htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(18) 1663 DOI: /j 类鼻疽杆菌 Ⅲ 型分泌系统 BPSS1617 蛋白的重组表达及其抗体制备吴利 1, 黎礼达 1, 胡艺 2, 黎元莉 1, 陈海

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盛淳时
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1 1663 DOI: /j 类鼻疽杆菌 Ⅲ 型分泌系统 BPSS1617 蛋白的重组表达及其抗体制备吴利 1, 黎礼达 1, 胡艺 2, 黎元莉 1, 陈海 1, 朱雄 1, 胡治强 2, 马腾飞 2, 韩丹 2, 李倩 2, 曹刘素 2, 尹小毛 2 2, 毛旭虎海南三亚, 海南省三亚市人民医院检验科 1 ; 重庆, 陆军军医大学 ( 第三军医大学 ) 药 2 学与检验医学系临床微生物及免疫学教研室 [ 摘要 ] 目的构建重组表达类鼻疽杆菌 Ⅲ 型分泌系统蛋白 BPSS1617, 并制备其抗体方法采用 PCR 扩增 BPSS1617 全长序列, 克隆至原核表达载体 pet22b, 将重组表达质粒转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) 中进行诱导表达, 免疫新西兰兔, 制备其多克隆抗体, 并通过 Westernblot 免疫荧光和 ELISA 检测抗体的特异性, 并分析该蛋白在类鼻疽杆菌中的亚细胞定位结果成功扩增类鼻疽杆菌 BPC006 株基因组中的 BPSS1617 基因 ; 酶切和测序验证重组表达质粒 pet22bbpss1617 构建成功 ; 经 IPTG 诱导表达包涵体洗涤纯化以及变性复性, 成功获得纯度 >95%, 分子量为的目的蛋白 ; 将纯化的 BPSS1617 重组蛋白免疫新西兰兔, 获得抗 BPSS1617 蛋白多克隆抗体, 经实验验证其特异性良好 ; 同时 BPSS1617 蛋白主要定位于类鼻疽杆菌的细胞质中结论成功构建表达纯化获得 BPSS1617 蛋白, 并成功制备了其特异性多克隆抗体, 并且该蛋白定位于类鼻疽杆菌的细胞质中 [ 关键词 ] 类鼻疽杆菌 ; 蛋白表达 ; 抗体制备与鉴定 [ 中图法分类号 ] R341;R378.99;R392.7 [ 文献标志码 ] A RecombinantexpresionandantibodypreparationofBPSS1617proteinintypeⅢ secretionsystem ofburkhlderiapseudomalei WULi 1,LILida 1,HUYi 2,LIYuanli 1,CHENHai 1,ZHUXiong 1,HUZhiqiang 2,MATengfei 2,HANDan 2,LI Qian 2,CAOLiusu 2,YINXiaomao 2,MAOXuhu 1 1 DepartmentofClinicalLaboratory,SanyaPeople shospital, Sanya,HainanProvince,572000; 2 DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,FacultyofPharmacyand MedicalLaboratoryScience,ArmyMedicalUniversity(ThirdMilitaryMedicalUniversity),Chongqing,400038,China [Abstract] Objective ToconstructarecombinantexpresionsystemforBPSS1617,acomponentof thetypeⅢ proteinsecretionsystem ofburkhlderiapseudomalei,andpreparepolyclonalantibodiesforthis protein.methods ThefullengthcodingsequenceofBPSS1617wasamplifiedwithPCRandclonedintothe prokaryoticexpresionplasmidpet22b.therecombinantplasmidwastransformedintoe.colibl21(de3) strainforexpresionofthetargetprotein,which,afterpurification,wasusedtoimmunizenewzealandwhite