西安交通大学学报 医学版 第 卷 巨噬细胞表面特异性高表达 然而组织巨噬细胞的极性和其功能尚不明确 现阶段的研究关键是找到细胞表面标记物并开发巨噬细胞标记物的特异性探针 抗体和抗体衍生物是研究细胞表面受体最常用的方法 特异性抗体不但可以用于基础实验研究和临 ' 床标本检测 而且可以作为受体的在体示踪

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 靶向巨噬细胞膜蛋白 特异性纳米抗体的构建和筛选 郑 芳 罗思羽 韩 燕 宁启兰 温玉荣 西安交通大学 医学部基础医学院 西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室 陕西西安 # 生命科学与技术学院 陕西西安 $% 摘要 目的 构建 &'"!(!( $&$ 特异性纳米抗体 以期作为巨噬细胞的分子探针 方法 用 &$ 重组蛋白对羊驼进行免疫 分离血液中的淋巴细胞 利用噬菌体展示技术 构建噬菌体展示文库 经过连续 次生物淘筛获得与 &$ 蛋白结合的噬菌体 经测序和基因比对所得 &)) 序列 用 *+,-. 法筛选出抗 &$ 的高亲和力纳米抗体 并用 &$ 稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力 结果 成功构建了插入率为 / 库容量为 0 的噬菌体表达文库 经过克隆筛选获得 # 个 &$ 阳性单克隆 经测序获得 1 个不同的 &)) 基因 将这些基因克隆至原核表达体系 表达和纯化后获得了高纯度的 &$ 纳米抗体 其中 % 的亲和力最高 并且可以与 &$ 稳定表达细胞系结合 结论 成功构建并筛选了特异性 高亲和力的 &$ 纳米抗体 以期用于检测巨噬细胞表面 &$ 的表达和构建特异性分子探针 关键词 &$ 纳米抗体 噬菌体展示文库 生物淘筛 亲和力鉴定中图分类号 % 文献标志码. #1!"# $%& $ $" % )* +2-'! ). 3, 4'( 5* 3!' :"6-(;"")"(-""""6 "+66;* :6 """"("""78 # -(;+;"-""" (78 $% ''##%""#$ %$"' ######&(" )" " #" #*" ) #%$&("##%$&')+#",#"%--,#&')"""%$##./0$(#%$& ## ')" # 1%$& ( " )"&0 # ) )## ##"& #%$#),#"""##"",#& 0 1 %$ ")""" "& " " %$ ) *"./0$('% )" #" %$& ## ##""#" %$##" %) "## &0#)#"#" & ( ) %$ " " 组织巨噬细胞在炎症发生发展的过程中起着关键的作用 在早期炎症的激活 炎症信号的扩大 肿瘤 逃逸等病理过程中占有重要的地位 &'"'! (!( &$ 在组织固有 收稿日期 #'1' 修回日期 #'%'$ 基金项目 国家自然科学基金资助项目 11 陕西省自然科学基础研究计划项目 7991$ -!6""(!6(-""! ; 11"!6(-""""6<66 ; -<6:"7991$ 通讯作者 温玉荣 *'(!6"!"! 优先出版 ="="(#%%#%#$(#''!"!

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 巨噬细胞表面特异性高表达 然而组织巨噬细胞的极性和其功能尚不明确 现阶段的研究关键是找到细胞表面标记物并开发巨噬细胞标记物的特异性探针 抗体和抗体衍生物是研究细胞表面受体最常用的方法 特异性抗体不但可以用于基础实验研究和临 ' 床标本检测 而且可以作为受体的在体示踪剂 骆驼属动物体内存在缺失轻链的天然重链抗体 这种抗体只包含一个重链可变区 &)) 和两个常规的 ) 与 ) 区 用噬菌体文库筛选和单克隆表达获得 &)) 单域抗体 也称为纳米抗体 "(("' ';6" $ 纳米抗体的大小仅是普通, 抗体的十分之一 具有高稳定性 高亲和力及容易标记等优点 通过 余年的研究 纳米抗体作为检验 治疗等特有的工具应用于 多个研究领域 本研究针对小鼠巨噬细胞表面受体 &$ 构建纳米抗体 以期用于靶向结合组织巨噬细胞的分子探针 * 材料与方法 ** 材料 小鼠 &$ 重组蛋白和 '"' ')< 抗体由本实验室表达纯化 )*$)*# 质粒 和 5# 菌株由本实验室保藏 淋巴分离液 +6" 购自挪威.'