中 国 畜 牧 兽 医 卷 基因组的 89 区 开放阅读框 ( 约为 % 共编码 个氨基酸 由于 基因组中 含量过高 扩增全长较困难 因此通常截取含 有 & 蛋白抗原表位的一段基因片段进行表达 研究证实 & 蛋白是抗体的主要靶子 虽然在猪体内存在着 &&&1 核衣壳蛋白等抗体 但在行使免疫性和诱导免

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1 中国畜牧兽医! " 猪伪狂犬病病毒 " 蛋白表达及免疫原性分析 贾 刚 樊梅娜 谷 巍 山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院 泰安 泰安大凡神农制药有限公司研究院 泰安 摘 要 本试验旨在研究猪伪狂犬病病毒 '"%& 蛋白的表达并分析其免疫原性 以 病毒液为模板 设计特异性引物 扩增大小为 %' 的保守片段并测序 将其克隆到表达载体 '1" 中 转化表达菌 9)1 经诱导表达 纯化得到目的蛋白 进行 %/& 分析验证并分析免疫原性 结果表明 表达的 & 蛋白大小为 主要以包涵体形式存在 复性后浓度为 &-9 且具有良好的反应原性 应用市售试剂盒检测到样品中含 份 阳性血清和 份阴性血清 利用检出的阳性血清 初步可建立以 & 蛋白为包被抗原的 抗体 19* 检测方法 关键词 猪伪狂犬病病毒 & 蛋白 原核表达 免疫原性中图分类号 文献标识码 文章编号 7)&!((3%&%3!&+8&3"%& B*"& 3 0" 8!!!&(+/ +/!1!!! %&(!! +&*.7'"--&!''"% &'.'!'-&..-'/"!'. /"%"".%'&!"&-"-'/!"E." /.7''1"""!-9 )1."& '"%""!7'"'!"%/&"'!- ""/--&./.."&' ".. -"/7 '.!-!/%"."!.'"&-9. /"&'-"&"-."-'/ &19* "/&'-."%-.""/ "%/...&'""&'""& -&!''"%&''"7'--& 伪狂犬病 又称 病 是一类由疱疹病毒科 疱疹病毒亚科伪狂犬病病毒 '"% 引起的危害家畜及多种野生动物的急 性传染病 主要感染猪等动物 可造成怀孕母猪流产或死胎 新生仔猪发热 出现神经症状等 极大地 影响了中国养殖业的健康发展 该病传播快 传播范围广 传播途径多 死亡率高 已成为危害养猪 业最为严重的疾病之一 需要加以重视 作为一种猪疱疹病毒 基因组为双链线性 )3 其病毒粒子脂质囊膜由多达 种糖蛋白组 成 其中 & 蛋白是 最主要的保护性抗原蛋白 是 复制 感染必不可少的囊膜组分 不仅能够诱导宿主产生免疫应答 而且也是病毒入侵 增殖和在细胞间传播的必需组分 (+ 基因位于 收稿日期 基金项目 国家 计划专项基金 新型抗感染功能型微生态制剂的研制与应用 作者简介 贾 刚 男 山东泰安人 硕士 研究方向 动物微生态学 1-"/&"&- 通信作者 樊梅娜 女 河南南阳人 硕士 研究方向 动物微生态学 1-"/7---