rabbitstoobtainthepolyclonalantibodiesofbpss1617.thespecificityoftheantibodieswasevaluatedby Westernbloting, immunofluorescence asay and enzymelinked immunosorbentasay (ELISA). The subcelularlocalizationofbpss1617inburkhlderiapseudomaleicelswasinvestigatedusingtheobtained antibodies.results Theresultsofenzymedigestion and sequencinganalysisverified thesuccesful constructionoftherecombinantpet22bbpss1617expresionplasmid.afteriptg inductionofe.coli, inclusionbodycleansing,purification,solubilizationandrenaturation,weobtainedthetargetprotein(relative molecularmasof )withapurityover95%.fromthewhiterabbitsimmunizedwiththisprotein,we obtainedhighlyspecificpolyclonalantibodiesagainstbpss1617.usingtheseantibodies,weidentifiedthat [ 基金项目 ] 2017 年海南省自然科学基金 (817398) [ 通信作者 ] 毛旭虎, mxh95xy@tom.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 1664 第三军医大学学报,2018,40(18) htp://aammt.tmmu.edu.cn BPSS1617proteinwasmainlylocalizedinthecytoplasmofBurkhlderiapseudomaleicels.Conclusion We succesfulyobtaintherecombinantbpss1617protein,anditsspecificpolyclonalantibodiesandidentifythat BPSS1617islocalizedmainlyinthecytoplasmofBurkhlderiapseudomaleicels. [Keywords] Burkhlderiapseudomalei;proteinexpresion;polyclonalantibodies 类鼻疽伯克霍尔德菌 (Burkholderiapseudomalei) 简称为类鼻疽杆菌, 革兰染色阴性, 不形成荚膜及芽孢, 一端有 3 根以上鞭毛, 运动活泼主要存在水或土壤中, 极易感染和传播, 主要引起以肺炎和内脏多发性脓肿为特点的类鼻疽病 [1-2] 随着环境和气候造成的病原菌扩散和人类活动加剧带来的影响, 全球范围的类鼻疽病例逐渐增多, 我国的海南广东等地正是类鼻疽感染的重灾区 [3-4] 该病与其他疾病的临床症状极易混淆, 临床诊断和治疗都比较困难, 死亡率高达 40%, 研究类鼻疽杆菌的致病机制对其防控具有十分重要的意义 [5-6] 众所周知, 细菌的分泌系统在其致病过程中发挥着重要作用, 如 Ⅲ 型分泌系统 (type3secretionsystem, T3SS) 包括多种与致病相关的复杂分子装置和重要的毒力因子类鼻疽杆菌的 Ⅲ 型分泌系统被称为分子注射器, 其编码基因位置基因簇包括 T3SS1(BPSS ) T3SS2(BPSS ) 和 T3SS3(BPSS ) [7], 其中 BPSS1617 的功能目前尚不清楚因此本研究尝试重组表达该蛋白并制备其特异性多克隆抗体, 分析该蛋白在细菌中的定位, 为研究 BPSS1617 的生物学功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料质粒和菌株 pet22b 表达载体大肠埃希菌 BL21(DE3) 类鼻疽杆菌 BPC006 菌株, 人肺癌上皮细胞 A549, 由陆军军医大学 ( 第三军医大学 ) 药学与检验医学系临床微生物及免疫学教研室保存试剂细菌 