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允粗苏
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1 广西医科大学学报 JOURNAL OFGUANGXIMEDICAL UNIVERSITY 2017Apr ;34(4) 601 췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍 췍技术与方法 췍 췍 铁硫蛋白形成的关键分子 oa 同系物 3 蛋白抗体制备及鉴定 * 陈佳唯 1,2, 方军 3, 胡童远 3, 寇志华 2, 孙世惠 2, 李军锋 2, 周育森 1,2 (1. 广西医科大学, 南宁 ;2. 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京 ;3. 蚌埠医学院, 蚌埠 ) 摘要目的 : 研究参与铁硫蛋白形成的关键分子 oa 同系物 3(oA3) 在细胞中的功能, 通过重组表达 oa3 蛋白, 进而免疫制备并鉴定针对该分子的抗体方法 : 从人肺癌细胞 A549 细胞中提取 RNA,RT-PCR 扩增出 oa3 基因, 构建 oa3 基因重组原核表达载体 pqe30-oa3, 使用 IPTG 诱导蛋白表达,Westernboting 方法鉴定表达中带 His 标签的重组 oa3 蛋白, 使用镍 (Ni) 柱纯化该蛋白程序免疫大耳白兔, 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 方法测定兔血清中抗体滴度 Westernboting 法检测制备的抗体与真核表达的 oa3 蛋白结合的特异性, 并利用已制备的 oa3 蛋白抗体检测多种细胞中 oa3 内源性表达结果 : 克隆的 oa3 基因序列与理论序列相一致, 原核表达并纯化了 oa3 重组蛋白, 程序免疫大耳白兔后, 获得了高滴度高特异性的抗体血清使用所得纯化的 oa3 蛋白抗体检测到多种细胞内源性表达 oa3 结论: 成功制备针对 oa3 的多克隆抗体, 为进一步深入研究 oa3 蛋白的生物学功能奠定了基础关键词 oa3; 铁硫蛋白 ; 多克隆抗体中图分类号 :R392 文献标志码 :A 文章编号 : X(2017) DOI: /j.cnki /r PreparationandidentificationofthepoyconeantibodyagainstoAHomoogo3-thekeyfactor intheformationofiron-sufurproteins ChenJiawei 1,2,FangJun 3,HuTongyuan 3,KouZhihua 2,SunShihui 2,LiJunfeng 2,ZhouYusen 1,2.(1. GuangxiMedicaUniversity,Nanning530021,China;2.StateKeyLaboratoryofPathogenandiosecurity,Instituteof Microbioogyand Epidemioogy,Academyof Miitary MedicaScience,eijing100071, China;2.angbu MedicaUniversity,angbu233000,China) Abstract Objective:ToprepareandidentifytherecombinantpoyconeantibodyagainstoAhomoog3(oA3),akeyfactorofiroṉsufurproteinsformation,andtostudyitsfunctioninces.Methods:oA3was conedfromthecdna whichwasampifiedfromthehumanungcancera549cesbyrt-pcr,thensuḇ conedintotheprokaryoticexpressionvectorpqe30.theexpressionofhisṯaggedoa3wasinducedby IPTGandpurifiedby HisTrapafinitycoumn.Therecombinantprotein wasusedtoimmunizerabbit. Theserumantibodytiterinrabbitswasdetectedbyenzymeḻinkedimmunosorbentassay (ELISA).The