42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No RNA, 以 oligo(dt) 为引物进行反转录, 然后以上述引物进行 PCR 扩增 :0 LATaqbufer5μl dntp5μl 上游引物 μl 下游引物 μl LATaq 酶 (5U/μl)0.5μ

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庵欧阳
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(5):4~45 前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定李美宁解军常冰梅张悦红 2 殷云勤 ( 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原 03000) (2 山西医科大学第一医院消化检验中心太原 03000) 程牛亮摘要 5? 羟基前列腺素脱氢酶 (PGDH) 属于抑癌基因, 在多种肿瘤中表达缺失, 在肿瘤的发生发展中起着重要作用提取人正常大肠黏膜组织总 RNA, 利用 RT?PCR 方法扩增得到 PGDH 基因的编码序列, 克隆入原核表达载体 pbv220, 测序鉴定正确后转化 E.coliDH5α, 经温控诱导表达, 表达产物进行 SDS?PAGE 和 Westernblot, 证实为相对分子质量约为的 PGDH?His6 蛋白, 表达产物以包涵体形式存在,3h 诱导表达量最高, 约占菌体总蛋白的 30% 经 Ni 2+ 配体亲和层析纯化得到纯度大于 95% 的目的蛋白重组 PGDH 简单复性后具有一定的生物活性, 约为 U/mg, 为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础关键词大肠癌 5? 羟基前列腺素脱氢酶克隆原核表达中图分类号 Q786 NAD + 依赖的 5? 羟基前列腺素脱氢酶 (NAD +? dependent5?hydroxyprostaglandindehydrogenase,pgdh) 是前列腺素 (prostaglandins,pgs) 和相关的二十烷类生物活性物质降解灭活的关键酶, 可催化有活性的 5? 羟基前列腺素氧化成为活性较弱的 5? 酮基前列腺素近来研究显示, 5?PGDH 的表达缺失或减少可能与一些恶性肿瘤, 如肠癌肺癌乳腺癌甲状腺癌等的发生发展密切相关 [,2], 恢复其表达则对肿瘤的生长转移有一定的抑制作用, 如 : 肺腺癌 A549 细胞转染表达 PGDH 后裸鼠致瘤能力明显降低 [3] [4] ; 转染 PGDH 能诱导乳腺癌细胞凋亡等目前国外关于 PGDH 的研究多为生物学特性及功能方面, 国内有关 PGDH 研发的报道亦不多见本研究克隆了 PGDH 蛋白基因, 构建了 pbv220? PGDH?His6 原核表达系统, 建立了稳定的表达菌株, 成功获得目的蛋白, 表达量达 30%, 并具有一定的活性, 为下一步 PGDH 功能研究及药物开发奠定基础材料与方法. 材料宿主菌 E.coliDH5α 和原核表达载体 pbv220 为本收稿日期 : 修回日期 : 山西省科技攻关资助项目 ( ?02) 通讯作者, 电子信箱 :chengniuliangty@yahoo.com 实验室保存 ;Trizol 购自 Invitrogen 公司 ; 反转录试剂盒克隆质粒 pmd8?t 限制性内切酶 BamHI PstI LATaq 酶及胶回收试剂盒均购自 TaKaRa 公司 ;Tris 碱 T4 DNA 连接酶蛋白酶抑制剂和琼脂糖购自 Promega 公司 ; 溶菌酶购自 Meark 公司 ;His?Tag 鼠单克隆抗体购自 SantaCruz 公司 ; 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺过硫酸铵和 SDS 购自 Sigma 公司 ; 低相对分子质量蛋白标准购自华美公司 ; 胰化蛋白胨和酵母提取物购自 Oxoid 公司 ; Ni 2+?NTA 树脂柱购自 Novagen 公司 ;5(S)?[5? 3 H] PGE 2 购自 Cayman 公司 ;ECL 发光试剂购自碧云天生物技术研究所 ; 其它试剂均为国产分析纯试剂.2 PCR 引物设计与合成根据 PGDH 的 cdna 序列, 利用 primer5.0 设计如下引物 : 上游引物为 :5?TGCGGATCCCAGCAGTGGCTG CACCATG?3 ( 含 BamH I 酶切位点 ), 下游引物为 :5? TGCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGTTGGGTTT TTGTTGAAATGGC?3 ( 含 PstI 酶切位点 ) ATG 为起始密码子 ;5 TGC 为保护序列 ; 下游引物含 6 个 His 序列, 其余为外源基因序列引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.3 总 RNA 的提取与 RT?PCR 用 Trizol 一步法从正常人大肠黏膜组织中提取总