DNA 基因组提取试剂盒 DNA 胶回收试剂盒质粒提取试剂盒氨苄霉素购自北京天根 ;DNA 聚合酶 DNA 连接酶 BamHⅠ 和 XhoⅠ 限制性内切酶 DNAMarker 蛋白 Marker 购自大连 TaKaRa 公司 ;4% 多聚甲醛 TritonX100 尿素,HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体购自北京中杉金桥公司 ; 驴抗兔荧光标记二抗 AlexaFluor594 DMEM 培养基胎牛血清牛血清蛋白 BSA 购自 ThermoFisher; 参照文献 [8] 配置缓冲液 A 缓冲液 B 缓冲液 Ⅰ 缓冲液 Ⅱ 缓冲液 Ⅲ 实验动物新西兰大白兔 2 只, 雌性,4 周龄,1.0 ~1.2kg, 购自第三军医大学实验动物中心 1.2 方法 PCR 引物的设计和合成根据 GenBank 公布的 BPC006 菌株的 BPSS1617 基因序列及质粒 pet 22b 多克隆位点序列设计 PCR 引物,BPSS1617 基因扩增的上游引物 P1:5 CGCGGATCCATGGTTCAGTTTA ACGACATC3,(BamHⅠ ); 下游引物 P2:5 CCG CTCGAGTCAGGAATAGGTCAGCACGAG3,(XhoⅠ) P1 和 P2 的 5 端分别引入 BamHⅠ 和 XhoⅠ 酶切位点 ( 划线部分 ) 和保护碱基, 由 Invitrogen 公司合成引物序列 pet22bbpss1617 表达载体的构建以 BPC006 菌株的基因组为模板, 对目的基因 BPSS1617 (870bp) 进行 PCR 扩增并将扩增得到的 BPSS1617 片段和 pet22b 质粒同时进行 BamHⅠ /XhoⅠ 双酶切, 使用 DNA 连接酶将酶切片段和载体于 16 连接过夜转化到 E.coliBL21(DE3) 感受态细胞内, 然后涂布在氨苄抗性的 LB 平板上,37 培养 24h, 将阳性单克隆转接于氨苄抗性 LB 液体培养基中,37 振荡过夜培养, 提取细菌质粒后进行 BamHⅠ /XhoⅠ 双酶切, 并对酶切验证正确的重组质粒进行 DNA 测序重组 BPSS1617 蛋白的表达检测阳性重组大肠杆菌 BL21(DE3) 在 37 培养至 D(600) 为 0.6~0.8, 接着加入 IPTG 至终浓度为 0.1mmol/L, 并在不同温度 ( ) 和不同诱导时间 (3 5 16h) 进行培养, 通过超声破碎菌体, r/min 离心 20min 分别收集上清和沉淀, 采用 SDSPAGE 检测目的蛋白表达情况包涵体蛋白的溶解和复性离心收集重组大肠杆菌培养物, 缓冲液 A 漂洗细菌沉淀, 然后用缓冲液 B 重悬菌体,200W 超声破碎, 离心收集包涵体沉淀, 并依次使用缓冲液 Ⅰ 缓冲液 Ⅱ 缓冲液 Ⅲ 分别超声洗涤 1 次,1500r/min 离心 30min, 再收集包涵体沉淀用终浓度为 8mol/L 的尿素缓冲液室温放置 30min 后振荡 2h, 然后 6000r/min 离心 30min 吸取上清再将溶解后的蛋白质适当稀释并装进透析袋中, 依次放入到 mol/L 尿素以及 PBS 溶液中分别透析 2h, 最后将透析袋里的溶液于 12000r/min 离心 2min 后留取上清抗 BPSS1617 蛋白多克隆抗体的制备及效价

1665 测定用等体积弗氏完全佐剂将 400μg 重组 BPSS1617 蛋白充分乳化, 皮下多点注射免疫新西兰大白兔, 按照每 7d 免疫 1 次, 共免疫 3 次, 最后 1 次加强免疫后 14d 时, 心脏取血, 离心分离血清,-80 保存抗体效价检测 : 使用重组 BPSS1617 蛋白作为抗原包被酶标板 (0.

2.7 免疫荧光检测类鼻疽杆菌 BPSS1617 蛋白在 12 孔细胞培养皿中放入细胞爬片, 接种人肺癌上皮细胞 A549,37,5% CO 2 条件下培养至密度为 70% ~80%, 用类鼻疽杆菌以感染复数 MOI=10 感染细胞 2h 后, 弃取培养基, 用 PBS 缓冲液清洗细胞 3 次, 加入含终浓度为 200ng/mL 卡那霉素的 DMEM 培养基, 继续培养 4h, 随后 4%

