier C,et al. Targeting MET in cancer :rationale and progress[j]. Nat Rev Cancer,202,2(2): Santoro A,Simonelli M,Rodriguez-Lope C,et al. A Phase-b study of tivantinib (ARQ 97)in adult patients with hepatocellular carcinoma and cirrhosis[j]. Br J Cancer,203,08(): Giordano S,Columbano A. Met as a therapeutic target in HCC :facts and hopes[j]. J Hepatol,204,60(2): Birchmeier C,Birchmeier W,Gherardi E,et al. Met,metastasis, motility and more[j]. Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(2): Wang R,Ferrell LD,Faouzi S,et al. Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice[j]. J Cell Biol,200,53(5): Corso S,Giordano S. Cell-Autonomous and Non-Cell-Autonomous Mechanisms of HGF/MET-Driven Resistance to Targeted Therapies : From Basic Research to a Clinical Perspective[J]. Cancer Discovery,203,3(9):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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