2015,35(4) 郭兆来等 : 菠菜 SoHb 基因的原核表达及功能分析 55 司 ; 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗购自康为世纪生物科技有限公司 ; 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂氨苄青霉素等为 Sigma 公司产品 ; 蛋白纯化试剂盒 MagneHis TM Pr

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殷轶粒陶
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2015,35(4):54 59 DOI: /j.cb 菠菜 SoHb 基因的原核表达及功能分析郭兆来白学贵严金平陈宣钦李昆志徐慧妮 ( 昆明理工大学生命科学与技术学院昆明 ) 摘要为了进一步揭示菠菜非共生血红蛋白 (SoHb) 的功能, 通过 RT PCR 的方法从菠菜根中克隆了 SoHb 基因编码区全长序列, 并将其克隆到原核表达载体 pet32a 上, 构建原核表达载体 pet32a SoHb, 并转化大肠杆菌 BL21star(DE3) 获得原核表达工程菌株通过 IPTG 法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达, 融合蛋白分子质量约为 38kDa, 且在上清液和包涵体中均有表达, 可溶性部分经 Ni 2+ NTA 亲和柱纯化, 获得纯化的融合蛋白与空载体相比, 重组菌对硝化胁迫的抗性增加以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠, 制备多克隆抗体, 并对其进行了 Westernblot 检测实验结果为进一步研究菠菜 SoHb 基因功能奠定了基础关键词非共生血红蛋白大肠杆菌表达硝化胁迫中图分类号 Q78 植物血红蛋白是一类由珠蛋白和血红素组成的结合蛋白, 广泛存在于植物界根据植物血红蛋白的序列表达方式以及与配体的结合性质, 植物血红蛋白可分为三类 : 共生的血红蛋白 (symhb) 非共生的血红蛋白 (nshb 或 GLB) 截短的血红蛋白 (trhb) [1 2] 共生血红蛋白主要存在于豆类和非豆类植物的固氮根瘤菌感染的细胞中 [3] 截短的血红蛋白在植物中发现得较晚, 最近的研究表明其在末端氧化氧的感应和清除以及 NO 的清除等方面发挥作用 [4 6] 非共生的血红蛋白的分布范围很广泛, 不仅存在于含有共生血红蛋白的植物中, 而且也存在于其他植物中 [3] 非共生的血红蛋白可以分为两类 : 非共生血红蛋白 1(clas1) 和非共生血红蛋白 2(clas2) 植物非共生血红蛋白在大麦水稻玉米拟南芥番茄棉花山黄麻属等许多单子叶和双子叶植物中存在 [7], 许多非共生血红蛋白基因已经从这些植物中获得, 这些基因的编码序列高度相似植物非共生血红蛋白在植物生长发育和抗逆性等方面发挥重要作用 [3] 病菌侵染缺氧胁迫营养缺乏激素处理等多种生物和非生物胁迫下,nsHb 表达量收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ; ) 云南省应用基础研究面上项目 (2010ZC053) 云南省教育厅科学研究基金 (2011Z109) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :hnxusun@gmail.com 增加 [8 11] 硝酸盐亚硝酸盐和 NO 供体显著诱导水稻的 ORYsaGLB1a 和 ORYsaGLB1b 的表达 [12] NO 在植物的种子萌发细胞分裂开花和衰老等 [13 16] 生长发育过程以及对生物和非生物胁迫应答等方面发挥重要作用 [17 19] 现在越来越多的研究表明在非生物胁迫和其他细胞水平上, 植物 nshb 蛋白调控细胞内的 NO 水平 [10,20 22] 拟南芥的血红蛋白 1 通过与 NO 反应形成 S 亚硝基血红蛋白, 清除 NO, 减少了低氧胁迫下 NO 的释放 [21] 拟南芥非共生血红蛋白通过 Hb/ NO 循环, 依赖 NAD(P)H 将 NO 解毒为 NO3 [23 24] 大麦 nshb 在低氧胁迫下参与 NO 代谢, 过表达大麦 nshb 的转基因拟南芥中 NO 释放量减少 [11] 本研究构建了菠菜非共生血红蛋白 1(SoHb) 基因编码区与 His 融合在一起的融合表达载体, 并使其在大肠杆菌中表达, 并对该蛋白质进行纯化抗体制备及 Westernblot 检测分析, 以期为 SoHb 蛋白质功能研究和表达水平检测奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料菠菜品种为超级菠菜, 购于云南省昆明市小板桥种子市场限制性内切酶 T4DNA 连接酶 dntp Mixture DNAMarker pmd 18T 载体等购自 TaKaRa 公