3 1665 测定用等体积弗氏完全佐剂将 400μg 重组 BPSS1617 蛋白充分乳化, 皮下多点注射免疫新西兰大白兔, 按照每 7d 免疫 1 次, 共免疫 3 次, 最后 1 次加强免疫后 14d 时, 心脏取血, 离心分离血清,-80 保存抗体效价检测 : 使用重组 BPSS1617 蛋白作为抗原包被酶标板 (0.4μg/ 孔 ),5% 脱脂奶粉进行封闭, 将倍比释液 ( ~ ) 的兔抗血清加入酶标板,37 孵育 30min, 加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 作为二抗, 并以未免疫的家兔血清作为阴性对照, 抗体滴度检测的阳性结果判断标准为 : 样品 / 阴性对照 ( 吸光度 A) Westernblot 验证抗体特异性将目的蛋白电泳后条带转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 薄膜上, 将制备的抗血清以稀释度进行孵育, 以 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体作为二抗检测 BPSS1617 蛋白及类鼻疽杆菌全菌蛋白, 同时设置牛血清蛋白 BSA 作为阴性对照免疫荧光检测类鼻疽杆菌 BPSS1617 蛋白在 12 孔细胞培养皿中放入细胞爬片, 接种人肺癌上皮细胞 A549,37,5% CO 2 条件下培养至密度为 70% ~80%, 用类鼻疽杆菌以感染复数 MOI=10 感染细胞 2h 后, 弃取培养基, 用 PBS 缓冲液清洗细胞 3 次, 加入含终浓度为 200ng/mL 卡那霉素的 DMEM 培养基, 继续培养 4h, 随后 4% 多聚甲醛固定细胞 30min, 再用 0.3% TritonX100 透膜 5min, 加入稀释的 BPSS1617 多克隆抗体孵育 1h, 将驴抗兔荧光标记二抗 AlexaFluor594 以稀释后避光孵育 1h, 最后用稀释的 DAPI 避光孵育 10min 并用抗荧光淬灭剂进行封片,4 湿盒内避光保存至后续激光共聚焦镜观察时使用 BPSS1617 蛋白的亚细胞定位培养类鼻疽杆菌至光密度值为 0.8~1.0, 在 r/min 离心 15min 收集菌体, 冰上 200W 超声破碎细菌 10min, r/min 离心 45min 后取上清液上清液 r/min 离心 1h, 分离获得细胞壁组分沉淀 ; 再将上清 r/min 离心 4h, 获得细胞膜组分沉淀, 溶液上清则为胞质组分 Western blot 检测各组分中 BPSS1617 蛋白含量 2 结果 2.1 BPSS1617 基因的扩增及原核表达载体 pet22b BPSS1617 的构建以 BPC006 菌株全基因组 DNA 为模板, 经 PCR 扩增得到 670bp 目的基因 BPSS1617( 图 1A), 重组质粒 pet22bbpss1617 经 BamHⅠ /XhoⅠ 双酶切鉴定目的片段与理论大小一致 ( 图 1B), 经测序后验证目的片段无突变 A:PCR 扩增 BPSS1617M:DNA 相对分子量 ;1:BPSS1617 基因扩增产物 ;B:pET22bBPSS1617 重组质粒双酶切鉴定 M:DNA 相对分子量 ;1:pET22bBPSS1617BamHⅠ /XhoⅠ 双酶切图 1 BPSS1617 基因扩增产物和 pet22bbpss1617 载体鉴定 2.2 BPSS1617 蛋白的诱导表达阳性重组子 25, 经 IPTG 诱导 5h, 与未诱导菌相比在相对分子量为位置均增加了 1 条蛋白条带, 与 BPSS1617 预期蛋白分子量一致, 目的蛋白表达量达 50.1%, 但主要为包涵体形式 ( 图 2) M: 蛋白相对分子量 ;1: 未诱导 ;2: 诱导 5h;3: 诱导 5h 上清 ;4: 诱导 5h 沉淀 2.3 重组蛋白的纯化图 2 重组蛋白的表达鉴定 1L 阳性工程菌经过 25,IPTG 诱导 5h, 离心获得 2.1g 菌体, 通过超声破碎离心纯化包涵体 BPSS1617, 经过变性复性, 获得了纯度为 95.5% 的可溶性 BPSS1617 蛋白 ( 图 3) 2.4 多克隆抗体的特异性检测 BPSS1617 重组蛋白免疫新西兰大白兔 35d 后收集血清,ELISA 检测血清抗体效价达以 BPSS1617 蛋白为抗原制备的抗血清作为一抗, 以 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体作为二抗, 对 BPSS1617 蛋白进行 Westernblot 检测, 在出现特异性印迹条带 ( 图 4A) 免疫荧光实验结果显示类鼻疽杆菌结合

1666 第三军医大学学报,2018,40(18) htp://aammt.tmmu.edu.

;B: 类鼻疽杆菌免疫荧光染色 ( 400, 箭头所示为类鼻疽杆菌 ) 图 4 BPSS1617 多克隆抗体特异性鉴定 2.

