2010,30(4) 郭乐等 : 大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 三重串联突变体与黏附素 K99 融合基因的表达研究 27 原性提供基本素材, 为研制新型和大肠杆菌耐热性肠毒素相关的基因工程疫苗奠定一定的基础 1 材料和方法 1.1 菌株与质粒大肠埃希氏菌 C83922(K99 + STI + )

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颂禹
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(4):26?32 大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 三重串联突变体与黏附素 K99 融合基因的表达研究郭乐李敏王玉炯 ( 宁夏大学生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室银川 ) 摘要产肠毒素大肠杆菌 (ETEC) 是一种导致仔畜和婴儿腹泻的主要病原之一, 它的毒力因子主要有两类 : 黏附素 (CFAs) 和耐热性肠毒素 (ST) 或不耐热性肠毒素 (LT) 通过 PCR 技术及双酶切连接技术, 成功构建了含有 3 个 STI 突变体和 1 个黏附素 K99 基因的重组表达质粒 pe3s(s) LK 和 pe3s(g)lk 重组菌株 BL21(DE3)(pE3S(S)LK) 和 BL21(DE3)(pE3S(G)LK) 的表达产物经 SDS PAGE 和免疫印迹分析, 表明以上两种重组菌株均能高效表达 3STI(S) K99 和 3STI (G) K99 融合蛋白, 且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株 C83922 抗血清特异性识别其次, 利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性, 结果均为阴性 (G/C 值 0.083), 这表明该菌株已无 STI 生物学毒性这些为研发预防大肠杆菌性腹泻的新型高效多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导关键词产肠毒素大肠杆菌黏附素耐热性肠毒素中图分类号 Q819 产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC) 是引起仔猪黄白痢的致病菌 [1], 其致病因子主要为黏附素 ( 又称之为定居因子 ) 和肠毒素, 肠毒素又可分为耐热性肠毒素 (ST) 和非耐热性肠毒素 (LT) 两种 75% 的 ETEC 菌株都可产生 ST( 或单独产生, 或同时产生 LT),ST 在大肠杆菌性腹泻中扮演着极其重要的角色 ;ST 有其独特的生物化学性质 : 耐热 ( 在 min 和 min 不失活 ) 耐酸碱 ( 在 ph2~ph10 稳定 ) 耐多种有机溶剂和表面活性剂抗各种蛋白酶水解, 因此在国内外引起专家们的广泛关注 ST 可以分为 STI 和 STI 两类,STI 是导致仔畜腹泻的最直接的致病因子, 但是 STI 分子量较小, 免疫原性极差, 又具有强的肠毒素活性, 给 ETEC 基因工程疫苗的研制带来了极大的困难, 如何赋予 STI 较强的免疫原性又能有效降低其生物学毒性, 一直是研发新型 ETEC 基因工程疫苗的热点和难点 STI 的肠毒素活性主要由一个含有 18 个氨基酸的肽片段来收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 通讯作者, 电子信箱 :wyj@nxu.edu.cn 体现, 该片段含有 6 个 Cys, 可形成 3 对链内二硫键, 对 STI 的生物毒性至关重要 [2] 在本实验室先前的研究中, 我们通过基因定点突变技术和 PCR 成功地将 STI 生物毒素中心的 6 对半胱氨酸 (Cys) 分别突变成丝氨酸 (Ser) 和甘氨酸 (Gly), 破坏了 3 对链内二硫键, 再将 STI 突变体与黏附素 K99 融合, 成功地构建了能够表达 STI K99 融合蛋白的基因工程重组菌株 BL21(DE3) (pe3s(s)lk) 和 BL21(DE3)(pE3S(G)LK), 经 SDS PAGE 和免疫印迹分析, 表明以上两种重组菌株均能高效表达 STI(S) K99 和 STI(G) K99 融合蛋白, 且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株 C83922 抗血清特异性识别本研究在上述研究的基础上, 通过基因融合技术将 3 个 STI 突变体基因串联起来, 并间隔以 Linker, 再与粘附素 K99 基因偶联, 构建了能够表达含有串联 STΙ 突变体融合基因的重组菌株 BL21(DE3) (pe3s(s)lk) 和 BL21(DE3)(pE3S(G)LK), 通过检测 3STI K99 融合蛋白是否依旧能够得到高效表达, 是否依旧能够保持 STI 的抗原性, 是否丧失了 STI 生物学毒性等问题, 为今后研究小分子蛋白的抗原性及免疫