2 42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No RNA, 以 oligo(dt) 为引物进行反转录, 然后以上述引物进行 PCR 扩增 :0 LATaqbufer5μl dntp5μl 上游引物 μl 下游引物 μl LATaq 酶 (5U/μl)0.5μl 模板 0μl 灭菌去离子水 27.5μl 扩增程序为:95 预变性 5min,95 变性 30s,54 退火 45s,72 延伸 min, 共 35 个循环, 最后 72 延伸 0min 以灭菌水代替反转录产物为模板作为 PCR 反应的阴性对照 PCR 产物经.0% 琼脂糖凝胶电泳鉴定.4 表达载体的构建将 RT?PCR 产物与 pmd8?t 质粒进行 T?A 连接, 酶切及序列鉴定后, 用 BamHI 和 PstI 双酶切质粒, 低熔点胶回收目的基因片段, 与开环 pbv220 连接, 转化 E.coliDH5α 感受态细胞碱裂解法小量提取质粒, 用 PCR 法和双酶切法检测插入片段的大小,.0% 琼脂糖凝胶电泳观察结果阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定将鉴定正确的表达载体命名为 pbv220?pgdh?his6.5 PGDH 蛋白的诱导表达从含表达载体的工程菌 E.coliDH5α 的 LB 平板上挑取单菌落, 转种于 5ml 含氨苄西林 (00μg/ml) 的 LB 培养基中,30 230r/min 振荡培养过夜 ; 取过夜培养物 50μl 转入 5ml 新鲜的 LB/Amp 培养基中,30 振荡培养至 A 600 为 0.4~0.6 时, 温度调整至 42 进行诱导表达, 每隔 h 取 0.5ml 菌液, 以 pbv220 空载体及未进行温度诱导的 pbv220?pgdh?his6 的培养物作为对照 r/min 离心 0min 收集菌体, 菌体沉淀用 STE 洗涤次后重悬于 STE 采用 200W 超声破菌, 其中超声 3s, 间歇 3s, 共进行 200 次裂解物经 r/ min 离心 0min, 上清与沉淀分别经 2%SDS?PAGE 分析鉴定.6 PGDH 蛋白的纯化用 3 倍柱体积的结合缓冲液 (8mol/L 尿素, 0.mol/LNaH 2 PO 4,0.0mol/LTris,pH8.0) 平衡 Ni 2+? NTA 琼脂糖树脂, 取 50ml 表达菌, 将其悬浮于 5ml 结合缓冲液中, 在冰浴中 200W 超声 3s, 间歇 3s, 共 200 次,4 2000r/min 离心 0min, 保留上清, 将此上清过已平衡好的 Ni 2+?NTA 琼脂糖树脂柱吸附, 然后用 0 倍柱体积的漂洗缓冲液 (8mol/L 尿素,0.mol/L NaH 2 PO 4,0.0mol/LTris?C,pH6.2) 洗去杂蛋白, 用 3 倍柱体积的洗脱缓冲液 (8mol/L 尿素,0.mol/L NaH 2 PO 4,0.0mol/LTris,pH4.3) 洗脱目的蛋白, 取样进行 SDS?PAGE, 分析纯化效果.7 Westernblot 鉴定取 50μg 样品与等体积的 2 上样缓冲液混匀, 00 煮沸 5min,2%SDS?PAGE 分离蛋白, 转移至硝酸纤维素膜上,5% 的脱脂奶粉?PBS?0.05%Tween?20 室温封闭 2h, 加入以封闭液 500 稀释的 His?Tag 单抗, 4 过夜 ;0.05%Tween?20 的 PBS 洗 3 次, 每次 5min; 加入以封闭液 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠二抗, 室温反应 2h,0.05% Tween?20 的 PBS 洗 3 次, 每次 5min; 滴加 ECL 发光试剂,X 线胶片曝光照片用 ScionImage 软件进行扫描分析处理.8 PGDH 的复性及酶活性分析采用梯度透析的方法, 将纯化的蛋白在 4 条件下, 以尿素作复性缓冲液, 依次将尿素浓度从 8mol/L 降低为 6mol/L,4mol/L,2mol/L,mol/L,0.5mol/L, 每步透析时间至少 4h, 最后透析在生理盐水中然后通过超滤管浓缩, 并测定蛋白含量 PGDH 酶活性测定方法参考文献 5, 并参照 Cayman 公司的操作说明进行反应体系包括 :NH 4 Cl,5μmol; α? 酮戊二酸,μmol;NAD+,μmol;5(S)?[5? 3 H] PGE2,nmol,30000c.p.m.; 谷氨酸脱氢酶 00μg 和 00μg 纯化产物,37,0min; 对照管在开始反应前加入 300μl 含 0% 炭粉混悬液 ; 测定管反应结束后加入 300μl 含 0% 炭粉混悬液终止反应 000g, 离心 5min,5(S)?[5? 3 H]PGE2 吸附炭粉被沉淀,α? 酮戊二酸接受脱下的 3 H 生成同位素标记的谷氨酸, 继续保留在上清中液体闪烁计数仪测定上清的同位素放射强度酶活力定义 : 在 ph 值 7.5, 温度 37 的条件下, μg 酶每分钟使溶液放射强度增加 0c p m 定义为个酶活力单位 2 结果 2. PGDH 基因的 RT?PCR 扩增及测序 PCR 扩增产物经.0% 琼脂糖凝胶电泳, 在约 850bp 处可见特异性扩增条带, 与理论值 845bp 相符 ( 图 ) 测序结果与 GenBank 公布的基因序列一致 2.2 重组质粒 pbv220?pgdh?his6 鉴定以挑选的表达质粒为模板进行 PCR 和酶切鉴定, 均在 850bp 处出现目的条带 ( 图 2) 阳性重组质粒进行 DNA 序列分析显示, 在 pbv220 载体上插入的外源 PGDH 基因长度方向及其序列均正确 ( 图略 )