-"( 公司 6>( 试剂 反转录试剂盒 -!"6-6 ":"6" 6' 6" 购自美国,:6" 公司. 聚合酶和 < 购自瑞士 " 公司 蛋白标准分子量购自加拿大 "6" 公司 $. 连接酶以及限制性内切酶 和 % 购自荷兰 5"'!6 公司 质粒小提试剂盒 <( 胶回收试剂盒 "(*6 和. 纯化试剂盒 4,.?!=< <!6; 购自德国 4" 公司. 上样缓冲液和. 6="6 均购自日本 "= 公司 '!",.'.< 购自英国.' 公司 金属螯合亲和色谱镍柱购自美国 * 公司 其他试剂均为国产或进口分析纯 *+ 方法 *+* 获得羊驼免疫血清中抗 &)) 基因 用 &$ 重组蛋白免疫羊驼 1 次 每次间隔 周 获得抗血清 + 利用淋巴分离液从全血中分离出淋巴细胞 用 6>( 法提取淋巴细胞. 经过反转录获得. 第 次 < 用于获得 &)) 基因 用淋巴细胞. 作为 < 模板 加入 <6"6( <6"6( 引物 <. 聚合酶进行 < 反应 + 琼脂糖胶鉴定 < 结果 按照. 凝胶回收试剂盒说明书对 &)) 基因条带进行 回收并测定胶回收. 浓度 第 次巢式 < 用于插入酶切位点 使用 <6"6.#* 和 <6"6 作为引物 引物中插入酶切位点 和 取少量 < 产物用 + 琼脂糖胶鉴定结果 获得建库用 &)) 大量. 并按照说明书用. 纯化试剂盒纯化 < 产物 *++&)) 基因与噬菌体载体 )*$ 的链接 转染和文库的表达 将第 次 < 获得的. 产物 1 和 )*$ 噬菌体表达载体 用 和 限制性内切酶进行酶切 + 琼脂糖胶鉴定酶切结果 再加入. 连接酶将. 和 )*$ 载体置于 水浴中过夜连接 随后按照说明书用. 纯化试剂盒纯化重组质粒 通过电转染将重组质粒转入过夜培养的 大肠杆菌感受态细胞中 取少量菌液涂布在 + 固体培养皿表面 培养箱中过夜培养 细胞 根据平板上的菌落数计算出库容量 随机挑选 个克隆 用 < 和, 引物进行 < 扩增 经过 + 琼脂糖胶鉴定确定噬菌体展示文库的插入率 *+, 生物淘筛 具体操作为在 %# 孔板的 孔中分别包被或者不包被 &$ 重组蛋白 标记为 A 或 B 随后将噬菌体文库分别与 个孔在室温进行的孵育 第 轮生物淘筛用 <- 缓冲液洗涤多次后 去除不能与 &$ 结合的噬菌体 剩下能够与 &$ 结合的噬菌体 使用 *. 溶液将其溶解下来并与 "("6" 同时感染 宿主菌 经过夜培养后 进入下一轮新的筛选 过程同上 *+*+,-. 法检测生物淘筛富集率 用脱脂奶粉封闭 &$ 包被的 *+,-. 平板 分别加入第 第 第 轮生物淘筛的噬菌体培养液 随后加入辣根过氧化物酶 '"')< 抗体 室温孵育 最后加入酶底物.- 和 ) 2 采用分光光度计. $1 测定 *+,-. 显色结果 计算每一轮淘筛的 &$ 特异性噬菌体富集率 *+-<*'*+,-. 法鉴定抗 &$ 阳性克隆 从第 第 第 轮生物淘筛的 细菌培养皿中随机挑选克隆 置于 + 培养基培养至细菌指数生长期后加入,< 诱导剂 过夜表达蛋白 第 天去除每个克隆的培养基上清 裂解 细胞后将细胞裂解液加入提前用脱脂奶粉封闭过的 &$ 包被的 *+,-. 平板 再加入 ').!" 单克隆抗体 室温孵育 最后加入碱性磷酸酶标记 '!",. 和碱性磷酸酶底物 采用分光光度计. $1 测定 *+,-. 显色结果 对吸光度值高于阴性对照 倍以上的阳性克隆进行测序 根据测序结果按照!"!

