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1 中国畜牧兽医 6! " # 绵羊 基因外显子 酵母表面展示库的构建及鉴定 许万云 王会敏 汪文伦 胡梦薇 严 国 李建华 高剑峰 石河子大学生命科学学院 石河子 1 摘 要 根据绵羊 %( 基因序列和酿酒酵母表面展示载体 / 上的多克隆位点设计特异性引物 从绵羊组织中提取总 )* 并逆转录 利用 ) 技术扩增得到 %( 基因 克隆获得 / 目的片段 并提交!# 登录号 ) 将该基因通过双酶切连接到表面展示载体 / 上 成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒 / )* 将 %( 基因外显子 两端进行基因点突变 形成新的酶切位点 继而对外显子 设计特异性引物 对绵羊大样本进行 * 池化 并将外显子 扩增产物测序 分析其多态性获得多态位点 重组质粒双酶切得到 / 具有多态性的外显子 将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体 / )* 上 成功构建了酿酒酵母表面展示库 将其转化用于表面展示的酿酒酵母, 感受态细胞中 得到酵母转化子 挑取酵母菌的单克隆通过 ) 扩增及序列测定证实了 )* 基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中 经半乳糖诱导后 通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到 )* 基因库已成功展示在酵母细胞表面 关键词 绵羊 )* 外显子 点突变 酵母表面展示库 免疫荧光法中图分类号 5 1 文献标识码 * 文章编号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收稿日期 1 基金项目 国家重点基础研究发展计划 - 计划 作者简介 许万云 -- 女 山东青岛人 硕士生 研究方向 动物基因工程,8# -1 :: 8 通信作者 高剑峰 - 甘肃天水人 博士 教授 研究方向 动物功能基因组学与分子免疫学! -- 1,8##!$ 9!9

2 期 许万云等 绵羊 %( 基因外显子 酵母表面展示库的构建及鉴定 - &8!"$#"%(!!$#!!"! &#"! "$## # # -! 8!* "!& # # "! 9!" #!"! "!"$#" )*!! &#&%$#!!9! 9 %!8"&#"! "$! %!# "!9& #!9!&"$!9&!!!8 &/! %889 9&!!!8!"$, ",- )*!' / "89"#" %!# " 9& #! / #% &#&! &!!!##% 绵羊在中国有着丰富的种质资源 然而阻碍绵羊养殖业飞速发展的主要原因就是布鲁氏菌病 布鲁氏菌病 &9! 简称布病 是由布鲁氏菌 &# 引起的一种世界范围内流行的高度接触 性人畜共患性全身传染病 此病严重影响着绵羊产业与人类社会生产的发展 主要组织相容性复合体 8# &$ " 8/#" "% 8/!; 是高度多态的基因区 其主要功能是编码特殊的抗原递呈受体 - 年 &!& 在研究小鼠的移植排斥反应时 首次引入主要组织相容性基因的概念 - 1 年 ; " 在对淋巴细胞的血清学研究中首次发现绵羊 ; 绵羊 ; 通过原位杂交被定位在绵羊 号染色体 上 绵羊 " 类基因是免疫球蛋白基因家族的成员 它是由一条广泛糖基化的 链和一条 链以非共价键连接组成的一组跨膜糖蛋白 抗原只有经 ; 分子递呈到细胞表面后 才能被 < 淋巴细胞识别 诱导机体免疫应答 绵羊 ; 5 和 ) 位点构成了 # # 亚区 具有高度多 态性和连锁不平衡等遗传特点 早期以人 % 基因为探针的 9"$!& 杂交发现绵羊存在单个 %( 基因 且它是表达的 尽管有证据证明在绵羊中存在第 个 %( 基因 但可能是基因拷 贝的结果 酵母表面展示 %!# " 9& #! / #% 系统 是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统 美国 "&! 