2008,28(5) 李美宁等 : 前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 43 图 RT?PCR 扩增 PGDH cdna 片段电泳图谱 Fig. Electropherogram ofpgdh cdna fragmentamplifiedbyrt?

his6 M:MiddleMW proteinmarker;:supernatantofdh5αpbv220? PGDHinducedwith42 3h;2:PeletofDH5αpBV220?PGDH inducedwith42 3h;3:PeletofDH5αpBV220?PGDHinduced with42 2h;4:PeletofDH5apBV220?

3 PGDH?His6 蛋白的诱导表达含 pbv220?pgdh?his6 的工程菌经温控诱导后, 通过不同时间段取样的电泳分析, 发现表达产物相对分子质量约为 29000, 主要以包涵体形式存在于沉淀中, 并且诱导 3h 表达量最高 ( 图 3), 经凝胶成像系统分析表明目的蛋白约占菌体总蛋白 30% 2.4 表达产物的 Westernblot 分析将表达产物经 SDS?

NTA 树脂对重组蛋白进行亲和纯化在相对分子质量 29kDa 处出现特异性条带, 经凝胶成像系统分析表明目的蛋白纯度大于 95%( 图 5) 图 4 表达产物的 Westernblot 鉴定 Fig.

3 2008,28(5) 李美宁等 : 前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 43 图 RT?PCR 扩增 PGDH cdna 片段电泳图谱 Fig. Electropherogram ofpgdh cdna fragmentamplifiedbyrt?pcr M:50bpDNAladder(50,300,450,600,750,900,200);,2:PCRproducts;3:PCRnegativecontrol 图 3 表达产物 SDS?PAGE 分析 Fig.3 SDS?PAGEanalysisofexpresed productofpbv220?pgdh?his6 M:MiddleMW proteinmarker;:supernatantofdh5αpbv220? PGDHinducedwith42 3h;2:PeletofDH5αpBV220?PGDH inducedwith42 3h;3:PeletofDH5αpBV220?PGDHinduced with42 2h;4:PeletofDH5apBV220?PGDHinducedwith42 h;5:peletofdh5αpbv220?pgdhuninducedwith42 ; 6:DH5αpBV220inducedwith42 图 2 重组载体 pbv220?pgdh?his6 鉴定 Fig.2 Identificationofrecombinant pbv220?pgdh?his6 M:50bpDNAladder(50,300,450,600,750,900,200); :AmplifiedproductbyPCR;2:Digested productbybamhiandpsti 2.3 PGDH?His6 蛋白的诱导表达含 pbv220?pgdh?his6 的工程菌经温控诱导后, 通过不同时间段取样的电泳分析, 发现表达产物相对分子质量约为 29000, 主要以包涵体形式存在于沉淀中, 并且诱导 3h 表达量最高 ( 图 3), 经凝胶成像系统分析表明目的蛋白约占菌体总蛋白 30% 2.4 表达产物的 Westernblot 分析将表达产物经 SDS?PAGE 分离, 转移至硝酸纤维素膜上, 用 His 单克隆抗体作为特异性抗体, 可见一条特异条带 ( 图 4), 说明表达蛋白具有良好的特异性, 确为 PGDH 蛋白 2.5 表达产物的产量及酶活性分析构建表达载体时在目的蛋白 C 端带有 6 个组氨酸标签, 可利用 Ni?NTA 树脂对重组蛋白进行亲和纯化在相对分子质量 29kDa 处出现特异性条带, 经凝胶成像系统分析表明目的蛋白纯度大于 95%( 图 5) 图 4 表达产物的 Westernblot 鉴定 Fig.4 Identificationofexpresionproductby WesternBlot :PeletofDH5αuninducedwith42 ; 2:PeletofDH5αinducedwith42 3h Ni?NTAsepharose 纯化的 PGDH 经透析复性, 活性检测结果显示, 复性后的重组 PGDH 具有生物活性, 在酶反应体系中 00μg 纯化复性蛋白每分钟使放射强度升高 37000c.p.m, 根据酶活力单位定义 : 在 ph 值 7.5, 温度 37 的条件下,μg 酶每分钟使溶液放射强度增加 0c.p.m. 定义为个酶活力单位, 其降解 PGE2 的酶活性约为 U/mg 3 讨论 PGDH 基因位于 4 号染色体 q34?q35, 属于短链脱氢酶家族, 由两个相同亚单位构成二聚体, 可逆地催化 PGC?5 位置上的氧化 / 还原反应 [6] PGDH 对肿瘤生长的抑制作用在多种肿瘤的细胞水平研究和裸鼠致瘤模型中得到证实 : 可能通过拮抗 COX?2 发挥抗肿瘤作用, 并且 PGDH 可以降解机体自身产生的致癌物或前

44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No.52008 图 5 表达产物纯化结果 Fig.5 SDS?

