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- 灌崎 卫
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1 生物工程学报 Chin J Biotech 2009, January 25; 25(1): journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN cjb@im.ac.cn 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 动物及兽医生物技术 Ghrelin 张爱玲 1,2, 张丽 1,3, 陈宏 1,4, 张良志 1, 蓝贤勇 1, 张春雷 1,4, 张存芳 1, 朱泽轶 1, , , , , : 本研究通过 RT-PCR 方法从秦川牛皱胃胃底腺 mrna 扩增获得 Ghrelin 基因的 cdna 序列, 克隆至 pgm-t 载体获得重组质粒 pgh-t1, 并进行序列测定 将测序正确的 cdna 序列定向克隆到 pet32a (+), 构建表达载体 pgh-32, 并转化 BL21(DE3) 大肠杆菌 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析表明秦川牛 Ghrelin 基因在大肠杆菌中获得高效表达, 可溶性分析表明 Ghrelin 融合蛋白以可溶性和包涵体 2 种形式表达 Western blotting 初步证实了所获的融合蛋白是特异的 镍柱亲和层析法分离纯化融合蛋白并皮下注射家兔后获得了融合蛋白的抗体血清, ELISA 检测血清的稀释效价在 1: 将获得的血清与黄牛下丘脑弓状核进行免疫组化试验, 进一步印证了重组蛋白表达产物是有活性的, 为进一步研究黄牛 Ghrelin 的功能及其对黄牛生长发育和脂肪沉积奠定了基础 : 黄牛, RT-PCR, Ghrelin, 克隆, 基因表达 1,5 Cloning, prokaryotic expression of cattle Ghrelin gene and biological activity detection of the expressed protein Ailing Zhang 1,2, Li Zhang 1,3, Hong Chen 1,4, Liangzhi Zhang 1, Xianyong Lan 1, Chunlei Zhang 4, Cunfang Zhang 1, and Zeyi Zhu 1 1 College of Animal Science and Technology, Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Northwest A & F University, Yangling , China 2 College of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei , China 3 Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang , China 4 Institute of Cellular and Molecular Biology, Xuzhou Normal University, Xuzhou , China 5 Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing , China Abstract: The cdna of cattle Ghrelin gene was amplified from abomasum fundic gland mrna of Qinchuan Cattle by RT-PCR. PCR product was cloned into the T vector pgm-t to construct pgh-t1 for sequencing. Then the cdna was subcloned into the prokaryotic expressing plasmid vector pet32a (+) and transformed into host Escherichia coli strain BL2l (DE3) for expression. The expression of pgh-32 mature Ghrelin protein was induced by IPTG and was identified by SDS-PAGE. The expression product was Received: July 12, 2008; Accepted: October 20, 2008 Supported by: National 863 Program of China (No. 2006AA10Z197), National Natural Science Foundation of China (No ), National Key Technology R&D Program (No. 2006BAD01A10-5), Sustaining Program for Topnotch Persons of Northwest A&F University (No ), Natural Science Foundation of Xuzhou Normal University (No. 2003XY234). Corresponding author: Hong Chen. Tel: ; Fax: ; chenhong1212@263.net 国家 863 计划 (No. 2006AA10Z197), 国家自然科学基金 (No ), 国家支撑计划 (No. 2006BAD01A10-5), 西北农林科技大学拔尖人才支持计划 (No ) 和徐州师范大学专项基金 (No. 2003XY234) 资助
2 24 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 observed with soluble protein and inclusion body. Western blotting showed that the recombinant protein was recognized by his-antibody specifically. The protein was purified by Ni-NTA column and was used to inject rabbits to obtain polyclona antibody. ELISA result showed that the antibody titer was 1: The immunohistochemistry test between the hypothalamus arcuate nucleus and the antibody showed that fusion protein had biological activity. This will provide a basis for further study on the biological function of Ghrelin protein to growth and development