2 2015,35(4) 郭兆来等 : 菠菜 SoHb 基因的原核表达及功能分析 55 司 ; 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗购自康为世纪生物科技有限公司 ; 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂氨苄青霉素等为 Sigma 公司产品 ; 蛋白纯化试剂盒 MagneHis TM ProteinPurification System 为 Promega 公司产品 ; 大肠杆菌菌株 DH5a 和 BL21star(DE3) pet32a 载体均为本实验室保存 1.2 方法 SoHb 基因的克隆根据菠菜 SoHb 的序列 (GenBank 注册号 :KC142173) 设计引物,Hb FB(5 ggatcc ATGAGTCTCGAAAATGTCAAC 3, 下划线为 BamHI 酶切位点 ) 和 Hb RX (5 ctcgag ATGAACTTCTAAAATTGTC 3, 下划线为 XholI 酶切位点 ) PCR 扩增程序为 :94 预变性 5min,94 变性 30s,55 复性 30s,72 延伸 45s,72 后延伸 10 min,30 个循环 PCR 产物经过琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收后, 连接到 pmd 18T 载体中, 由上海生工生物技术有限公司测序 pet32a SoHb 原核表达载体的构建提取含有 pmd18t SoHb 阳性克隆的质粒, 用 BamHI 和 XholI 进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳检测后用试剂盒回收挑取含 pet32a 空载体的克隆, 提取质粒进行双酶切 ( 步骤同上 ), 将回收的目的片段与酶切后 pet32a 空载体用 T4DNA 连接酶连接, 得到重组表达质粒 pet32a SoHb, 转化 E.coliBL21 感受态细胞, 筛选阳性克隆由上海生工生物技术有限公司测序, 鉴定所插入的序列及其读码框是否正确重组蛋白的原核表达将阳性工程菌在含氨苄青霉素 (Amp100mg/L) 的 LB 液体培养基中培养至 OD 值达 0.6 左右时, 加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG (Isopropyl beta D thiogalactoside), 在 16 下诱导 h,28 和 37 诱导 8h, 进行 SDS PAGE 电泳鉴定表达情况融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备大量培养含重组质粒 pet32a SoHb 的表达菌株, 优化条件诱导表达 SoHb 蛋白质, 粗裂解液经 10000r/min 离心 15min, 收集上清液, 加入洗脱缓冲液重悬浮, 超声波破碎 5min, 分别利用 Ni 2+ NTA 亲和柱纯化并进行 SDS PAGE 凝胶电泳分析用纯化得到的融合蛋白为抗原,4 次免疫昆明小鼠后采集血液, 制备抗血清 pet32a SoHb 重组菌的硝化胁迫耐受性分析将转化 pet32a SoHb 和 pet32a 的 BL21 菌种接种于 5 ml 液体含氨苄青霉素的 LB 中,37 200r/min 摇床培养过夜次日以的比例转接到新的含氨苄青霉素液体 LB 培养基中, 在 37 条件下,200r/min 摇床培养至 OD 值约为 0.6, 随后加入终浓度 1mmol/L 的 1PTG 进行诱导表达, 同时分别加入 100 和 500μmol/L NO 供体硝普钠 (SNP) 进行硝化胁迫耐受性分析, 以不加 SNP 为对照处理, 处理后 min 后取样, 测定 650nm 下的吸光度值实验重复 3 次 Westernblot 分析样品蛋白经 SDS PAGE 电泳后, 经电转仪恒压 15V20min 转移到硝酸纤维素膜上, 用含 5% 脱脂奶粉的 PBST 溶液 4 封闭过夜, 清洗后加入制作的多克隆抗体 ( ), 于摇床上 37 反应 1.5h,PBST 洗 3 次 ; 再加 HRP 标记的羊抗兔 IgG (1 3000),37 摇床反应 1.5h,PBST 洗 3 次取等体积的 ECL 试剂 A 液 B 液混合滴于膜正面, 压上 X 光片, 定影显影后拍片保存 2 结果与分析 2.1 SoHb 基因的克隆及 pet32a SoHb 原核表达载体的构建提取菠菜根系的总 RNA, 以反转录后的 cdna 为模板, 经 PCR 扩增和电泳检测, 得到大小约为 500bp 的特异性条带, 将产物连接到 pmd 18T 载体上, 获得重组质粒 pmd18t SoHb, 测序结果与网站中公布的序列完全一致, 表明我们所克隆的基因为菠菜的 SoHb 基因 ( 图 1a) pmd18t SoHb 中的 SoHb 基因完整编码框通过 BamHI 和 XholI 酶切回收, 连接入原核表达载体 pet32a 中, 获得重组质粒 pet32a SoHb 双酶切分析结果显示可切出大约 500bp 的条带 ( 图 1b) 测序证实重组质粒插入的外源基因序列未突变读码框正确, 表明 SoHb 基因的原核表达载体 pet32a SoHb 构建成功 2.2 pet32a SoHb 的原核表达将构建好的原核表达载体 pet32a SoHb 转化大肠杆菌 BL21(DE3) 用 1mmol/LIPTG 在诱导不同时间后, 提取大肠杆菌总蛋白进行 SDS PAGE 分析结果显示, 插入有外源片段的重组质粒 pet32a SoHb 经 IPTG 诱导后, 能够表达 1 条约 38kDa 的特异蛋白带, 且其表达量在 16 时, 在 0~8h 内, 随处理时间的增加而增加 ( 图 2)