4 44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 图 5 表达产物纯化结果 Fig.5 SDS?PAGEprofileofpurifiedfusion proteinpgdh :ProductpurifiedfrompeletofDH5αinducedwith42 3h; 2:ProductpurifiedfrompeletofDH5αuninducedwith42 致癌物起到预防肿瘤的作用, 因而 PGDH 有望成为一种新型肿瘤预防和治疗药物 [7,8] 为进一步了解 PGDH 功能及在肿瘤发病机制中的作用, 研究通过 RT?PCR, 首先扩增了人 PGDH 编码区 850bp 基因, 将其进行 T?A 克隆连接, 并将其亚克隆入 pbv220 表达载体, 通过 PstI 和 BamH I 酶切及序列测定证实了 pbv220?pgdh?his6 表达载体的正确性将重组载体转化大肠杆菌, 通过温控诱导,SDS?PAGE 分析, 在相对分子质量约处出现融合蛋白, 与理论预期值基本一致, 并且 Westernblot 鉴定为目的蛋白的特异表达 pbv220?pgdh?his6 表达系统属于高效原核基因表达系统 [9], 该系统在诱导 3 小时表达的 PGDH 蛋白占菌体总蛋白的 30%, 表达量较高为了便于蛋白的纯化, 在 C 基端连接 6 个组氨酸, 从而利用组氨酸与 Ni +?NTA 树脂高亲和力结合, 得到纯度大于 95% 的目的蛋白进一步复性后, 重组 PGDH 具有一定的生物活性, 降解 PGE2 的活性约为 U/ mg [0~2] 我们运用基因重组的方法建立了 PGDH 蛋白的原核表达体系, 获得一定数量及质量的 PGDH 蛋白, 为后续的细胞生物学实验及药物研发奠定了基础参考文献 []YanM,RerkoRM,PlatzerP,etal.5?Hydroxyprostaglandin dehydrogenase,acox?2oncogeneantagonist,isatgf?beta? inducedsuppresorofhumangastrointestinalcancers.procnatl AcadSciUSA,2004,0(50):7468~7473 [2]MyungSJ,RerkoRM,YanM,etal.5?Hydroxyprostaglandin dehydrogenaseisaninvivosuppresorofcolontumorigenesis. ProcNatlAcadSciUSA,2006,03(32):2098~202 [3] Ding Y,Tong M,Liu S,etal.NAD +?linked 5? hydroxyprostaglandindehydrogenase(5?pgdh)behavesasa tumorsuppresorinlungcancer.carcinogenesis,2005,26(): 65~72 [4]WolfI,O KelyJ,RubinekT,etal.5?hydroxyprostaglandin dehydrogenaseisatumorsuppresorofhumanbreastcancer. CancerRes.2006,66(5):788~7823 [5]TaiHH.Enzymaticsynthesisof(5s)?[5?3h]prostaglandins andtheiruseinthedevelopmentofasimpleandsensitiveasay for5?hydroxyprostaglandindehydrogenase.biochemistry,976, 5(2):4586~4592 [6] Backlund M G,Mann J R,Hola V R,et al.5? Hydroxyprostaglandin dehydrogenase is down?regulated in colorectalcancer.jbiolchem,2005,280(3):327~3223 [7]EnsorCM,YangJY,OkitaRT,etal.Cloningandsequence analysisofthecdnaforhumanplacentalnad(+)?dependent 5?hydroxyprostaglandindehydrogenase.JBiolChem,990,265 (9):4888~489 [8]JezJM,BennetM J,SchlegelBP,etal.Comparativeanatomy ofthealdo?ketoreductasesuperfamily.biochem J,997,32 (6):625~636 [9] 雷迎峰, 尹文, 薛小平, 等. 丙性肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定. 