2 2010,30(4) 郭乐等 : 大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 三重串联突变体与黏附素 K99 融合基因的表达研究 27 原性提供基本素材, 为研制新型和大肠杆菌耐热性肠毒素相关的基因工程疫苗奠定一定的基础 1 材料和方法 1.1 菌株与质粒大肠埃希氏菌 C83922(K99 + STI + ) 受体菌 DH5α JM109 BL21(DE3) 表达载体 pet 22b 重组质粒 pms(s)lk( 含有 STI(S) K99 融合基因 ) 和 pms (G)LK( 含有 STI(G) K99 融合基因 ) 由本室保存 ; 载体 pmd18 TSimpleVector 购自 TaKaRa 公司 1.2 试剂限制性核酸内切酶 :KpnⅠ(15U/μl) SmaI(15U/ μl) EcoRI(15U/μl) Hind I(15U/μl) BglⅡ(15U/ μl) NcoⅠ(15U/μl) XhoⅠ(15U/μl) ETaqDNA 聚合酶 (5U/μl) MarkerDL2000 WideRangeDNA Marker (100~6000) 50bpDNALadderMarker RNaseA 琼脂糖均购自 TaKaRa 公司 ;Low RangeProteinMarker 为宝泰克公司产品 ; 质粒快速提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司 ; 氨苄青霉素购自 Sigama 公司 ;T4 DNA Ligase(3 U/μl) Wizard PCR prepsdna PurificationSystem 低熔点琼脂糖购自 Promega 公司胰化蛋白胨 (Tryptone) 酵母提取物 (Yeastextract) 为 OXOID 产品 ; 琼脂粉 NaCl CaCl 2 等化学试剂均购自北京化学试剂公司 ; 考马斯亮蓝 R250, 考马斯亮蓝 G250,β 巯基乙醇, 溶菌酶为北方同正生物公司产品 ; 丙烯酰胺 (Acr),N,N 甲叉丙烯酰胺 (Bis), 过硫酸胺 (AP) 均为华美生物公司产品 ;TEMED 为 Promega 公司产品 ;EDTA 为西安市化玻站化学厂产品 ; 羊抗兔 IgG HRP( 酶标二抗 ) 购自北京博奥森公司 ;Honda 氏产毒肉汤培养基购自北京博奥森生物科技公司 1.3 实验动物昆明系小鼠 (1~3 日龄乳鼠 ) 和家兔均购自宁夏医科大学实验动物中心 1.4 STI(S) 和 STI(G) 突变体基因的 PCR 合成 [3] 根据 Moseley 等报道的 STI 基因序列和 [4] Roosendaal 等报道的 K99 基因序列及引物设计原则设计并合成引物引物中将 6 个 Cys 密码子分别置换成了 Ser 密码子和 Gly 密码子用 PCR 技术合成 STΙ(S) 突变体基因的引物如下 : P1:5 CGGGGTACCGAGCTCTAGTAGCAATTACAGC AGTGAATTGAGTAGTAATCCTGCTAGTACCGGGAGC 3 P2:5 CCCCAAGCTTGGCACCCGGGGATCATAGC TCCCGGTACTAGCAGG 3 下划线部分为酶切位点,P1 的 5 端的酶切位点是 KpnI;P2 的 5 端的酶切位点是 Hind I; 阴影部分是上游引物 P1 和下游引物 P2 的互补配对区域 ; 突变位点以加粗字体在上游引物 P1 中加以标示上述引物由 TaKaRa 公司合成用 PCR 技术合成 STΙ(G) 突变体基因的引物如下 : P3:5 TCCCCCGGGTACCGAGCTCTAGTAGCAATT ACGGCGGTGAATTGGGTGGTAATCCTGCTGGTACC GGGGGC 3 P4:5 CCCCAAGCTTGGTACACGGGGATCATAGC CCCCGGTACCAGCAGG 5 下划线部分为酶切位点,P3 的 5 端的酶切位点是 SmaI;P4 的 5 端的酶切位点是 Hind I; 阴影部分是上游引物 P3 和下游引物 P4 的互补配对区域 ; 突变位点以加粗字体在上游引物 P3 中加以标示上述引物由 TaKaRa 公司合成用 PCR 技术合成 STI(S G) 突变体基因的反应体系均为为 100μl; 合成 STI(G) 突变体基因的反应条件为 :94 预变性 4min,94 变性 45s,52 退火 60s, 72 延伸 1min, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 6min 合成 STΙ(G) 突变体基因的反应条件为 :94 预变性 4 min,94 变性 45s,55 退火 60s,72 延伸 1min, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 6min PCR 扩增产物的回收纯化参照 Guilouard 低熔点琼脂糖 (LMA) 法和 Wizard PCR preps DNA PurificationSystem 说明书进行操作 1.5 重组质粒 pm2s(s)lk 和 pm2s(g)lk 的构建重组质粒 pm2s(s/g)lk 详细构建策略 : 将 STI (S) 基因经 KpnI 和 Hind I 双酶切并回收后, 插入到重组质粒 pms(s)lk 中, 成功构建重组质粒 pm2s(s) LK; 将 STI(G) 基因经 SmaI 和 Hind I 双酶切并回收后, 插入到重组质粒 pms(g)lk 中, 成功构建重组质粒 pm2s(g)lk 重组质粒 pm2s(s/g)lk 中含有 2 个 STI 突变体基因 1.6 STI(S) K99 和 STI(G) K99 的 PCR 扩增扩增融合基因 STΙ(S) K99 的引物如下 : P5:5 CCCAAGCTTGAGTAGCAATTACAGCAGTGA ATTGAGTAG 3 P6:5 CCGCTCGAGTTACATATAAGTGACTAAGAA GG 3