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No.

3 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 白的表达 ( 图 3) 对上清液利用 Ni 2+ NTA 亲和柱纯化目的蛋白, 分别用 mmol/L 的咪唑洗脱液进行洗脱, 结果发现 200mmol/L 的咪唑溶液洗脱后, 经 SDS PAGE 凝胶电泳检测出 1 条 38kDa 左右单一条带表明 SoHb 基因已在大肠杆菌中得到了融合表达, 并成功进行了纯化图 1 SoHb 基因的 RT PCR 扩增 (a) 及 pet32a SoHb 重组质粒酶切鉴定 (b) Fig.1 RT PCRamplificationanalysisofSoHb ofspinach(a)andrestrictenzymeanalysis ofpet32a SoHbplasmid(b) M:Marker;1:ThePCRproductofSoHb;2:Therestrictenzyme analysisproductofpet32a SoHb 图 2 SDS PAGE 检测 pet32a SoHb 融合蛋白的表达 Fig.2 SDS PAGEanalysisoftheexpresion ofpet32a SoHbfusionprotein M:Proteinmolecularweightmaker;1:BL21(pET32a)totalprotein beforeinduction;2:bl21(pet32a)totalproteinafter1mmol/l IPTGinductionfor8h;3~7:BL21(pET32a SoHb)totalprotein after1mmol/liptginductionfor0,2,4,6,8hat16 ;8~9: BL21(pET32a SoHb)totalproteinafter1mmol/LIPTGinduction for8hat28 and37,respectively 2.3 pet32a SoHb 原核表达蛋白的纯化将构建好的原核表达载体 pet32a SoHb 转入大肠杆菌 BL21(DE3), 在 16 下, 经 1mmol/LIPTG 诱导扩大培养, 使蛋白质充分表达诱导菌经超声波处理后, 离心收集上清液和沉淀, 分别进行 SDS PAGE 电泳, 结果表明, 重组菌裂解的上清和沉淀中都有目的融合蛋图 3 SDS PAGE 检测 pet32a SoHb 融合蛋白的纯化 Fig.3 SDS PAGEanalysisofthepurification ofpet32a SoHbfusionprotein M:Proteinmolecularweightmaker;1:BL21(pET32a SoHb)total proteinafterinductionfor6h;2~3:thesupernatantandthepelet partofbl21(pet32a SoHb)totalproteinafterinductionfor6h;4 ~5:Elutedfractionwith10mmol/Limidazolebuferforthefirstand secondtime;6~7:elutedfractionwith200mmol/limidazolebufer forthefirstandsecondtime 2.4 pet32a SoHb 重组菌的硝化胁迫耐受性分析在 37,IPTG 终浓度为 1mmol/L 的条件下, 外源施加 100 和 500μmol/LSNP 进行硝化胁迫分析结果表明, 在正常 LB 培养基里,pET32a SoHb 的生长速度在 100min 后开始增加, 而 pet32a 空载体在 200min 后才开始增加外源施加 100 和 500μmol/LSNP 后, pet32a SoHb 重组菌的生长速度一直高于 pet32a 空载体, 在 450min 时,pET32a SoHb 重组菌的吸光度值分别为 1.02 和 0.61, 而空载体的吸光度值分别为 0.32 和 0.089( 图 4) 结果说明 pet32a SoHb 重组菌对硝化胁迫的耐受性增强 2.5 多克隆抗体的 Westernblot 检测将纯化的融合蛋白免疫昆明小鼠, 制备抗体利用 Westernblot 方法检测 SoHb 融合蛋白多克隆抗体的特异性和灵敏度, 结果显示 pet32a SoHb 原核表达菌