类鼻疽杆菌主要是热带地区土壤和死水中的常驻菌, 特别多见于稻田中 [9] 中国类鼻疽疫源地主要分布于海南广东广西等南部边缘热带和亚热带地区, 1991 年中国首次由广东湛江报道了 4 例类鼻疽患者, 此后也从海南广东和广西的水样中分离到类鼻疽杆菌 [6] 类鼻疽一般呈散发, 无明显的季节性, 全年均可发生 ; 任何年龄人群均可患此病, 性别分布差异无统计学意义从目前报道的临床病例来看,

4 1666 第三军医大学学报,2018,40(18) htp://aammt.tmmu.edu.cn BPSS1617 多克隆抗体后菌体呈现红色荧光而大肠埃希菌结合其多抗没有产生相应的荧光 ( 图 4B), 由此说明 BPSS1617 多克隆抗体是针对类鼻疽杆菌的特异性多抗 M: 蛋白相对分子量 ;1:BPSS1617 复性可溶重组蛋白图 3 重组蛋白包涵体复性纯化 A:Westernblot 检测 BPSS1617 多克隆抗体特异性 1: 牛血清蛋白 BSA;2:BPSS1617 蛋白 ;B: 类鼻疽杆菌免疫荧光染色 ( 400, 箭头所示为类鼻疽杆菌 ) 图 4 BPSS1617 多克隆抗体特异性鉴定 2.5 蛋白质亚细胞定位 Westernblot 检测类鼻疽杆菌细胞壁细胞膜细胞质各组分中 BPSS1617 蛋白含量, 分析 BPSS1617 蛋白在类鼻疽杆菌中的亚细胞定位, 结果如图 5 发现 BPSS1617 主要定位于胞质, 细胞壁中也少量分布 3 讨论 1: 细胞壁组分 ;2: 细胞膜组分 ;3: 细胞质组分图 5 Westernblot 检测 BPSS1617 蛋白亚细胞定位类鼻疽杆菌主要是热带地区土壤和死水中的常驻菌, 特别多见于稻田中 [9] 中国类鼻疽疫源地主要分布于海南广东广西等南部边缘热带和亚热带地区, 1991 年中国首次由广东湛江报道了 4 例类鼻疽患者, 此后也从海南广东和广西的水样中分离到类鼻疽杆菌 [6] 类鼻疽一般呈散发, 无明显的季节性, 全年均可发生 ; 任何年龄人群均可患此病, 性别分布差异无统计学意义从目前报道的临床病例来看, 该病的临床表现复杂多样, 致病菌对多种常用抗生素耐药, 因此该病的临床诊断和治疗十分棘手 [10] 近年来, 全球学者对该病的致病机制和特点进行了深入研究, 已确认了类鼻疽杆菌的一些毒力因子, 如荚膜多糖脂多糖菌毛和分泌系统等 [11] 类鼻疽杆菌的 Ⅲ 型分泌系统在侵袭宿主细胞, 促进胞内增殖和毒力发挥过程中具有重要作用 [7,12-14], 并由 T3SS1 T3SS2 和 T3SS3 三个基因簇组成每个基因簇通常由结构组分分子伴侣和效应蛋白构成, 共同组装成类似分子注射器的装置, 通过将该装置插入宿主细胞膜中, 把细菌效应蛋白递送到宿主细胞胞质溶胶中发挥作用 [15] 类鼻疽杆菌的 T3SS3 与沙门氏菌 (Salmonela) 和志贺氏菌 (Shi gela) 的 inv/mxi/spat3ss 非常相似 [16], 并且在类鼻疽杆菌动物感染模型中发挥重要作用而 T3SS1 和 T3SS2 与植物病原菌青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum) 和黄单胞菌属 (Xanthomonas) 的 T3SS 密切相关 [17], 因此作为一种土壤腐生菌, 表明类鼻疽杆菌也是一种潜在的植物病原菌研究表明 T3SS1 和 T3SS2, 在类鼻疽杆菌感染番茄植株过程中扮演关键作用 [18], 能够促进其在植物体宿主中的适应能力, 从而在植物和动物之间的造成感染和播散, 但其发挥的功能和具有机制需要进一步研究类鼻疽杆菌的 BPSS1617 蛋白是由 T3SS2 基因簇编码的效应蛋白, 但具体功能未知本研究成功扩增该基因并构建了 pet22bbpss1617 重组质粒, 重组质粒转化到 E.coli 宿主菌 BL21(DE3) 后经 IPTG 诱导表达纯化, 最终得到分子量为的高纯度目的 BPSS1617 蛋白然后我们应用纯化的 BPSS1617 蛋白免疫家兔制备多克隆抗体, 兔抗血清 ELISA 效价均高达 , 并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应最后我们通过分析蛋白质亚细胞组分和多克隆抗体的结合情况来定位 BPSS1617 蛋白, 结果显示 BPSS1617 蛋白主要存在于类鼻疽杆菌的胞质中, 少量存在于细胞壁上, 以上研究工作为进一步深入研究其在类鼻疽杆菌感染植物体宿主过程中的功能和机制奠定基础参考文献 : [1] LIMMATHUROTSAKULD,GOLDING N,DANCE D A, etal.predictedglobaldistributionofburkholderiapseud omaleiandburdenofmelioidosis[j].natmicrobiol,2016,

5 1667 1:15008.DOI: /nmicrobiol [2]WIERSINGAW J,VANDERPOLLT,WHITENJ,etal. Melioidosis:insightsintothepathogenicityofBurkholderia pseudomalei[j].natrevmicrobiol,2006,4(4): doi: /nrmicro1385. [3] 毛旭虎. 加强类鼻疽的研究 [J]. 第三军医大学学报, 2011,33(13): MAOX H.Progresonmelioidosis[J].JThirdMilMed Univ,2011,33(13): [4] 吴华, 王旭明, 黄东良. 海南类鼻疽的流行病学特点和临床特点调查研究 [J]. 