3 期 郑 芳 罗思羽 韩 燕 等 靶向巨噬细胞膜蛋白 &$ 特异性纳米抗体的构建和筛选 % #, 法将纳米抗体进行比对和分组 从互补确定区 (""6'""66" 相同组中选取表达量高的有代表性的纳米抗体进行后续实验 *+. 纳米抗体的大量表达和纯化 用 和 % 限制性内切酶对含有纳米抗体基因的 )*$ 质粒进行双酶切反应 将所得目的基因片段插入 )*# 空质粒载体后 转染 1 5# 感受态大肠杆菌细胞 将 5# 在 + 培养基中培养至生长指数期 用,< 诱导表达纳米抗体 过夜培养后离心收集 5# 细胞 获得含有纳米抗体的裂解液 用金属螯合亲和色谱 (>" "( ;66,. 亲和层析法进行初步纯化 用 1(+ 咪唑洗脱带有 ) 的纳米抗体 再用体积排阻层析 >""(! 66 对纳米抗体进行二次纯化 用 <- 进行洗脱 通过. # 测定纳米抗体浓度 蛋白质凝胶电泳方法和考马斯亮蓝法染色鉴定纳米抗体的纯度和分子质量大小 *+/*+,-. 方法测定纳米抗体的亲和力 用 &$ 蛋白包被 %# 孔板 并用脱脂奶粉室温进行封闭 随后将纳米抗体梯度稀释后加入平板孵育 再加入 '!") 单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的 '!",'.< 单克隆抗体 最后加入底物进行显色反应 用微孔读板仪测. $1 值 *+0 测定纳米抗体与 &$ 稳定表达 )2 细胞系的结合 将 &$ 稳定表达 )2 细胞系以 10 个 孔接种于细胞培养板 过夜培养至细胞密度覆盖板底的 #// 面积 移除培养基后用 $+ 多聚甲醛固定细胞 随后用 <- 漂洗 次 脱脂奶粉室温封闭平板 把纳米抗体 梯度稀释后加入平板孵育 再加入 '!") 单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的 '!",'.< 单克隆抗体 最后加入底物反应进行显色反应 用微孔读板仪测. $1 值 *+1 曲线绘制 采用 6<<6# 进行曲线绘制 *+,-. 亲和力测定实验 首先将实验获得的. $1 值用 C( 方程进行对数函数转化 之后用纵坐标浓度数据取标准误 再用 -( 拟合曲线法进行 *+,-. 的曲线绘制和拟合 最终获得半最大效应浓度值 1/ ;(";"*1 + 结 果 +* 纳米抗体文库的构建 用 &$ 重组表达蛋白作为抗原免疫羊驼获得淋巴细胞 首先提取淋巴细胞. 经过反转录获得. 第 次 < 获得羊驼, 免疫球蛋白的 &)) 基因区域 重链抗体的 &)) 基因大小为 图. 用 &)) 基因作为第 次巢式 < 的 < 模板 并加入插入 限制性内切酶位点的上游引物和插入 限制性内切酶位点的下游引物进行 < 经琼脂糖凝胶电泳鉴定少量 < 产物为 $ 图 用 和 限制性内切酶 酶切 < 产物和 )*$ 噬菌体表达载体 将 个酶切产物过夜连接后获得带有 &)) 外源基因的 )*$ 噬菌体表达载体 图 最后将含有 &)) 基因的 )*$ 载体通过电转染 转入 大肠杆菌感受态细胞 获得噬菌体表达文库 对 的克隆计数可知 文库的容量为 0 个 对随机挑选的单克隆进行插入率检测可知 成功构建了插入率为 / 的噬菌体展示文库 图 图 * 纳米抗体噬菌体展示文库的构建和鉴定 6! ""6 ;"'&$ "((66.. 琼脂糖电泳显示第 次 < 和胶回收的结果 第 次 < 产物和 )*$ 质粒的酶切结果 检查文库中 个随机克隆的目的片段插入效率 ++ 特异性 噬菌体的富集表达和阳性克隆筛选 生物淘筛基于 *+,-. 原理 用 &$ 重组表达蛋白与噬菌体进行孵育 其目的是通过 轮亲和力筛!"!