4 2015,35(4) 郭兆来等 : 菠菜 SoHb 基因的原核表达及功能分析 57 图 4 SoHb 重组菌在硝化胁迫下的生长曲线 Fig.4 Growthcurveoftherecombinant pet32a SoHbundernitrosativestres 体总蛋白纯化的原核表达的目的蛋白处均出现一条目的条带 ( 图 5) 抗体的稀释倍数为 , 表明该抗体的效价较高, 可以用于后续试验图 5 SoHb 多克隆抗体的 Westernblot 检测 Fig.5 Westernblotanalysisofpolyclonal antiserum ofthesohbprotein 1~2:TotalproteinofBL21(pET32a);3~4:TotalproteinofBL21 (pet32a SoHb);5:PurifiedpET32a SoHbprotein 3 讨论植物非共生血红蛋白基因在植物界广泛存在 nshb 基因在逆境胁迫下, 尤其是低氧胁迫下发挥重要作用在蛋白水平上研究 nshb, 对于其功能的深入研究具有重要的意义大肠杆菌原核表达系统制备重组蛋白质具备不受寄主影响成本较低周期相对较短表达量大高效稳定等很多优点, 这项技术已被广泛应用于多种植物基因的蛋白质表达研究 [25] 本研究通过原核表达的方法在大肠杆菌中表达了菠菜 SoHb 基因的蛋白实验结果表明 SoHb 在大肠杆菌中高效表达, 我们通过 Ni 2+ NTA 亲和层析法纯化了该蛋白, 制备了其特异性多克隆抗体蛋白质印迹检测显示, 其可以和对应的抗原特异结合显示单一条带, 为后续进一步研究 SoHb 的生物学功能奠定了基础血红蛋白参与 NO 的清除 [26 27] nshb 抑制表达的转基因苜蓿根系中的 NO 积累量是过表达植株中的 2.5 倍 [20], 低氧胁迫下不同玉米细胞系中的 NO 含量与 nshb 的含量呈负相关 [28] 将百脉根非共生血红蛋白转化酵母黄素血红蛋白 (flavohb) 突变体, 发现 Glb1 2 提高了由 S 亚硝基谷胱甘肽诱导的硝化胁迫抗性 [29] 本研究也发现 pet32a SoHb 重组表达菌对硝化胁迫的抗性增强, 与拟南芥 Glb1 能在体内清除 NO 结果一致 [30] nshb 也表现出类似过氧化物酶活性, 参与 NO 代谢, 在植物与病菌的相互作用中可保护植物免受硝化胁迫 [1] [31] 杨礼香等通过原核表达拟南芥血红蛋白 1(AtGLB1) 发现其能与过氧化氢相互作用但 [32] Violante Mota 等研究了水稻中融合的血红蛋白的过氧化物酶活性发现, 与典型的植物过氧化物酶相比, 水稻 Hb1 清除 H 2 O 2 的能力较差, 认为植物中的 nshb 不可能作为过氧化物酶发挥作用我们同样研究了 pet32a SoHb 重组表达菌在 H 2 O 2 胁迫下的生长曲线, 与 pet32a 空载体相比, 重组菌的生长同样受到抑制 ( 数据未显示 ), 说明菠菜 SoHb 可能不具有过氧化物酶的活性参考文献 [1] DordasC.Nonsymbiotichemoglobinsandstrestolerancein plants.plantsci,2009,176(4): [2]Jokipi LukkariS,FreyA D,KalioPT,etal.Intrinsicnon symbiotic and truncated haemoglobins and heterologous Vitreoscilahaemoglobinexpresioninplants.JExpBot,2009, 60(2): [3] 徐慧妮, 赵秀玲, 何小钊, 等. 植物非共生血红蛋白的研究进展. 植物生理学报,2012,48(3): XuHN,ZhaoXL,HeXZ,etal.Researchprogresinplant non symbiotichemoglobin.plantphysiologyjournal,2012,48 (3): [4]WitenbergJB,BolognesiM,WitenbergBA,etal.Truncated hemoglobins:anewfamilyofhemoglobinswidelydistributedin bacteria,unicelulareukaryotes, and plants. JBiolChem, 2002,277: [5]MilaniM,PesceA,OueletH,etal.Truncatedhemoglobinsand

5 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No nitricoxideaction.iubmblife,2003,55: [6]KimDY,HongM J,SeoY W.RoleofwheattrHbinnitric oxidescavenging.molbiolrep,2014,41(9): [7]HebelstrupKH,IgamberdievAU,HilRD.Metabolicefectsof hemoglobingeneexpresioninplants.gene,2007,398(1 2): [8]SeregelyesC, BarnaB, HennigJ, etal. Phytoglobinscan interferewith nitricoxidefunctionsduringplantgrowth and pathogenicresponses:atransgenicapproach.plantsci,2003, 165(3): [9] OhwakiY, Kawagishi KobayashiM, Wakasa K, etal. Expresionanalysisofthetwoclas 1non symbiotichemoglobin genesinculturedricecels.plant& CelPhysiol,2005,46: S189 