I;P8 的 5 端的酶切位点是 XhoI 扩增 STI(S) K99 和 STI(G) K99 融合基因的 PCR 反应 : 分别以重组质粒 pms(s)lk 和 pms(g)lk 为模板, 体系为 50μl; 反应条件相同, 详述如下 :94 预变性 4min,94 变性 45s,54 退火 60s,72 延伸 1min, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 6min 1.

3 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 下划线部分为酶切位点,P5 的 5 端的酶切位点是 Hind I;P6 的 5 端的酶切位点是 XhoI 扩增融合基因 STI(G) K99 的引物如下 : P7:5 CCCAAGCTTGAGTAGCAATTACGGCGGTGA ATTG 3 P8:5 CCGCTCGAGTTACATATAAGTGACTAAGAA GG 3 下划线部分为酶切位点,P7 的 5 端的酶切位点是 Hind I;P8 的 5 端的酶切位点是 XhoI 扩增 STI(S) K99 和 STI(G) K99 融合基因的 PCR 反应 : 分别以重组质粒 pms(s)lk 和 pms(g)lk 为模板, 体系为 50μl; 反应条件相同, 详述如下 :94 预变性 4min,94 变性 45s,54 退火 60s,72 延伸 1min, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 6min 1.7 重组表达质粒 pe3s(s)lk 和 pe3s(g)lk 的构建将 STI(S/G) K99 基因片段用 Hind I/XhoI 双酶切后, 分别插入表达载体 pet 22b 中, 成功构建重组质粒 pms(s/g)lk; 然后将重组质粒 pm2s(s/g)lk 用 NcoI/Hind I 双酶切, 回收并纯化酶切产物 2STI(S/ G) 融合基因, 将其分别插入 pms(s/g)lk 中, 成功构建重组表达质粒 pe3s(s/g)lk 重组表达质粒 pe3s (S)LK 和 pe3s(g)lk 经 NcoI/Xhol 双酶切, 用 1.0% 的琼脂糖电泳检测酶切结果 1.8 重组表达质粒 pe3s(s)lk 和 pe3s(g)lk 的稳定性参照 Meacock 等的方法进行将 37 振荡培养过夜的菌体, 按 10% 接种于 100ml 含 Amp r 的 LB 液中, 继续培养 12h 将上述培养物稀释 10 6 倍, 在无 Amp r 的 LB 液中培养 12h 取 100μl 稀释液涂于普通 LB 琼脂平板上过夜培养后, 随机挑取 100 个单菌落, 转种在含 Amp r 的 LB 琼脂平板上,37 过夜培养并进行菌落计数 1.9 表达产物的 SDS PAGE 检测及 Westernblot 分析按参考文献 [5] 介绍的方法进行 1.10 乳鼠灌胃实验鉴定基因工程菌株的 STI 生物学毒性为鉴定表达产物 3STI(S) K99 和 3STI(G) K99 融合蛋白是否已经丧失了 STI 生物学毒性, 用两株基因工程菌株的培养物上清及菌体裂解物, 按照 Giannela 建立的实验方法, 分别进行乳鼠灌胃实验计算 G/C( 肠重 / 剩余尸重 ) 值,G/C 值 0.09 为 STⅠ 毒素阳性,G/ C 值 0.083, 为 STⅠ 毒素阴性具体实验方案参见参考文献 [6] 2 结果 2.1 STI(S/G) 突变体基因的 PCR 合成分别以 P1 P2 和 P3 P4 为引物通过 PCR 合成 STI (S) 和 STI(G) 突变体基因,PCR 产物用 1.0% 的琼脂糖电泳检测扩增结果 ( 图 1), 片段大小约为 94bp, 与预计结果一致 2.2 重组质粒 pm2s(s/g)lk 的鉴定重组质粒 pm2s(s)lk 和 pm2s(g)lk 中含有 2 个 STI 突变体基因, 经过 NcoI/Hind I 双酶切 ( 图 2) 鉴定, 片段大小约为 160bp, 与预期大小一致, 经过核苷酸序列测定证实 2 个 STI 突变体基因均完全正确图 1 PCR 产物 STI(S/G) 电泳图谱 Fig.1 