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 基因组的 89 区 开放阅读框 ( 约为 % 共编码 个氨基酸 由于 基因组中 含量过高 扩增全长较困难 因此通常截取含 有 & 蛋白抗原表位的一段基因片段进行表达 研究证实 & 蛋白是抗体的主要靶子 虽然在猪体内存在着 &&&1 核衣壳蛋白等抗体 但在行使免疫性和诱导免疫应答方面所起到的作 用 不同的 蛋白相差极大 对猪注射抗 &&&1 单克隆抗体或利用免疫接种方式 均能起到抵抗 致死性攻击的作用 但其中 &&1 的单克隆抗体会呈现抗原漂移 从而使 能够逃避宿主的免疫防御 而 & 免疫原性相对较好 没 有发现抗原变异的情况 本试验旨在利用特异性引物将猪 (+ 基因片段进行克隆并连接至表达载体中 诱导蛋白表达并进行免疫原性分析 同时 以复性后的蛋白作为抗原 初步建立起以之为包被抗原的 抗体 19* 检测方法 为今后猪伪狂犬病的检测和诊断奠定基础 材料与方法. 材料 菌种 质粒和病毒株 大肠杆菌 ) 感受态细胞 'A%/-'/ 载体 '1" 表达载体 病毒液由宝来利来生物制品研究室保存 9)1 购自 "&. 公司 主要试剂 )3 聚合酶 限制性内切酶和 * 均购自 """ 公司 33 树脂购自 3"& 公司 辣根过氧化物酶 标记的羊抗猪 *& *& 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 猪伪狂犬病毒抗体检测 19* 试剂盒购自深圳芬德生物技术有限公司. 方法 引物设计与合成 参考 " 中公布的 (+ 基因序列 登录号 B 采用 )3 03 软件设计扩增 (+ 基因的引物 引物序列为 上游引物?? 下游引物?? 引物由博尚生物合成 反应体系 9 =-! 上 下游引物各 9 细胞培养液 9- )3 聚合酶 9 ( 9 反应条件 > 预变性 - > 变性 > 退火 > 延伸 个循环 > 延伸 - 产物经 < 琼脂糖凝胶电泳检测 重组 & 蛋白表达载体的构建 以 病毒液为模板 利用合成的引物进行 扩增 目的片段胶回收之后由 )3 连接酶于 > 水浴过夜连接到 'A%/-'/ 载体 转化大肠杆菌 ) 感受态细胞 酶切鉴定后 将阳性克隆命名为 'A 并进行测序 对 'A 进行. 和 & 双酶切后 将目的片段连接到原核表达载体 '1" 上 转化感受态细胞 9 )1 重组质粒经酶切鉴定 阳性载体命名为 '1"& 重组 & 蛋白的表达 纯化和鉴定 挑取单个阳性菌落 > 条件下摇床培养至菌液 - 在 之间 加入 --/9* 诱导. 收集菌液 超声破碎处理 离心后经 )1 电泳确定蛋白以包涵体形式存在 利用 33 树脂进行纯化 纯化后的蛋白经 )1 鉴定 并进行 %/& 分析重组蛋白抗原性 重组 & 蛋白的复性及浓度测定 利用透析法对包涵体蛋白进行复性 将包涵体蛋白放入透析袋中 利用尿素梯度进行复性处理 制作标准曲线 利用 "! 蛋白浓度测定试剂盒测定复性后的重组 & 蛋白浓度 重组 & 蛋白的活性分析 利用猪伪狂犬病毒抗体检测 19* 试剂盒对收集到的血清进行检测 筛选阳性和阴性血清 利用间接 19* 鉴定重组 & 蛋白的活性 取纯化后的重组 & 蛋白 以 & 孔包被 19* 反应板 以稀释 倍的 感染的猪的阳性血清为一抗 辣根过氧化物酶标记的羊抗猪 *& 为二抗 将检测结果与市售试剂盒的结果进行比较 判断重组 & 蛋白作为抗原包被建立的 19* 检测方法的可行性 结 果. 重组 " 蛋白原核表达载体的构建 利用特异性引物 从 病毒液中扩增到了大小为 %' 的目的片段 图 连入克隆载体 'A%/-'/ 载体 酶切后构建到原核表达载体 '1" 重组表达载体经 和 & 双酶切 获得了预期目的基因片段 图

3 期 贾 刚等 猪伪狂犬病病毒 & 蛋白表达及免疫原性分析 0)9)3 0"(+ 基因的 扩增产物 0)9)3 0""'!(+& 图 %08 基因 %*0 扩增产物.%*0)&!3%08 '1" 载体 '1"& 双酶切产物 0)9)3 0" '1")%/&'!'1"&0)9)3 0" 图 重组质粒 )6%08" 双酶切鉴定.!&(+)(!)6%08"+!3+(! 测序可知 扩增得到的 (+ 基因大小为 %' 预测表达 个氨基酸 对 (+ 基因进行同源性分析 发现其与 3* 数据库中已公布的 个 参考序列 欧美毒株 株 " 登录号 B"'/" 株 " 登录号 B 和 "." 株 " 登录号 B(+ 基因序列同源性较高 均达到 < 以上 图