specificityofantibodycombinedwithoa3proteininseverahumanceineswereidentifiedbywestern * 基金项目 : 病原微生物生物安全国家重点实验室自主课题 (No.SKLPS1431); 国家自然科学基金面上项目 (No ) 通信作者, 李军锋 :E-mai:ijunfeng2113@sohu.com; 周育森 :E-mai:zhouys01@yahoo.com 收稿日期 : boting. Resuts: The recombinant prokaryotic expression vector pqe30-oa3 was successfuy constructed.thehightiterandhighspecificityof antibodieswereobtainedinrabbitserum.western botingshowedthatthepurifiedoa3proteinwas expressedinseverahumanceines.concusion: ThepoyconeantibodyagainstoA3 wassuccess-

2 602 广西医科大学学报 2017Apr;34(4) fuyprepared,whichaidthefoundationforthefurtherresearchofoa3 sbioogicafunction. Keywords oa3;iroṉsufurprotein;poyconeantibody 铁硫蛋白是由铁原子和硫原子组成的铁硫簇, 镶嵌到各自脱辅基蛋白组成各种铁硫蛋白, 这些铁硫蛋白参与电子传递过程酶促反应感知内环境的变化而调节基因的表达等重要生理过程 [1] 铁硫蛋白生物合成是由多种蛋白组成的铁硫簇组装系统, 经过复杂有序进行的催化反应而形成的参与合成铁硫蛋白的铁硫簇组装系统的功能缺陷会影响一系列铁硫蛋白酶的形成, 从而导致严重的神经退行性病变代谢性疾病及血液系统等多种疾病 [2] 到目前为止, 已知有十几种与铁硫簇组装蛋白基因突变相关的遗传性疾病, 其中以高甘氨酸血症乳酸酸中毒以及致命的脑病和肺动脉高压为主要症状的多发性线粒体功能障碍综合征是由铁硫簇组装蛋白同系物 3 (oa3) 等基因突变, 导致线粒体代谢通路及能量产生异常而引起的一类多功能障碍综合性疾病, 主要表现为肌张力减退呼吸功能不足脑病脑畸形及神经退行性变, 寿命多不超过 15 个月 [3-4] 哺乳动物 oa3 蛋白定位于细胞线粒体, 属于从原核细胞到真核细胞中结构保守的 OLA 样蛋白成员 [5] 研究表明,oA3 可以与铁硫蛋白组装系统中的谷氧还蛋白 (gutaredoxin5,glrx5) 结合参与铁硫蛋白的合成 [6] 多个研究显示,oA3 在线粒体呼吸链能量代谢中发挥重要作用, 但有关 oa3 功能和分子机制的研究仍然甚少为了深入研究 oa3 分子在机体生存和发育中的作用, 本研究将克隆该分子基因, 进行原核蛋白表达, 免疫制备针对该蛋白的抗体, 并使用经过制备和鉴定的 oa3 抗体检测组织细胞的相应蛋白的表达, 现将结果报道如下 1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料大肠杆菌感受态 DH5α 和 M15 ProteinRuer uepusprotein Marker DNA 凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司 ;M5000DNA marker M DNA marker 购自博迈德生物技术有限公司 ; 逆转录试剂盒限制性内切酶和克隆载体 pmd18t 为 TaKaRa 公司产品 ; 相关引物由上海生物工程有限公司合成表达载体 pqe30 和 pegfp-c1 质粒肺癌细胞 A549 人胚肾细胞系 HEK-293 人肝癌细胞系 HepG2 神经母细胞瘤 SH-SY5Y 均为本研究室留存 Trizo 胎牛血清 1640 培养基双抗胰酶均购自 Invitrogen 公司 ; 镍 (Ni) 柱为 GE 公司产品 ;RI- PA 细胞裂解液抗 His 标记抗体和羊抗鼠 -HRP 以及羊抗兔的 HRP 标记抗体 PVDF 膜及发光试剂购自康维世纪生物有限公司 1.2 方法 oa3 基因克隆原核细胞和真核细胞表达载体构建使用 RT-PCR 方法获得 oa3 编码基因具体如下 : 首先根据人 oa3 全长 cdna 序列设计引物 P1:GGTACCATGGCTGCATGGAGC- CCG;P2:AAGCTTGCGTTTGGGGACAG AGG- TAAATATCC 上下游引物分别加入 