公司用于酿酒酵母表面展示的载体 / 可使外源蛋白与 # 凝集素 端融合表达在酵母细胞表面 绵羊 ; 类抗原有很多基因 但只有 "%( 及 "% 基因在蛋白质水平上表达 绵羊 %( 基因是高度多态的 这些基因在巨噬细胞和 细胞膜上表达经典 ; 类分子的量要比 % 基因多 许多研究发现绵羊包括 %( 和 %(& 基因 且 %(& 基因的多态性远高于 %( 基因 因此为便于探索研究 " 基因酵母表面展示库的构成鉴定 本试验选用了与免疫蛋白结合相关的多态性相对较低的 %( 基因 由于与免疫蛋白的结合主要由 %( 基因具有多态的外显子 决 定 所以本研究对外显子 进行多态性分析 并控制 %( 基因外显子 外显子 和外显子 不变 以减少对基因表达蛋白正确折叠的影响 从而保证其能完成正确的高级构象 近年 常有关于布鲁氏菌病在中国北方诸多省区发生和流行的报道 目前全国布鲁氏菌病疫情回升的省区已超过 个 出现多达 个暴发点 局部地区呈暴发流行趋势 因此 本研究选用酵母表面展示的方法 以期将 " %( 基因所表达的蛋白分泌到酵母细胞表面 当布鲁氏菌作为抗原与表达在酵母细胞表面的绵羊 ; )* 蛋白相结合形成抗原复合物 细胞与酵母表面带有 ; 抗原复合物的细胞相互作用并被激活 从而可以探索到绵羊抵抗布鲁氏菌病的作用机制 本研究利用生物信息学软件比对分析获得绵羊 %( 基因编码区序列 对其 * 进行克隆及序列测定 %( 基因编码 ; 类抗原分子的 链 其编码的产物与抗原肽结合产生有效免疫应答 其中 %( 基因外显子 编码重要的功能区 抗原结合位点 # "! "!* 在递呈抗原中发挥着非常重要的作用 它的多态性直接与功能相关 影响动物对疾病的免疫力 因此 本研究通过长期摸索反应条件进行点突变 * 池化扩增外显子 并分析外显子 的多态性 以期构建酿酒酵母表面展示库 材料与方法 - 材料 质粒与菌株 酵母表面展示载体 / 及酿酒酵母, 感受态细胞均购自美国 "&! 公司 大肠杆菌 感受态细胞由石河子大学生命科学学院细胞分子生物学实验室保存 样本来源 绵羊组织采自新疆农八师紫泥泉种羊场 绵羊血样采自新疆 团场 主要试剂 琼脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司 * ;#&!& *#8/ * " 琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 司 ) ) 试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司 ) 试剂盒购自!! $! /,* " 购自北京全式金生物技术有限公司 限制性内切酶 * 连接酶 &8!&/" " "&# * % "$! " 均购自 # #)# 公司 /!# " / #%?! "& " 购自 "&! 公司 - 方法 绵羊血液基因组 * 的提取 参照 *#8/ * " 说明书并加以改进 提取绵羊全血基因组 * * 浓度与纯度的检测 采用盘分析法 #"!*#% 检测所提取 * 的浓度 经检测符合 * 纯度标准 琼脂糖凝胶电泳检测纯度 于凝胶成像仪拍照分析 突变引物和特异性引物设计 参照! # 上已发表的绵羊 " %( 基因序列 登录号 2;-1 利用 &8!& &!8!& 软件设计 对突变引物 2 ) 和 2 ) 在 " %( 基因外显子 的两端依次引入酶切位点 & 和 $ 根据突变后的基因序列 设计该基因外显子 的特异性引物, 2 和, ) 预期扩增片段长度为 / 包含全部外显子 的序列 引物序列 2(***** ***** ( )(* ********* ( 2(****** *** ( )(**** (, 2(* ****** (, ) ( ( 下划线处酶切位点碱基 * 池化 ) 扩增外显子 多态性分析 将所提取的 个绵羊 * 以 个为一组 按浓度 进行稀释混匀 以这 个混合液作为模板进行扩增 ) 扩增体系 * 模板, 2, ) 各 A/ ) ;# "!& ;'1 1) 扩增条件 - > 预变性 8 - > 变性 > 退火 > 延伸 共 个循环 > 延伸 8 将 ) 产物直接送华大基因公司测序 并利用!:;# 等软件对测序结果进行比对 分析其多态性 绵羊组织总 )* 的提取与逆转录 利 用 ) 试剂盒提取绵羊组织总 )* 根据 & 8!&/" " "&# * % "$! " 说明书进行逆转录合成第一条链 * 特异性引物设计 扩增 )* * 所用引物参照!# 上已发表的绵羊 " 基因序列 登录号 2;-1 利用生物信息学软件进行序列比对 通过 &8!& &!8!