S189. [10] IgamberdievA U,BykovaN V, HilR D. Structuraland functionalpropertiesofclas1planthemoglobins.iubmblife, 2011,63(3): [11]HebelstrupKH,ShahJK,SimpsonC,etal.Anasesmentof thebiotechnologicaluseofhemoglobinmodulationincereals. PhysiolPlant,2014,150(4): [12]OhwakiY,Kawagishi KobayashiM,WakasaK,etal.Induction ofclas 1non symbiotichemoglobingenesbynitrate,nitriteand nitricoxideinculturedricecels.plant& CelPhysiol,2005, 46(2): [13] BeligniM V, Lamatina L. Nitric oxide stimulates seed germinationandde etiolation,andinhibitshypocotylelongation, threelight inducibleresponsesinplants.planta,2000,210: [14]HeY,TangR H,HaoY,etal.Nitricoxiderepresesthe Arabidopsisfloraltransition.Science,2004,305: [15]GuoFQ,CrawfordN M.Arabidopsisnitricoxidesynthase1is targetedtomitochondriaandprotectsagainstoxidativedamage anddark inducedsenescence.plantcel,2005,17: [16]GniazdowskaA,KrasuskaU,CzajkowskaK,etal.Nitricoxide andplanthemoglobins.postepybiologikomorki,2009,36: [17]NeilSJ,DesikanR,ClarkeA,etal.Hydrogenperoxideand nitricoxideassignalingmoleculesinplants.jexpbot,2002, 53: [18]Romero PuertasMC,PerazoliM,ZagoED,etal.Nitricoxide signaling functions in plant pathogen interactions. Cel Microbiol,2004,6: [19] CorpasF J,LeterierM,Valderam R,etal.Nitricoxide imbalanceprovokesanitrosativeresponseinplantsunderabiotic stres.plantsci,2011,181: [20]DordasC,HasinofBB,IgamberdievAU,etal.Expresionofa stres inducedhemoglobinafectsnolevelsproducedbyalfalfa rootculturesunderhypoxicstres.plantj,2003,35(6): [21] PerazoliM, DominiciP, Romero Puertas M C, etal. Arabidopsisnonsymbiotic hemoglobin AHb1 modulates nitric oxidebioactivity.plantcel,2004,16(10): [22] Shimoda Y, Shimoda Sasakura F, Kucho K, et al. Overexpresion ofclas1 planthemoglobin genesenhances symbioticnitrogenfixationactivitybetweenmesorhizobium loti andlotusjaponicus.plantj,2009,57(2): [23] IgamberdievA U,SeregélyesC,Manac hn,etal.nadh dependentmetabolism ofnitricoxidein alfalfarootcultures expresingbarleyhemoglobin.planta,2004,219: [24]LimamiAM,DiabH,LothierJ.Nitrogenmetabolism inplants underlowoxygenstres.planta,2014,239(3): [25] 刘晓庆, 徐照龙, 许玲, 等. 大豆 GmNAC8 基因克隆与原核表达. 