KpnⅠ 和 HindⅢ 两个酶切位点而构建入真核表达载体克隆引物则在上下游分别加入 XhoⅠ 和 KpnⅠ 酶切位点具体序列为 :P1:CTCGA GACATGGCTG- CATGGAGCCCG;P2:GGTACCGCGTTTGGG- GACAGAGGTAAATATCC 培养收集人肺癌细胞系 A549 细胞,Trizo 法提取 RNA 进行逆转录, 以逆转录产物为模板进行 PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收与理论大小一致的条带, 连接入克隆载体 pmd-18t 中鉴定使用上述两个限制性内切酶 KpnⅠ 和 HindⅢ 进行酶切鉴定, 选择电泳结果显示酶切条带正确的克隆进行序列测定对序列正确的质粒同样使用 KpnⅠ 和 HindⅢ 酶切, 切下 oa3 基因, 连接到经相同酶切的原核表达载体 pqe30 中, 再次进行酶切和序列测定, 鉴定正确的原核表达载体命名为 pqe30-oa3 使用针对真核表达载体的引物, 重新进行 PCR 反应, 经过上述同样的连接鉴定和序列测定后, 对序列正确的质粒分别使用 XhoⅠ 和 KpnⅠ 酶切, 切下 oa3 基因, 连接到经相同酶切的真核表达载体 pegfp-c1 中, 再次进行酶切和序列测定, 鉴定正确的真核表达载体命名为 pegfp-c1- oa 原核表达载体的重组蛋白诱导表达将上述 pqe30-oa3 载体转化入 M15 感受态细菌中, 37 挑取克隆培养,1 100 转接入新鲜 L 培养液, 继续培养 2h 至对数生长期后, 加入终浓度

3 陈佳唯, 等. 铁硫蛋白形成的关键分子 oa 同系物 3 蛋白抗体制备及鉴定 603 1μmo/LIPTG 诱导 4h, 收集细菌,1 SDS-Loaḏ ingbufer 裂解细菌,100 变性 10min 后进行胶浓度为 12% 的 SDS-PAGE 凝胶电泳经过考马斯亮蓝染色和脱色, 观测电泳凝胶上的条带, 检测细菌裂解产物中的蛋白表达情况重组蛋白鉴定使用 Westernboting 方法, 具体步骤为将表达裂解产物进行 15% SDS- PAGE 电泳, 半干法转移至 PVDF 膜上, 封闭 1h, 先后分别与抗 His 标记抗体 (1 1000) 免疫获得兔血清 (1 200) 杂交经过 4 次 (8 min/ 次 ) 洗涤后, 用 HRP- 羊抗小鼠 IgG/HRP- 羊抗兔 IgG( ) 共孵育, 洗膜,ECL 显色后显影定影, 在胶片上获得相应的条带, 分析结果重组蛋白表达形式分析和蛋白纯化蛋白表达形式分析是通过培养和诱导 oa3 转化的 M15 菌, 收集细菌, 进行超声裂解,SDS-PAGE 电泳分析裂解上清和沉淀中的蛋白表达, 以判定表达形式为上清或包涵体形式蛋白纯化则选择目标蛋白表达量大的克隆菌, 转接入 500 ml 培养液, 进行大量诱导表达,IPTG 浓度和诱导时间同前, 收集诱导菌裂解缓冲液 (20 mmo 磷酸钠缓冲液, 500mmoNaC,pH=7.8) 进行洗涤后重悬细菌, 冰浴中超声裂解,4 条件下 10000r/min 离心 10 min, 收集超声上清, 利用 Ni 柱亲和层析法纯化目的蛋白, 使用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱蛋白纯化使用 PS 透析出上述纯化蛋白中的咪唑动物免疫使用购自军事医学科学院动物中心雄性大耳白兔,SPF2 动物培养室培养取纯化的 40μgoA3 重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合, 搅拌制成乳化剂, 免疫大耳白兔, 皮下多点注射, 间隔 3 周后分别加强免疫两次, 加强免疫使用弗氏不完全佐剂 3 次免疫 14d 后, 抽取兔子血液, 分离血清, 以备后续抗体效价和特异性检测制备的 oa3 抗体效价测定纯化和结合特异性检测抗体效价检测则使用间接 ELISA 方法测定抗体滴度具体为 :1μg/mL 低温包被 12h, 经过牛血清白蛋白非特异结合位点封闭使用梯度稀释的抗体, 结合 1h, 经过洗涤,HRP 标记的二抗结合 1h 后再次洗涤, 显色后, 酶标仪测定 OD450 [7] 值抗体纯化使用饱和硫酸铵方法抗体结合特性实验是检测纯化的抗体与真核表达 oa3 蛋白的结合能力, 首先将构建的 pegfp- C1-oA3 和对照载体 pegfp-c1 转染入接有 HEK-293 细胞的六孔板,48h 后荧光显微镜观测绿色荧光检测转染效率 72h 后收集细胞, 每种细胞收集个, 加入 300μL 细胞裂解液及 