& 软件设计 对特异性引物 在上 下游引物中分别引入 & 和 2 酶切位点 引物序列 上游引物 2(****** ( 下游引物 )(*** ( 下划线处酶切位点碱基 绵羊 %( 基因 * 的克隆及鉴定 ) 扩增条件 - > 预变性 8 - > 变性 > 退火 > 延伸 共 个循环 > 延伸 8 琼脂糖凝胶电泳回收 ) 扩增的 %( 基因 然后与 /,* 载体连接 转化大肠杆菌 感受态细胞 筛选阳性转化子 利用质粒小提试剂盒提取质粒 /,* )* 并对其进行双酶切鉴定 选取 个鉴定正确的重组菌 由华大基因公司测序 并通过!:;# 等软件对测序结果进行比对分析 1 重组质粒的构建及初步鉴定 对质粒 /,* )* 和酵母表面展示载体 / 进行 & 和 2 双酶切 然后将双酶切后的 %( 基因序列和酵母表面展示载体 / 以 * 连接酶 > 连接 转化入大肠杆菌 感受态细胞 筛选阳性转化子 利用质粒小提试剂盒提取质粒 / )* 再对重组质粒进行双酶切鉴定 选取 个鉴定正确的重组菌 送华大基因公司测序 并通过!:;# 等软件对测序结果进行比对分析 - 重组质粒转化酵母细胞再次鉴定 将所提的阳性重组质粒 / )* 转化酿酒酵母, 感受态细胞 按 /!# " / #%?! "& " 说明书 在选择培养基上筛选阳性转化子 命名为,/ )* 进行酵母菌落 ) 鉴定 快速突变 / )* 构建酵母表面展示库 利用快速突变试剂盒分别在 / )* 外显子 两端进行碱基突变引入 & 和 $ 酶切位点 ) 突变扩增条件 - > 预变性 8 - > 变性 > 退火 > 延伸 18 共 个循环 > 延伸 8 构建出突变后的质

4 !* 期 许万云等$绵羊 基因外显子 酵母表面展示库的构建及鉴定 1/% 粒 GZ>%!>AB!F?"图 %#!并 利 用 8:( $ 和6'% # 重组菌!由华大基因公司测序!并通 过 =XY5- 等 软 限制酶对其进行双 酶 切 鉴 定!选 取 个 鉴 定 正 确 的 件对测序结果进行比对分析& 图 #! 酵母表面展示库的构建示意图 K #!FL =6,2 5 6,-, 7: = =1 2 B /E < : : %' ' %%! 酵 母 表 面 展 示 库 GZ>%!>AB!F? 的 免 疫 荧光检测!! 在选 择 培 养 基 上 筛 选 阳 性 转 化 子!挑 取单菌落接种于 K 葡萄糖 ZR?!CBB 的液 体培 养 法检测其浓度!通过与标准品进行亮度比对!稀释后 最终浓度在 &-;%&J 左右& 基中!于 摇 床 过 夜 培 养!使 7 值 达 '1 之 间!离 心!E &!PMA 池化后 #%& 基因外显子! 的 G*J 扩增 对 绵 羊 7@& 基 因 外 显 子 MCA 产 物 进 行 琼 去上清)再 经 K 半 乳 糖 ZR?!CBB 的 液 体 培 养 基 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测!结 果 显 示 可 观 察 到 特 异 性 扩 重悬!于 & b 摇床振 荡 培 养!诱 导 目 的 蛋 白 在 酵 母 增 目 的 条 带!大 小 约 )(2G!与 预 期 扩 增 片 段 大 小 表面展示表达)通过 细 胞 免 疫 荧 光 法 在 荧 光 显 微 镜 相 符 & 送 北 京 华 大 基 因 公 司 进 行 测 序!比 对 分 析 下检测是否出现 绿 色 荧 光!以 判 断 D=& I7@& 基 因 得 到 * 个 多 态 性 位 点$ %&Q%B' %)*Q%B' )(Q%C 是否展示在酵母细胞表面& "图 #&!! 结果与分析!E #! 基因组 PMA 的电泳检测 将提取的绵羊 血 液 基 因 组 >RB 进 行 %' &K 琼 脂糖凝胶电泳检测!结果显示条带整齐单一!清晰完 整!无蛋白残留和拖尾现象&!E!! 基因组 PMA 的浓度 提取的 绵 羊 血 液 基 因 组 >RB 经 M L 5 B: : 57!E %! 总 JMA 的提取 从绵羊组织中提取的 总 ARB 经 甲 醛 变 性 琼 脂 糖凝胶电泳检测!结果显示可观察到 I=' %I= 和 1= * 条荧光带!且 I=j%I= 约 为 j%"图 *#!确 定 了 ARB 的完整性) ARB 样 品 经 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 7(&-V%7I&-V 值介于 %' I'' & 之 间!表 明 ARB 纯 度较高&

5 1/ 中!国!畜!牧!兽!医 )* 卷! 图!!PMA 池化 #%& 基因外显子!G*J 扩增产物的多态位点测序结果 === ;,-! K!!FL =2 =I5 =-6 -/ = 2 5, 7G*JH< 7 6,-<,15 6 2<, <L 62 = 2, 7PMA<,, -/,-#%&/ /E :H,