中国全科医学,2013,16(8): DOI: /j.isn WUH,WANG X M,HUANG D L.Epidemiologicaland clinicalfeaturesofmelioidosisinhainan[j].chingen Prac,2013,16(8): DOI: /j.isn [5]KUNDANGARRS,BHATSN,MOHANTYSP.Melioid osismimickingtubercularcoldabsces[j].bmjcaserep, 2017,2017.pi:bcr DOI: /bcr [6] FANGY,CHENH,LIYL,etal.MelioidosisinHainan, China:aretrospectivestudy[J].TransR SocTropMed Hyg,2015,109(10): DOI: /trstmh/ trv065. [7] VANDERBROEKCW,STEVENSJM.TypeⅢ secretionin themelioidosispathogenburkholderiapseudomalei[j].front CelInfectMicrobiol,2017,7:255.DOI: /fcimb [8] 胡艺, 胡志强, 马腾飞, 等. 类鼻疽杆菌 Ⅲ 型分泌系统 BPSS1395 蛋白表达及其抗体制备与鉴定 [J]. 第三军医大学学报,2017,39(10): DOI: /j HUY,HUZQ,MATF,etal.Expresionandidentification ofrecombinantburkholderiapseudomaleitypeⅢ secretion systembpss1395proteinandpreparationofitspolyclonalan tibodies[j].jthirdmilmeduniv,2017,39(10): doi: /j [9] CURRIEBJ.Melioidosis:evolvingconceptsinepidemiolo gy,pathogenesis,andtreatment[j].seminrespircritcare Med,2015,36(1): DOI: /s [10] HEMARAJATAP,BAGHDADIJD,HOFFMANR,etal. Burkholderiapseudomalei:chalengesfortheclinicalmicro biologylaboratory[j].jclinmicrobiol,2016,54(12): DOI: /JCM [11] STONEJK,DESHAZERD,BRETTPJ,etal.Melioid osis:molecularaspectsofpathogenesis[j].expertrevanti InfectTher,2014,12(12): DOI: / [12] JOOMPA P,PONNIKORN S, ROYTRAKUL S, etal. Sitirukroytrakul,3investigationofhostpathogeninteraction betweenburkholderiapseudomaleiand autophagyrelated proteinlc3usinghydrophobicchromatographybasedtech nique[j].celbiosci,2017,7(1):45.doi: / s [13] KANG W T,VELLASAMY K M,RAJAMANIL,etal. BurkholderiapseudomaleitypeⅢ secretedproteinbipc: roleinactinmodulationandtranslocationactivitiesrequired forthebacterialintracelularlifecycle[j].peerj,2016,4 (12):e2532.DOI: /peerj [14] VANDERBROEKCW,ZAINALABIDINN,STEVENSJ M.BipC,apredictedBurkholderiapseudomaleitype3se cretionsystemtranslocatorproteinwithactinbindingactivity [J].FrontCelInfectMicrobiol,2017,7:333.DOI: /fcimb [15]DUJ,REEVESAZ,KLEINJA,etal.ThetypeⅢ secre tionsystem apparatusdeterminestheintracelularnicheof bacterialpathogens[j].procnatlacadsciusa,2016, 113(17): DOI: /pnas [16]StevensM P,WoodM W,TaylorLA,etal.Aninv/axi spaliketypeⅢ proteinsecretionsystem inburkholderia pseudomaleimodulatesintracelularbehaviourofthepatho gen[j].molmicrobiol,2002,46(3): doi: /j x. [17] WINSTANLEYC,HALESBA,HARTCA.Evidencefor thepresenceinburkholderiapseudomaleiofatypeⅢ se cretionsystemasociatedgenecluster[j].jmedmicrobiol, 1999,48(7): DOI: / [18] LEEYH,CHENY,OUYANGX,etal.Identificationof tomatoplantasanovelhostmodelforburkholderiapseud omalei[j].bmc Microbiol,2010,10:28.DOI: / ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑王红 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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