1% 的蛋白酶抑制剂, 冰上放置 30 min, 间以颠倒混匀数次离心收集上清, 定量后取 80μg 蛋白, 裂解变性后上样于 SDS-PAGE 胶, 使用 Westernboting 方法检测纯化抗体与细胞中表达的 EGFP-oA3 融合蛋白的结合情况, 判定制备抗体与真核表达 oa3 蛋白特异性结合性质检测多种细胞中 oa3 的表达人肝癌细胞系 HepG2 神经母细胞瘤 SH-SY5Y 肺癌细胞系 A549 人胚肾细胞 HEK-293 细胞的培养使用含 10% 胎牛血清 1% 双抗的 1640 培养基收集细胞并裂解, 随后进行 SDS-PAGE 电泳,Westernboṯ ting 方法检测细胞中 oa3 内源性表达 2 结果 2.1 oa3 基因克隆及重组表达载体鉴定 oa3 基因克隆结果将提取的 A549 细胞 RNA, 进行了逆转录, 以 cdna 产物为模版进行 PCR 扩增, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析结果显示, 在 350bp 左右出现一条特异性条带, 与预期的 oa3 大小相近 ( 图 1A), 回收上述 PCR 扩增产物连接入 pmd-18t 载体, 酶切双重鉴定结果 ( 图 1) 与理论一致, 由上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定, 插入的 DNA 片断与 Genebank 的 oa3cd- NA 序列一致含 oa3 基因重组原核和真核表达载体的构建及鉴定结果将 oa3 基因分别插入 pqe30 载体和 pegfp-c1 载体使用上述限制性内切酶对提取的不同克隆菌质粒进行酶切鉴定, 电泳分析结果可见两条均为 350bp 的条带, 鉴定结果 ( 图 1C) 与理论推测一致经过序列测定, 结果提示成功构建了 oa3 基因原核表达载体 pqe30-oa3 和真核表达载体 pegfp-c1-oa3 2.2 oa3 重组蛋白表达情况和表达形式分析经鉴定正确的原核表达载体 pqe30-oa3 转化至大肠杆菌 M15 感受态细胞, 经 IPTG 诱导, SDS-PAGE 电泳结果显示在裂解上清中可见与理论大小一致的新生条带, 分子量大小约 12ku; 形式分析结果显示在裂解上清和沉淀中均有一定的表达, 见图 2

604 广西医科大学学报 2017Apr;34(4) A:oA3PCR 产物电泳结果 (1 2: 两组引物扩增的 oa3 片段电泳条带 );:pmd18t-oa3 的鉴定 (1 2: 两个 PCR 产物片段插入 pmd18t 后分别使用 KpnⅠ/HindⅢ 和 XhoⅠ/KpnⅠ 酶切 );C: 表达载体酶切鉴定 (1 2:pQE30-oA3/pEGFP-C1- oa3 分别用

4 604 广西医科大学学报 2017Apr;34(4) A:oA3PCR 产物电泳结果 (1 2: 两组引物扩增的 oa3 片段电泳条带 );:pmd18t-oa3 的鉴定 (1 2: 两个 PCR 产物片段插入 pmd18t 后分别使用 KpnⅠ/HindⅢ 和 XhoⅠ/KpnⅠ 酶切 );C: 表达载体酶切鉴定 (1 2:pQE30-oA3/pEGFP-C1- oa3 分别用 KpnⅠ/HindⅢ 和 XhoⅠ/KpnⅠ 酶切 );M:M5000DNA Marker 图 1 oa3 基因克隆和表达载体构建 A: 蛋白诱导表达 (M:ProteinRuer;1~4:pQE30-oA3 诱导 4h;5:pQE30-oA3 未诱导 );: 蛋白表达形式分析 (M:uepus Protein Marker;1: 超声上清 ;2: 超声沉淀 ); 目的蛋白条带如箭头所示图 2 原核重组蛋白表达检测及表达形式分析 2.3 原核表达 oa3 蛋白的鉴定和纯化结果 oa3 重组蛋白鉴定使用 Westernboting 方法, 用抗 His 单克隆抗体进行抗体杂交检测, 结果显示表达的蛋白含有 His 标签 ( 图 3A) 根据 oa3 基因与 His 正确融合的结果和电泳新生蛋白的大小, 可知表达的蛋白为含 His 标签的 oa3 蛋白大量诱导获得足量的 oa3 融合蛋白, 利用 Ni 柱亲和层析法纯化目的蛋白, 咪唑浓度由低到高 (50 mmo/l 100 mmo/l 150 mmo/l 200 mmo/l 300 mmo/l 500 mmo/l) 梯度洗脱, 在 200mmo/L 咪唑浓度下洗脱下目的蛋白, 结果见图 oa3 抗体制备和鉴定结果免疫大耳白兔, 取耳缘静脉血, 分离血清, 