TheamplificationofSTI(S/G)byPCR 1:DNAmarkerDL 2000;2,3:STI(S)amplification; 4,5:STI(G)amplification 图 2 pm2s(s/g)lk 双酶切图谱 Fig.2 TheenzymeidentificationofpM2S(S/G)LK 1:WideRangeDNAMarker(100~6000); 2:pM2S(S)LK/NcoI+Hind I; 3:pM2S(G)LK/NcoI+Hind I 2.3 STI(S/G) K99 基因片段的 PCR 扩增以重组质粒 pms(s)lk 为模板,P5 和 P6 为引物, 扩增出融合基因 STI(S) K99; 以重组质粒 pms(g)lk 为模板,P7 和 P8 为引物, 扩增出融合基因 STI(G) K99 PCR 扩增产物用 1.0% 的琼脂糖电泳检测扩增

4 2010,30(4) 郭乐等 : 大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 三重串联突变体与黏附素 K99 融合基因的表达研究 29 结果 ( 图 3), 片段大小为 572bp, 与预期结果一致 (S)LK 和 pe3s(g)lk 经 NcoI/Xhol 双酶切, 用 1.0% 的琼脂糖电泳检测扩增结果 ( 图 4), 片段大小为 721bp, 与预期结果一致图 3 PCR 产物 STΙ(S/G) K99 电泳图谱 Fig.3 TheamplificationofSTI(S/G) K99byPCR 1:DNAmarkerDL 2000;2:Blankcontrolgroup; 3:STI(S) K99amplification;4:STI(G) K99amplification 2.4 重组表达质粒 pe3s(s/g)lk 的鉴定将 STI(S/G) K99 基因片段用 Hind I/XhoI 双酶切后, 分别插入表达载体 pet 22b 中, 成功构建重组质粒 pms(s/g)lk; 然后将重组质粒 pm2s(s/g)lk 用 NcoI/Hind I 双酶切, 回收并纯化酶切产物 2STI(S/ G) 融合基因, 将其分别插入 pms(s/g)lk 中, 成功构建重组表达质粒 pe3s(s/g)lk 重组表达质粒 pe3s 图 4 pe3s(s/g)lk 双酶切电泳图谱 Fig.4 TheenzymeidentificationofpM3S(S/G)LK 1:WideRangeMarker(100~6000);2,3:pE3S(S)LK/NcoI+Xho I;4,5:pE3S(G)LK/NcoI+XhoI 2.5 3STI(S/G) K99 融合基因的核苷酸序列测定重组质粒 pe3s(s)lk 和 pe3s(g)lk 经核苷酸序列测定, 证实构建的 3STI(S) K99 和 3STI(G) K99 融合基因序列与预期结果完全一致 ( 图 5 图 6) 图 5 重组质粒 pe3s(s)lk 测序结果 Fig.5 TheSequenceresultofpE3S(S)LK bydnasequencing ThematuresequencesofSTIareunderlined;linkeriscoveredbyblackshadow;therestpartisK99 sequences;themutatedsitesofstiareinbox(cys Ser).Restrictionenzymecutingsites areinaboldway(ccatggisncoi,ctcgagisxhoi) 2.6 重组表达质粒 pe3s(s/g)lk 的稳定性重组表达质粒 pe3s(s)lk 和 pe3s(g)lk 在受体菌 BL21(DE3) 中能稳定传代, 在无选择压力条件下, 经 20 世代后, 含质粒率为 100%, 说明具有良好的稳定性 2.7 融合蛋白 3STI(S/G) K99 的 SDS PAGE 分析将构建好的 BL21(DE3)(pE3S(S)LK) 和 BL21 (DE3)(pE3S(G)LK) 重组菌株在 37 下培养, 用 1mmol/L IPTG 诱导表达 4h 经 SDS PAGE( 图 7) 检测, 在 31kDa 处