中国生物工程杂志,2005,25(9):40 ~43 LeiYF,YinW,XueXP,etal.ChinaBiotechnology,2005,25 (9):40~43 [0]BardySL,NgSY,JarelKF.Recentadvancesinthestructure and asembly ofthe archaealflagelum.j MolMicrobiol Biotechnol,2004,7(~2):4~5 []CarioM M,VilaverdeA.Constructionanddeconstructionof bacterialinclusionbodies.jbiotechnol,2002,96():3~2 [2]FahnertB,LilieH,NeubauerP.Inclusionbodies:formationand utilisation.advbiochem EngBiotechnol,2004,89(2):93~ 42

5 2008,28(5) 李美宁等 : 前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 45 ExpresionPurificationandIdentificationof5?Hydroxyproglandin DehydrogenaseGeneinEscherichiacoli LIMei?ning XIEJun CHANGBing?mei ZHANGYue?hong YINYun?qin 2 CHENGNiu?liang (Departmentofbiochemistryandmolecularbiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan 03000,China) (2Departmentofdigestivetest,theFirstAfiliatedHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyan 03000,China) Abstract 5?hydroxyproglandindehydrogenase(PGDH)isatumorsuppresorgene.PGDH transcriptand proteinarebothhighlyexpresedbynormaltisuebutarenearlyundetectableinseveraltumors.totalrnawas isolatedfrom humannormalcolonicepithelia.thenthepgdh cdna genewasamplifiedbyreversetranscript polymerasechainreaction(rt?pcr).theamplifiedfragmentwasorientationlylinkedintotheprokaryotic expresionvectorpbv220byt4dnaligaseandthensequenced.theresultindicatedthattheclonedgenewasa corectedpgdh.thentherecombinedexpresionplasmidwastransducedintodh5αbytss,andtheexpresion ofpgdhproteinwasinducedbytemperaturefor3hoursat42,andthefusionproteinofpgdh?his6was analyzedbysds?page andwesternblotafterlysisofbacteria.thesds?page resultshowedthatcloned recombinantproteinwasexpresedintheinclusionbodywithmolecularweightofapproximated29kda.the PGDH fusionproteincontainingabout30% oftotalsomaticprotein,wasstablyexpresedine.coli.after ultrasonicationandpurificationbyimmobilizedmetalchelationafinitychromatography,homogenousproteinwas obtainedandreached95% purityasprovedbysds?page.westernblotidentifieditsspecificity.theexpresed PGDHproteinhadhighlybioactivity,anditsenzymeactivityisabout U/mg. Keywords Colorectalcancer 5?hydroxyproglandindehydrogenase(PGDH) Geneclone Gene expresion

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