使用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测其中的抗体滴度, 结果抗体效价在 ~ ( 图 4A) 结合性鉴定另外使用 Westernboting 的方法, 杂交结果显示制备的抗体可以与原核表达的 oa3 蛋白结合 ( 图 4), 而不与不表达蛋白的空载体对照细菌裂解产物结合为进一步鉴定制备的抗体与真核表达 oa3 蛋白结合的特性, 使用构建的 oa3 真核表达载体 pegfp-c1-oa3, 将其与对照载体 pegfp-c1 分别瞬时转染入 HEK-293 细胞中 48h 荧光显微镜下观测细胞中荧光表达情况, 细胞转染效率较高 ( 达 70% 以上 )( 图 4C), 继续培养 72h 后收集裂解细胞, 用 Westernboting 方法进行 oa3 蛋白和抗体鉴定, 结果检测到真核表达 EGFP-oA3 及内源性 oa3 蛋白表达的条带 ( 图 4D) 2.5 oa3 在各细胞系中的表达检测结果选择人的神经细胞 SH-SY5Y 肺癌细胞系 A549 肝癌细胞系 HepG2 和人胚肾细胞系 HEK- 293 作为检测对象, 用制备纯化的 oa3 抗体通过 Westernboting 检测各个细胞系中该蛋白的表达情况, 结果显示在各细胞系均检测到 oa3 蛋白表达, 见图 5

uep uspr o t e i n Ma r ke r; 1:超声上清; 2:穿柱液; 3:洗脱剂; 4~9:不同浓度的咪唑洗脱),在 200mmo 唑浓度下洗脱下目的蛋白条带如箭头所示图 3 o A3 蛋白原核表达鉴定和纯化 A:间接 ELI SA 检测抗体效价效价;.

转染效率检测 pqe30 ( 200); D:真核表达的 o A3 蛋白与制备抗体的结合分析(M: uep uspr o t e i n Ma r ke r; 1:转染 pegfp -C1; 2:转染 pegfp - o A3) 图 4 抗体效价及特异性检测

5 陈佳唯,等.铁硫蛋白形成的关键分子 o A 同系物 3 蛋白抗体制备及鉴定 605 A: o A3 重组蛋白鉴定( 1:未诱导对照; 2:诱导 4h),通过对蛋白的特异性鉴定发现成功纯化出目的蛋白条带如箭头所示; : /L 咪蛋白表达纯化(M: uep uspr o t e i n Ma r ke r; 1:超声上清; 2:穿柱液; 3:洗脱剂; 4~9:不同浓度的咪唑洗脱),在 200mmo 唑浓度下洗脱下目的蛋白条带如箭头所示图 3 o A3 蛋白原核表达鉴定和纯化 A:间接 ELI SA 检测抗体效价效价;. 制备的抗体与原核表达的 o A3 结合实验(M: uep uspr o t e i n Ma r ke r; 1: pqe30 空载体细菌裂解产物对照; 2: -o A3 原核表达蛋白); C:真核表达载体 pegfp -o A3 和对照载体 pegfp -C1 转染效率检测 pqe30 ( 200); D:真核表达的 o A3 蛋白与制备抗体的结合分析(M: uep uspr o t e i n Ma r ke r; 1:转染 pegfp -C1; 2:转染 pegfp - o A3) 图 4 抗体效价及特异性检测 3 讨论铁硫簇由一定数目铁离子和硫离子组成,可以作为电子传递蛋白质的辅基,参与能量转移,也可作为某些酶的活性基团参与各种生化反应各种铁硫 1:肝癌细胞系 HepG2; 2:人胚肾细胞 HEK293; 3:人肺癌细簇与脱辅基蛋白结合成多种铁硫蛋白,铁硫蛋白是图 5 各细胞系中 o A3 的表达检测修复 trna 的修饰等多种生物学功能铁硫蛋白胞 A549; 4:人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 多种生化过程的关键酶,在细胞中完成 DNA 复制

6 606 广西医科大学学报 2017Apr;34(4) 结构功能异常与合成障碍均可引起机体代谢异常或功能紊乱, 甚至导致死亡 [8] oa3 属于 oa 蛋白家族, 是铁硫蛋白组装的关键分子之一 [5] 研究表明,oA3 作为铁硫蛋白组装因子可以促进铁硫四聚体 (4Fe-4S) 插入线粒体蛋白如硫辛酸合成酶和琥珀酸脱氢酶 [9] 有文献报道以 oa3 第 2 个外显子发生腺嘌呤单碱基复制导致移码突变所致的蛋白表达缺失可引起多发性线粒体功能障碍综合征 [10] 该疾病以丙酮酸脱氢酶复合物和酮戊二酸脱氢酶复合物功能的减退及组成呼吸链的复合物 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 功能障碍为主要特征的疾病患者主要的症状包括一个正常的生长周期后出现严重的神经退行性变, 