and fat deposition of cattle. Keywords: cattle, RT-PCR, Ghrelin, cloning, gene expression,, (GH secretagoguses, GHSs) [1], Ghrelin (GHSR), [2] Ghrelin, Arvat Ghre1in, [3] Ghrelin 4 3 Ghrelin,, Ghrelin- [2] Ghrelin, [4], Tschop Ghrelin, [5] Ghrelin, Ghrelin, [6] Ghrelin,,, Ghrelin,, Ghrelin,,, Ghrelin, Ghrelin,,, Ghrelin Ghrelin, Ghrelin [7 10], Ghrelin, Ghrelin Ghrelin,,, Ghrelin,, Ghrelin, Ghrelin 1 材料与方法 1.1 菌株 BL21(DE3) DH5α 1.2 酶与试剂 T4 DNA (BamH Hind ) Taq DNA Trizol MBI DNA l kb Marker Marker I pgm-t pet32a(+), protein marker TaKaRa DNA, DNA 1.3 秦川牛血液 DNA 的提取 DNA [11] 1.4 引物的设计与合成 GenBank Ghrelin preproghrelin mrna, Ghrelin cdna RT-PCR Sangon ( 1)
3 : Ghrelin 25 表 1 研究中所用引物 Table 1 Primers used in the study Name Sequence (5-3 ) Feature G-1-H ATggatccATGCCCGCCCCGTGGACC G-4 ATaagcttTCACTCGTTAGCCAGGGTTTCTTCAG Italic: protection base; lowercase: BamHⅠ site; underline: initiation codon Italic: protection base; lowercase: Hind III site; underline: reverse complemented sequence of the 3 end of exon 3; the other base were the reverse complemented sequence of the exon RT-PCR 克隆秦川牛 Ghrelin 基因的编码区 Trizol mrna, RNA OD 260/280, 1.8~2.0 RT-PCR 367 bp Ghrelin cdna pgm-t T4 DNA 22, DH5α, PCR, pgh-t1 1.6 秦川牛 Ghrelin 基因原核表达质粒的构建以及在大肠杆菌 BL21(DE3) 中的表达 pgh-t1 pet32a(+) BamHⅠ Hind Ⅲ, 351 bp, BL21(DE3) PCR,, BamHⅠ Hind Ⅲ, pgh-32 5 ml 100 mg/l LB 37 12~14 h, 1:100 OD 0.6, IPTG 1 mmol/l, 8 h, pet32a(+), r/min 10 min, SDS, 10 min, 10 μl SDS-PAGE 1.7 大肠杆菌表达 Ghrelin 基因目的蛋白的可溶性分析 IPTG (2 h 4 h 6 h), pgh-32 6~8 h, pgh-32 His 351 bp (11 kd ) 31 kd pet32a(+) His, 20 kd His-Ghrelin, PBS,, (PMSF), 4 30 min, ( ) SDS-PAGE 1.8 大肠杆菌表达 Ghrelin 基因目的蛋白抗体制备与特异性鉴定 Ghrelin ELISA ml, 4, 1 2 2, μg/ 1 kg 2, 2 4 1, 20 ml, ELISA 3,,, 37 1 h, HRP IgG, ~1 h, TMB, h 450 nm, OD, OD 2.1, Western blotting SDS-PAGE,, S 8 ml BSA/TBS, PBS 1: h, HRP IgG 1 h, DAB, Ghrelin,, 4%, 3~4 d,, His- Promega, ABC
4 26 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 2 结果 2.1 秦川牛 Ghrelin 基因编码区 DNA 的 RT-PCR 扩增结果和表达载体构建 RNA Ghrelin cdna 1 pet-32, pgh-32 BamHⅠ Hind Ⅲ 6000 bp 367 bp ( ) ( 2), pgh-32, pgh-32, Ghrelin, (20 kd His 11 kd, 3) PBS 3, 80 μl 10 mg/l 40 μl 100 nml/l PMSF( ), 4 30 min, g 15 min, ( ) SDS-PAGE,, His-Ghrelin,,, His-Ghrelin ( 4) 图 1 Ghrelin 基因 mrna 示意图 (A) 和皱胃胃底腺组织 RNA(B) Fig. 1 Construction of Ghrelin gene mrna (A) and the agarose electrophoresis of RNA from the cattle abomasum fundic gland (B). 图 3 pgh-32 表达产物 SDS-PAGE 图 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of His-Ghrelin fusion protein in pgh-32. 1: uninduced pet32a+; 2: induced pet32a+; 3: uninduced pgh-32; 4 6: induced pgh-32 for 2, 4 and 6 h; 7: protein marker, from upper to bottom: 99, 66, 44, 29, 20, and 14 kd. 图 4 pgh-32 表达产物的可溶性表达分析 Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the solubility of His-Ghrelin fusion protein in pgh-32. 1: anabacteria; 2: supernatant fluid; 3 6: urea inclusion body. 图 2 重组质粒 pgh-32 Bam H I 和 Hind III 酶切图谱 Fig. 2 The BamH I and Hind III pattern analysis of the recombinant plasmid of pgh-32. 1: 1kb marker, from upper to bottom: 10 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb; 2: the fragment of pgh-32 digested by BamHⅠand Hind Ⅲ; 3: markerⅠ, from upper to bottom: 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp. 2.2 秦川牛 Ghrelin 基因的诱导表达与可溶性分析 pet32a(+) pgh-32 BL21(DE3), SDS-PAGE, 31 kd 2.3 His-Ghrelin 融合蛋白抗体制备及 Western blotting ELISA OD 450 1:12 800, ( 5) , OD 2.1, 1: ( ),,