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷 选 去除不与 &$ 蛋白结合的空载噬菌体或低亲和力噬菌体 留下能与抗原结合的噬菌体 使高亲和力噬菌体在连续的筛选过程中获得富集 经鉴定通过 轮生物淘筛的筛选 与 &$ 结合的噬菌体得到了明显富集 图. 从噬菌体感染的 宿主菌生长平板中随机挑选了 $ 个单克隆 这些 单克隆经过 <*'*+,-. 筛选阳性克隆 即碱性磷酸酶促反应在. $1 的显色值比背景值高 倍以上的克隆 表 经过计数 其中 # 个单克隆为 &$ 阳性克隆 并经过测序鉴定 框架结构 第 ##$ 氨基酸 和 个 结合区域的特征氨基酸 1##1 1 根据, 法则 将 # 条纳米抗体测序结果进行基因比对 结果显示获得了 1 个序列不同的抗 &$ 纳米抗体 根据最重要的抗原结合区 将 &$ 纳米抗体归为 个不同 抗原表位的组别 表 组内纳米抗体的区别在 或者框架区域中的个别氨基酸上 可能会影响纳米抗体的稳定性和表达产量 对亲和力的影响较小 + 最佳 纳米抗体的甄选 为了获得高产量的纳米抗体 需要将纳米抗体基因从噬菌体表达载体 )*$ 克隆至带有 ) 蛋白质标签的原核蛋白 质表达载体 )*# 克隆结束后 随机挑取 5# 宿主菌单克隆 用 < 法检测外源纳米抗体基因的插入率为 / 琼脂糖凝胶电泳图显示大小为 # 的纳米基因条带 图 随后对纳米抗体进行大量表达和纯化 用,. 亲和层析法和体积排阻层析法纯化纳米抗体 图. 对 1 个纳米抗体在 + 培养基中的表达量进行对比 结果显示纳米抗体的表达量在 + 之间 表 最后对纳米抗体进行蛋白质凝胶电泳和考马斯亮蓝染色验证 结果显示 纳米抗体的纯度 %1/ 分子质量为 $=! 左右 符合预测纳米抗体的蛋白大小 图 表 + 根据测序结果筛选出的 *- 个纳米抗体经过 %2. 表达载体表达后的电点 表达量和半最大效应浓度的统计结果 图 + 纳米抗体噬菌体展示文库的生物淘筛和原核表达质粒的构建 ' ;'&$ "((' 666! ;6=6"6" (. 用 *+,-. 检查连续 次生物淘筛的 &$ 特异性噬菌体富集率. 琼脂糖凝胶电泳检测 )*# 载体 左图 和 )*# 表达体系中 个随机单克隆的目的基因插入率 右图 表 * 连续, 轮生物淘筛中随机挑选 * 细胞单克隆的 ' 统计结果 <*'*+,-.6"!(;("(";6( "("";66""6!;' 阳性信号 背景信号第 轮第 轮第 轮合计 倍 #$ # 倍 $ 1 倍 % 随机挑选克隆数 % %1 $ +, 纳米抗体测序结果的比对和分组 使用, 法对纳米抗体的测序结果进行比对, 法标记出了纳米抗体框架结构的特征氨基酸 框架结构 第 # 氨基酸 框架结构 第 %11 氨基酸,"("6<,"("6 ;61/ ;(";"*1 ;6"16""" " 编号名称分组等电点 表达量 *1 + (+ 分子 1$ 单体 # 1 1 单体 % # % 单体 $ # 单体 1 $1 %% % # 单体 # $ # 单体 B 不表达 B B % 1% 1 单体 % % %1 1 单体 # % %# $ 单体 1$ ## $% 无结合二聚体 #% # # 无结合二聚体 ## 无结合二聚体 $ % ## % 无结合二聚体 1 1 ## # 无结合二聚体!"!

5 期 郑 芳 罗思羽 韩 燕 等 靶向巨噬细胞膜蛋白 &$ 特异性纳米抗体的构建和筛选 用 *+,-. 法比较 组 &$ 纳米抗体的亲和力 其中第 组和第 组的纳米抗体普遍显示较好的亲和力 第 组纳米抗体容易形成二聚体 从而影响亲和力 表 第 组的纳米抗体普遍亲和力较高 尤其是 % 的亲和力最高 *1 为 (+ 图 最后为了验证 % 是否可以和自然状态下细 胞表达的 &$ 受体结合 本研究使用了 &$ 转染稳定表达细胞系 在此细胞系中 &$ 分子稳定表达并锚定于 )2 细胞表面 纳米抗体与 &$ 稳定表达 )2 细胞系的结合能力检测结果显示 % 可以与细胞表面自然状态下的 &$ 蛋白结合 反之对照纳米抗体, 不能结合 图 图, 纳米抗体的纯化和亲和力鉴定 <!6; ;""6 ;&$ ".&$ 纳米抗体用 -!"6"1 纯化柱纯化后 & 检测获得的各洗脱组分 最高峰为纳米抗体蛋白收集峰 --'<.