4 %%/R 中!国!畜!牧!兽!医 )) 卷! 图 G!7HV 基因序列同源性分析. G!< *YQ *+ > >)7HV6 * * 6F 6 0// 0!F!! 重组 A(T!L/ S7HV6 蛋白表达"纯化 基因克隆到 原 核表 达载体上! 转化大肠 杆 菌 >W0%" AI*!经 B?ZO 诱 导 表 达!产 显的 *&.Y 的 表 达 蛋 白 带!主 要 存 在 于 沉 淀 中 "图 )!利用 包 涵 体 纯 化 试 剂 盒!成 功 纯 化 到 目 的 蛋 白 "图 & 物过 Q!QZ= 柱 纯 化!经 NAN!?=OI 分 析!可 见 明 H!低分子质量蛋白质 H. ( %!未诱 导 的 9IZ! 0! B?ZO 诱 导 &F 表 达 产 物( *! B?ZO 诱 导 )F 时 表 达 产 0R 载 体( 物( )! B?ZO 诱导表达 )F 时超声裂解上清液(! B?ZO 诱导表达 )F 时超声裂解沉淀 H! W[ H G Y G L? - H. ( %! 0! IU9 - -"Y "3 &F76 0RD [ FY -"Y -( 8F 9IZ! *! IU9 - -"Y "3 )F76B?ZO( )! VG "Y9 - -"Y "3 )F76B?ZO(! VG! B?ZO( "9 -"Y "3 )F76B?ZO 9 图 %! 重组蛋白 A(T!L/ S7HV6<N< S71R( 分析. %!<N< S71R(// > >) = *8 * + -@C / A(T!L/ S7HV6A 8 * 6F 0

5 期 贾 刚等 猪伪狂犬病病毒 & 蛋白表达及免疫原性分析 0 低分子质量蛋白质 0"* 诱导表达. 时超声裂解上清液 * 诱导表达. 时超声裂解沉淀 蛋白纯化流穿液 蛋白纯化产物 09 0//"&. 0"8/""'""!.%*8/"" ''"!.%*.&./E"!'!""!'' 图 重组蛋白 )6%08" 纯化分析.%&(+)6%08")&&)3&./ 重组 )6%08" 蛋白复性及鉴定 利用透析法对重组蛋白进行复性 经检测 复性后蛋白浓度为 &-9 经 %/& 检 测 纯化的蛋白能够与 标签特异性识别 约 图 0 低分子质量蛋白质 0" 未纯化的 '1"& 蛋白 纯化后的 '1"& 蛋白 09 0//"&. 0"'1"&'.'!"'1"&' "!'!" 图 重组 )6%08" 蛋白的 &+ 分析.&+&(+)6%08")&.%08 阳性血清筛选 利用市售的 检测试剂盒对采集到的猪 血清进行检测 以血清样本中 抗体浓度 &-9 为阳性判断依据 共检测到 份阳性血清和 份阴性血清. 重组 )6%08" 蛋白活性分析 以复性后的 & 蛋白作为抗原包被反应 板 以感染猪 的阳性或阴性血清作为一抗 辣根过氧化物酶标记的羊抗猪 *& 作为二抗 建立间接 19* 方法 与试剂盒测定结果相比较 表明试剂盒检出的阳性血清均可与 & 蛋白发生反应 且两个检测结果数值相近 表明用复性后的 & 蛋白建立间接 19* 方法是可行的 表