江苏农业学报,2013,29(4): LiuXQ,XuZL,XuL,etal.Cloningandprokaryoticexpresion ofgmnac8geneisolatedfrom soybean.jiangsujofagrsci, 2013,29(4): [26]HebelstrupaKH,ShahbJK,IgamberdievAU.Theroleofnitric oxideandhemoglobininplantdevelopmentandmorphogenesis. PhysiolPlant,2013,148(4): [27]HilRD,Huang SL, StasolaC. Hemoglobins, programmed celdeath and somaticembryogenesis.plantsci,2013,211: [28]DordasC,HasinofBB,RivoalJ,etal.Clas 1hemoglobins, nitrateandnolevelsinanoxicmaizecel suspensioncultures. Planta,2004,219: [29]SainzM,Perez RontomeC,RamosJ,etal.Planthemoglobins maybemaintainedinfunctionalform byreducedflavinsinthe nuclei,andconferdiferentialtolerancetonitro oxidativestres. PlantJ,2013,76(5): [30]HebelstrupK H,JensenE O.ExpresionofNO scavenging hemoglobinisinvolvedinthetimingofboltinginarabidopsis thaliana.planta,2008,227(4): [31] 杨礼香, 王正询, 柯德森, 等. 拟南芥血红蛋白 1(AtGLB1) 与过氧化氢的相互作用. 氨基酸和生物资源,2009,31(4): 1 4. YangLX,WangZX,KeDS,etal.InteractionofAtGLB1and H2O2.AminoAcids&BioticResources,2009,31(4):1 4. [32]Violante MotaF,TelecheaE,MoranJF,etal.Analysisof peroxidase activity of rice (Oryza sativa) recombinant hemoglobin1:implicationsforinvivofunctionofhexacoordinate non symbiotichemoglobinsinplants.phytochem,2010,71:21 26.

6 2015,35(4) 郭兆来等 : 菠菜 SoHb 基因的原核表达及功能分析 59 ProkaryoticExpresionandFunctionAnalysisofSoHbfrom Spinach GUOZhao lai BAIXue gui YANJin ping CHENXuan qin LIKun zhi XUHui ni (ColegeofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming ,China) Abstract Tofurtherinvestigatethefunctionofnonsymbiotichemoglobinofspinach(SoHb),theful lengthcdnaencodingsohbwasamplifiedbyrt PCRfrom spinachrootandclonedintoinducibleexpresion vectorpet32a.therecombinantprokaryoticexpresionplasmidwastransformedintoe.colibl21star(de3) strainforgeneticengineeringstrain.thetransformedstrainwasinducedwithisopropyl beta D thiogalactoside (IPTG)forexpresingfusionprotein.SDS PAGEanalysisshowedthattherecombinantproteinwithamolecular masabout38kdawashighlyexpresedine.coliandpresentedbothinthesupernatantandthepeletpartofe. colilysates.thepet32a SoHbstrainwasmoreresistanttonitrosativestresthanthepET32aemptyvector strain.thesupernatantwasfurtherpurifiedbyni 2+ NTAafinitychromatographyandimmunizedwhitemousesas antigen.thepolyclonalantibodywasobtainedandanalyzedbywesternblot.itlaidfoundationforinvestigating thefunctionofsohb. Keywords Non symbiotichemoglobin Escherichiacoliexpresion Nitrosativestres

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