* 检测 &$ 纳米抗体大小为 $=!*+,-. 检测纳米抗体亲和力 %%1 分别代表 组 第 组中 % 与 &$ 稳定表达系结合, 作为阴性对照, 讨 论 &'"! (!( &$ 是 免疫调节受体家族的新成员 在巨噬 细胞表面特异性高表达 在体外实验中 &$ 的可溶性重组蛋白能直接抑制 $ A A 细胞和 细胞的增殖和活性 并抑制,+' 细胞因子的表达 虽有文献显示 &$', 蛋白可与 细胞结合 但是其结合方式仍未可知 本课题组前期研究表明 &$ 大量表达于关节炎模型小鼠的滑膜巨噬细胞和肝脏组织巨噬细胞表面 在关节炎症模型和肝脏 %' 急性炎症模型中 &$ 都起到了重要的作用 本研究成功构建了 &$ 纳米抗体 纳米抗体不但可以用于研究 &$ 受体的表达和功能 同时还能满足临床标本检测的需求 并作为示踪剂用于在体巨噬细胞靶向分子影像 本研究使用真核表达体系表达的 &$ 重组蛋 白作为抗原 &$ 蛋白的糖基增强了抗原的免疫原性 通过 1 次抗原注射诱导羊驼 在此过程中免疫动物体内的浆细胞分泌大量针对 &$ 的抗体 随后分离全血中免疫细胞 并对细胞的. 进行提取和反转录 通过 次 < 反应确保扩增出编码构建重链抗体的基因 与此同时 还在 < 反应过程中通过引物 在目的基因两端加入的酶切位点 便于构建噬菌体表达 )*$ 质粒 获得展示文库 本研究获得了库容为 0 个 插入率为 / 的噬菌体展示文库 满足建库标准 噬菌体文库中的生物淘筛环节 是保证获得特异性结合 &$ 噬菌体的重要步骤 本研究进行了连续 次生物淘筛 淘筛中的洗脱步骤去除不能和 &$ 抗原结合的噬菌体 而能与抗原结合的噬菌体在每一轮淘筛中得到了富集 分别在生物淘筛的细菌培养平板当中 随机挑选 $ 余个单克隆 对这些单克隆进行 <*'*+,-. 验证噬菌体与 &$ 抗原的!"!

6 西安交通大学学报 医学版 第 卷 结合能力 本研究以阳性信号 背景信号高于 倍为界限 确保获得高亲和力的阳性克隆 按照, 结果对比测序结果得到以下 个结论 纳米抗体包括 个抗原结合区和 个结构区 符合纳米抗体的基本特征 抗原结合域 中有 个组别的基因差别较大 可能预示着这 个组别分别和 &$ 不同的抗原表位结合 原核蛋白质表达载体 )*# 其中有一段 ) 表达标签 可以方便地进行蛋白质的表达和纯化 因此 本研究用 )*# 载体对 )*$ 噬菌体表达载体中的基因进行再次克隆 表达和纯化 结果表明 纯化后的纳米抗体的大小为 $=! 符合预期纳米抗体的平均分子质量 蛋白质凝胶中未显示其它杂带说明了纳米抗体的纯度较高 最后对 组纳米抗体进行 *+,-. 亲和力测定并获得了 *1 值 结果证明 第 组纳米抗体因为容易形成二聚体 因此与抗原 &$ 没有结合能力 第 组和第 组的纳米抗体与抗原结合的亲和力较高 达到 (+ 级别 % 是亲和力最高的纳米抗体 *1 为 (+ 进一步验证了 % 纳米抗体检测 &$ 高表达 )2 细胞系的能力 结果再次证明 本研究获得了高亲和力 高表达并能与自然状态下细胞表达的 &$ 特异性结合的纳米抗体 % 纳米抗体技术作为新兴的分子识别抗体技术 拥有特异性强 亲和力强 分子质量小 稳定性好 良好的生物工程潜力等特点 而且纳米抗体还具有可大规模发酵生产 价格低廉 免疫源性低 易于普及应用等 优势 纳米抗体可以作为高亲和力和靶向性的治疗手段 目前.( 公司针对肿瘤和自身免疫疾病 研发的靶向,+'#',+'. 和 &*. 等纳米抗体药物已经进入临床研究 <" 和 <" 阶段 纳米抗体可以作为分子示踪剂使用 如针对血管内皮生长因子 &* 巨细噬胞甘露糖受体 人类表皮生长因子受体 )* 等肿瘤相关分子设计的纳米抗体 在肿瘤的 $ 分子影像学研究中有着突出表现 本研究获得的抗 &$ 蛋白 % 可以通过后续不同的标记 如生物素 荧光集团和同位素等和巨噬细胞膜表面 &$ 受体结合 应用于在体巨噬细胞的染色和靶向分子标记 参考文献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编辑 卓选鹏!"!

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