6 期 许万云等 绵羊 %( 基因外显子 酵母表面展示库的构建及鉴定 图 总 ) 电泳图 - $!"" %!! ) - 绵羊 基因 $2 ) 的 / 扩增以提取的总 )* 为模板 经反转录及 ) 扩增后 取 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 可以观察到特异性目的条带 大小约 / 与预期扩增片段大小相符 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该特异性条带 用于 ) 产物的克隆 - 重组载体 &) 82 ) 的鉴定结果凝胶回收产物与 /,* 载体连接 产物转化大肠杆菌 感受态细胞后 在含 *8/ 抗生素的平板上筛选阳性重组子 并在提取质粒后进行 双酶切鉴定 结果表明菌落 ) 获得的特异性条带和对重组载体用 & 和 2 双酶切得到的基因片段大小均为 / 证实目的基因已重组到载体上 将重组子命名为 /,* )* 图 为了验证所克隆的片段是否为绵羊 )* * 对其进行双链 * 测序 测序结果证实克隆片段确实为绵羊 %( 基因编码区 * 序列 通过!:;# 软件对测序序列结果进行比对分析 结果证实与!# 里登录号为 2;-1@ 的 * 序列相一致 ; * ;#&!& 重组质粒 /,* )* 双酶切产物 ;? * ;#&!& ; * ;#&!& 9!!%8!! " /&9 "&! 8 # "/ # 8/,* )*;? * ;#&!& 图 重组质粒 &) 82 ) 双酶切鉴定电泳图 -2 #*:! " #! %" $ *!&) 82 ) - 重组表面展示质粒 822 ) 的鉴定结果 重组质粒 /,* )* 和酵母表面展示载体 / 以 & 和 2 双酶切后的连接产物转化大肠杆菌 感受态细胞 在含 *8/ 抗生素的平板上筛选阳性重组子 并在提取质粒后进行质粒电泳检测及双酶切鉴定 结果表明菌落 ) 获得的特异性条带和对重组质粒用 & 和 2 双酶切得到的基因片段大小均为 / 图 证实目的基因重组到表面展示载体上 将重 组质粒命名为 / )* 测序结果证实克隆片段确实为绵羊 %( 基因编码区 * 序列 通过!:;# 软件对测序结果进行比对分析证实与! # 登录号为 2;-1 的 * 序列相一致 重组质粒 / )* 转化酿酒酵母, 感受态细胞后 在选择培养基上筛选阳性转化子 结果表明酵母菌落 ) 获得的特异性基因片段大小为 / 证实成功构建酿酒酵母表面展示重组载体 / )*

7 中 国 畜 牧 兽 医 卷 ;? * ;#&!&;* ;#&!& 重组质粒 / )* 双酶切产物 ;? * ;#&!&;* ;#&!& 9!!%8!! " /&9 "&! 8 # "/ # 8/ )* 图 重组质粒 822 ) 双酶切电泳图 -2 #*:! " #! %" $ *!822 ) -6 突变后重组质粒 822 ) 的鉴定结果突变后的重组质粒 / )* 转化筛选阳性重组子 提质粒并进行双酶切鉴定 结果表明菌落 ) 获得的特异性条带和突变后的重组质粒 用 & 和 $ 双酶切得到的基因片段大小均为 / 图 证实目的基因重组到表面展示载体上 二次克隆成功 即成功构建点突变后的酿酒酵母表面展示重组质粒 / )* ;? * ;#&!&;* ;#&!& 重组质粒 / )* 双酶切产物 ;? * ;#&!&;* ;#&!&#9!!%8!! " /&9 "&! 8 # "/ # 8 / )* 图 重组质粒 822 ) 双酶切电泳图 -2 #*:! " #! %" $ *!822 ) - 酵母表面展示库的免疫荧光检测重组质粒转化酿酒酵母 挑取酵母单克隆 经半乳糖诱导表达使其展示在酵母细胞表面 显微镜观察结果显示在荧光视野下观察到绿色荧光 图 结果表明重组质粒成功表达并展示于酿酒酵母细胞表面 即 %( 基因在酵母表面表达为具有正确高级结构的蛋白 讨 论淋巴细胞介导的免疫监控中 发挥核心作用的 基因都集中在高等脊椎动物的 ; 上 " 基因捕获抗原 内化抗原 使抗原降解并形成 ; 多肽复合物 起抗原递呈作用 因此 ; 作为疾病抗性和易感性的候选基因成为近年来研究抗病育种的热点之一 ; 决定着动物的免疫排斥反应 1 同时也与动物的抗病能力有较强的相关性 ; 类分子表达与否及其表达水平 直接决定免疫应答的发生及强度 其表达水平的改变还参与某些疾病过程的发生 因此它在免疫学上具有重要的研究价值