5 : Ghrelin 27 His,,,, 6, ( ) 2, 图 7 秦川牛弓状核与血清抗体免疫组织化学反应结果 ( 苏木精复染, 放大倍数 400) Fig. 7 The immunohistochemistry of arcuate nuclei and polyclonal antibody (stained with haematoxylin repeatly, the enlargement factor of 400). A: positive result; B: negative control. 3 讨论 图 5 His-Ghrelin 融合蛋白免疫兔血清抗体效价测定 Fig. 5 Titration of the immunized rabbit serum to His-Ghrein fusion protein dilutions. 图 6 His-Ghrelin 融合蛋白的免疫印迹 Western blotting 鉴定 ( 原核表达 ) Fig. 6 Identification of His-Ghrelin fusion protein by Western blotting (prokaryotic expression). 1: protein marker, the same to the Fig 3; 2: the immunoblot of positive serum and protein; 3: the immunoblot of negative serum and protein. 2.4 免疫组织化学结果 7, ( 7A), ( 7B), Ghrelin,, Ghrelin GHSs, Ghrelin GH, Ghrelin GH 2, GH, GHRH, GH [2] Ghrelin, Ghrelin- Ghrelin, - Ghrelin, [12,13],,,, Ghrelin,,,,,,,,,,
6 28 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 Ghrelin,,, Ghrelin,, Ghrelin,,, Ghrelin,, Ghrelin, Ghrelin,,,,,,,, Ghrelin, Western blotting,,,,, Ghrelin,, REFERENCES [1] Guan XM, Yu H, Palyha OC, et al. Distribution of mrna encoding the growth hormone secretagogue receptor in brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res, 1997, 48(1): [2] Kojima M, Hosoda H, Date Y, et al. Ghrelin is a growth-hormone releasing acylated peptide from stomach. Nature, 1999, 402: [3] Arvat E, Di Vito L, Broglio F, et al. Preliminary evidence that Ghrelin, the natural GH secretagogue (GHS)-receptor ligand, strongly stimulates GH secretion in humans. J Endcrinol Invest, 2000, 23: [4] Broglio F, Koetsveld Pv P, Benso A, et al. Ghrelin is inhibited by either somatostatin or cortistatin in humans. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(10): [5] Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghrelin induces adiposity in rodents Nature, 2000, 407: [6] Asakawa A, Inui A, Kaga T, et al. Ghrelin is an appetite-stimulatory signal from stomach with structural resemblance to motilin. Gastroentemlogy, 2001, 120: [7] Yang LY, Yang WY, Zhao YC, et al. Cloning and expression of Ghrelin gene in pig. Chin J Vet Sci, 2005, 25(6): ,,,, Ghrelin., 2005, 25(6): [8] Yang LY, Yang WY, Ji FJ, et al. Cloning of Ghrelin gene and its mrna distribution in pig. J Jilin Agri Univ, 2004, 26(1): ,,,. Ghrelin mrna,, 2004, 26(1): [9] Wu ZF, Xiang YW, Shi ZD, et al. Construction of the plasmid of Ghrelin gene and the function on pig growth. J Huazhong Agri Univ, 2006, 25(3): ,,,. Ghrelin,, 2006, 25(3): [10] Lv DY, Cao GF, Bai CL, et al. Cloning and analysis of the cdna of Ghrelin gene in sheep. Acta Vet Zootech Sin, 2006, 37(8): ,,,. ghrelin cdna., 2006, 37(8): [11] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning. 3rd ed. Beijing: Science Press, J, DW... :, [12] Nakazato M, Murakami N, Date Y, et al. A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature, 2001, 409(6817): [13] Wren AM, Small CJ, Ward HL, et al. The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion. Endocrinology, 2000, 141(11):
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