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 两种 检测结果比较 6+*()&&33- (! 样本 试剂盒检测结果 重组蛋白包被检测结果 "-'/ /% /..-%"' 空白 /" 阳性血清 - 本试验建立的间接 19* 方法与市售试剂盒 / 讨 论 作为养猪业的重要疾病 不仅可以引起新生仔猪神经症状和种猪繁殖障碍 更能直接诱发猪繁殖与呼吸系统综合征 而 与其他病毒在猪群中的混合感染也大大增加了猪病的防控难度 年 娄高明等报道伪狂犬病已分布在包括香港和台湾在内的 个省 市 且暴发形势不断加剧 严重影响和制约着中国养猪行业的健康发展 因此 建立一种有效 可靠的诊断方法对于预防和控制 具有非常重要的意义 研究表明 & 蛋白能介导细胞膜与病毒囊膜的融合 促使病毒穿过 能使感染的细胞膜与未感染的细胞膜融合 能诱导免疫学反应抵抗 感染 通过对 & 的基因和蛋白序列进行对比发现 不同毒株 (+ 基因序列同源性均在 < 以上 表明 & 蛋白具有高度的保守性 本试验通过原核表达系统表达的猪 & 蛋白建立的间接 19* 方法 为今后检测和诊断猪 建立了先决条件 具有重要的实际意义 应用 & 蛋白建立间接 19* 检测方法 国内已有报道 包新奇等将 (+ 基因在大肠杆菌中进行分段表达 其中以 & 和 & 建立的间接 19* 方法与 *)1 公司的市售试剂盒符合 率较高 罗飞以大肠杆菌中高效表达的 重组 & 蛋白为抗原建立的 19* 检测方法 在检测检测猪圆环病毒病 细小病毒病 猪瘟 猪日本脑炎和猪繁殖与呼吸综合征等阳性血清时结果均为阴性 具有高度的特异性 批间 批内重复性试验结果变异系数均小于 < 与 *)1 试剂盒相比 其敏感性和特异性分别为 < 和 < 符合率为 < 相比 还存在着一些问题 如样本血清 值整体偏大 阳性血清 值偏小等 表明用 & 蛋白作为抗原包被建立的间接 19* 方法条件还有待摸索 相信随着技术的发展 猪 19* 检测的敏感性和特异性会更好 同时准确性更好 操作更加 简便 结 论本试验成功表达并纯化得到 & 蛋白 大小为 且具有良好的反应原性 可初步建立以 & 蛋白为抗原包被的 抗体 19* 检测方法 参考文献 佘永建 猪伪狂犬病 B 畜牧与兽医 刘显煜 猪伪狂犬病的临床症状及控制对策 B 中国兽医杂志 """9"/"&'""/ )!'"%&-E "''"/!&/"'&B! " 0/ " '"%." -//"'".&"!."BB!. 王淑杰 蔡雪辉 刘永刚 等 伪狂犬病病毒 ( 基因的表达及 &1 蛋白单克隆抗体的制备 B 中国兽医科学 0/ 0//"%/&!'"% "B1 "/! & A"A."/ %"-/"--".)3"!

7 期 贾 刚等 猪伪狂犬病病毒 & 蛋白表达及免疫原性分析 '"% -"%%" '&/B/ + /" &B"/)! "/&&"!'--%" &)3""&"'"%B + ".*0/ "%&/ '& "&'""/!'" B A"'0 00(3"/)%!/''.'"%&/' B.1././''"/."""!.'/"& (""& '"!.'"E!.' "%&-B "/ "-%&&3" B "/%" -!.'/"-"/! '"%&/'-'"!%. "%"/"!"/&/'"!//'"B 37!/B"& "/*!!.."-"/%'"%B "%"1E9 /!/''&1. '"% /! /B " "/ "/ 3" B "/%"/"!"/&/ '"&1&*'"'' "%! -!-!- '/--"/B 娄高明 杜伟贤 伪狂犬病流行概况及猪场防制策略 B 中国动物检疫 方礼禄 王朝军 徐 利 等 应用 19* 检测我国猪病的研究进展 B 饲料博览 包新奇 黄绍华 刘巧荣 等 猪伪狂犬病毒 (+ 基因在大肠杆菌中的分段表达 B 中国比较医学杂志 罗 飞 猪伪狂犬病毒结构蛋白 & 和 &) 主要抗原区的原核表达以及猪血清 & 抗体间接 19* 检测方法的建立 ) 扬州 扬州大学 武文君 张 映 方礼禄 等 19* 技术在畜牧业中的应用进展 B 饲料博览 责任编辑 秦 彤

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