8 期 许万云等 绵羊 %( 基因外显子 酵母表面展示库的构建及鉴定 * 可见光 荧光 *?!$" 2 9&!! "$" 图 酵母表面展示库的细胞免疫荧光图 -#% # " $$%! #"%$ *"" 人和鼠类的 ; 已进行了广泛而深入的研究 但作为重要的经济物种 绵羊 ; 的研究却相对较少 绵羊的 " 基因与疾病相关的报道最早见于绵羊 ; ) 的多态性与牛白血病相关 - 年 #&&9# 等研究发现 %(& 基因与绵羊肺腺癌和羊慢性进行性肺炎的易感性相关 ; 的类型与动物疾病的抵抗力及生产性能有着广泛的联系 是近年来家畜抗病育种研究中最为活跃的部分 在人 老鼠和牛中 许多研究结果表明 ; 不但控制对疾病的抗性和易感性 也控制疾病的发病历程 因此 ; 组成结构及其与疾病之间的关系对于抗病育种研究具有重要意义 本研究参照!# 上已发表的绵羊 " %( 基因序列 利用生物信息学软件进行序列比对分析获得绵羊 %( 基因编码区序列及外显子 对外显子 前后两端进行点突变为 & 和 $ 酶切位点 并设计特异性突变引物 将 * 池化后扩增外显子 对测序结果运用 * "#& 软件包中的!:;# 进行拼接及序列比对分析 得到 个多态位点 ** 和 通过 &8!& &!8!& 软件对绵羊 %( 基因序列设计 对特异性引物 在上 下游引物中分别引入 & 和 2 酶切位点 并对其 * 进行克隆及序列测定 绵羊 %( 基因序列与原序列一致 对重组质粒及酵母表面展示载体 / 进行 & 和 2 双酶切 连接转化酿酒酵母后获得酵母菌落 对其进行菌落 ) 获得清晰的目的条带 成功构建重组质粒 / )* 通过点突变将外显子 前后两端碱基改变为酶切位点 & 和 $ 进行二次克隆 重新构建点突变后的 / )* 即 / )* 对点突变后重组质粒 / )* 进行 & 和 $ 双酶切 将外显子 切掉 从而可替换连接具有多态性的其他外显子 从而成功构建出绵羊 %( 基因酵母表面展示库 诱导酵母表达并展示蛋白 进行 2 荧光检测 在荧光下 酵母发出绿色荧光 说明 ; )* 蛋白成功表达于酵母细胞表面 具有正确的高级构象 可实现对布鲁氏菌抗原肽的结合筛选 在目前的研究中 通常只对 ; 多态性进行初步分析 探索其与布鲁氏菌病的关联性 而未曾提供一种直接进行蛋白相互作用的方法 本研究首次成功构建绵羊 %( 基因酵母表面展示库 且此库可用于专一性抗原肽的筛选 这为进一步研究布鲁氏菌可溶性蛋白中与绵羊 ; 特异性结合的抗原多肽或蛋白奠定基础 为家畜布鲁氏菌病的有效防制提供新的思路与手段 从而加快分子遗传抗病育种的进程 参考文献 #//# * &";!"#&9! D " 金伯泉 细胞和分子免疫学 ; 西安 世界图书出版社 --1 &!& *$!!!" # # "! # "989& "&#/ # "#"D! &#! - -- ; " $! 8# & $ " 8/#" "% 8/!' $!!/ *# " 8 & D & ' ) & # '!- 1- ;#$%, *;#! *$ $#&%!"# $& 8 8# ##""$!!8# &$ " 8/#" "% 8/!' * %"9$%& #"D

9 中 国 畜 牧 兽 医 卷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贾帅争 孙红琰 王全立 酵母表面展示技术及应用 D 军事医学科学院刊 王 东 李海军 高剑峰 小鼠 基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定 D 江苏农业科学 - 郭春叶 刘林丽 龚月生等 芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建 D 西北农业学报 E# 6$! E #!"# "&9 " $# #!'/&!! "& %#!'/&! 2D $! -! #!$##! - 1 亢孝珍 额尔敦木图 姜建强 等 主要组织相容性复合体 ; 基因研究进展 D 中国畜牧兽医 1 -#&&9# *;9,#& #,"'!#&&#!" # ; # %(&!!/ %8&/$ 8 "$! /#"$!! ;#!?## /9 8 #&%#! #&8# &#!#! $!!/ D *!1 #1 责任编辑 吴 艳

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