并伴随有脑白质营养不良心肌病和视觉神经萎缩, 同时能引起婴儿期的高甘氨酸血症乳酸酸中毒以及致命的脑病和肺动脉高压已有的研究虽然对 oa3 功能具有提示作用, 但其分子的功能研究仍不清楚本研究探索 oa3 分子在细胞和机体组织中的功能鉴于该分子研究较少, 市场上少有可以应用的检测抗体, 因此, 本研究制备针对该蛋白的多克隆抗体, 首先克隆了 oa3 基因, 将该基因插入原核表达载体 pqe30 中在大肠杆菌进行诱导表达后, 对重组表达的 oa3 蛋白使用抗标签 His 抗体进行了鉴定, 证明转化了 pqe30-oa3 的大肠杆菌中可以表达 6 个 His 融合的 oa3 蛋白大量诱导转化细菌后收集裂解, 使用用于纯化 His 标签重组蛋白的 Ni 柱, 纯化细菌裂解产物中的重组 oa3 蛋白, 进而使用纯化蛋白免疫大耳白兔, 经过 3 次免疫后, 取血分离血清, 间接 ELISA 检测血清中抗体滴度,ELISA 检测结果显示兔血清中抗 oa3 抗体效价为 ~ 使用 Western boting 法检测制备的抗体与原核和真核表达的 oa3 蛋白结合情况, 结果检测到相应的条带, 证明制备的抗体具有较好的特异性为进一步探索 oa3 在多种细胞中的功能, 本研究选择人脑肾肝和肺组织细胞建立的细胞系为研究对象, 使用制备的抗体检测细胞中的蛋白表达, 结果表明 oa3 蛋白在上述细胞中内源性表达, 提示 oa3 在人细胞线粒体能量代谢中可能发挥广泛且基础的作用, 因此有必要对其功能进行深入的研究综上所述, 本研究克隆构建 oa3 原核表达载体, 表达并纯化了 oa3 蛋白, 经过免疫, 成功制备了高滴度和高特异性的 oa3 抗体, 为后续对该分子进行的功能研究奠定了基础参考文献 : [1] 郑华珍, 赵炜, 刘新光. 铁硫蛋白的生物合成及相关疾病 [J]. 中国生物化学与分子生物学报 2015,31 (6): [2] 杜璟, 李艳纯, 任雪营, 等. 真核细胞中铁硫簇的组装机制及相关铁硫蛋白疾病 [J]. 中国细胞生物学学报, 2015,37(9): [3] CAMERONJM,JANER A,LEVANDOVSKIY V,et a.mutations in iroṉsufur custer scafod genes NFU1andoA3causeafatadeficiencyof mutipe respiratorychainand2-oxoaciddehydrogenaseenzymes [J].AmJHum Genet,2011,89(4): [4] AKERPR,FRIEDERICH MW,SWANSON MA,et a.variant nonketotic hypergycinemiais caused by mutationsinlias,oa3andthenovegeneglrx5 [J].rain,2014,137(2): [5] ZhouY,CaoJ,Wan,eta.hoA,novenoṉcassicasecretedproteins,beongingtodiferentoAfamiywithfunctionadivergence[J].MoCeiochem, 2008,317(1): [6] LI H,OUTTEN CE.MonothioCGFSgutaredoxins andoa-ikeproteins:[2fe-2s]bindingpartnersini- ronhomeostasis[j].iochemistry,2012,51(22): [7] 张和平, 岳喜庆, 冯巧萍, 等. 饱和硫酸铵法提取血清中 IgG 最佳条件的研究 [J]. 中国乳品工业,2006,34(1): 1-8. [8] 郑华珍, 赵炜, 刘新光. 铁硫蛋白的生物合成及相关疾病 [J]. 中国生物化学与分子生物学报,2015,31(6): [9] 钱忠明. 脑铁代谢和神经变性性疾病 [J]. 生理科学进展,2002,33(3): [10]CameronJM,JanerA,LevandovskiyV,eta.Mutations iniroṉsufurcusterscafodgenes NFU1andoA3 causeafatadeficiencyof mutiperespiratorychain and2-oxoaciddehydrogenaseenzymes[j].theamericanjournaofhumangenetics,2011,89(4): ( 本文编辑 : 韦所苏 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