30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.42010 出现 3STΙ(S) K99 和 3STΙ(G) K99 融合蛋白, 与理论值相符用 Bio Rad 凝胶成像仪 QuantityOne 软件分析, 结果表明 3STI(S) K99 融合蛋白占菌体总蛋白相对含量的 21.4%,3STΙ(G) K99 融合蛋白占菌体总蛋白相对含量的 21.

6 ThesequenceresultofpE3S(G)LK bydnasequencing ThematuresequencesofSTIareunderlined;linkeriscoveredbyblackshadow;therestpartisK99 sequences;themutatedsitesofstiareinbox(cys Gly).

7 SDS PAGEanalysisof3STI(S) K99and 3STI(G) K99 1:Lowmoleculerproteinmarkers;2,3:Theinclusionproteinof BL21(DE3)(pE3S(S)LK);4,5:TheperiplasticproteinofBL21

5 30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 出现 3STΙ(S) K99 和 3STΙ(G) K99 融合蛋白, 与理论值相符用 Bio Rad 凝胶成像仪 QuantityOne 软件分析, 结果表明 3STI(S) K99 融合蛋白占菌体总蛋白相对含量的 21.4%,3STΙ(G) K99 融合蛋白占菌体总蛋白相对含量的 21.9% 宿主菌体周质内存在目的蛋白, 但含量相对较少, 目的蛋白多以包涵体的形式存在图 6 重组质粒 pe3s(g)lk 测序结果 Fig.6 ThesequenceresultofpE3S(G)LK bydnasequencing ThematuresequencesofSTIareunderlined;linkeriscoveredbyblackshadow;therestpartisK99 sequences;themutatedsitesofstiareinbox(cys Gly).Restrictionenzymecutingsites areinaboldway(ccatggisncoi,ctcgagisxhoi) 可以被 C83922 血清特异性抗体识别, 而阴性对照在相同的位置没有阳性反应条带 ( 图 8) 图 7 融合蛋白 3STI(S) K99 和 3STI(G) K99 的 SDS PAGE 分析 Fig.7 SDS PAGEanalysisof3STI(S) K99and 3STI(G) K99 1:Lowmoleculerproteinmarkers;2,3:Theinclusionproteinof BL21(DE3)(pE3S(S)LK);4,5:TheperiplasticproteinofBL21 (DE3)(pE3S(S)LK);6,7:TheinclusionproteinofBL21(DE3) (pe3s(g)lk);8,9:theperiplasticproteinofbl21(de3)(pe3s (G)LK);10:TotalcellysateofBL21(DE3)(pET22b) 2.8 融合蛋白 3STI(S/G) K99 的 Westernbloting 鉴定用产肠毒素大肠杆菌强毒株 C83922 免疫家兔所制备的血清对转膜的蛋白进行 Westernbloting 试验分析, 结果表明, 在约 31kDa 处出现识别条带, 重组蛋白图 8 3STI(S) K99 和 3STΙ(G) K99 融合蛋白的 Westernblot 鉴定结果 Fig.8 Westernblothybridizationofthefusion protein3sti(s/g) K99 1:Lowmoleculerproteinmarkers;2:TotalcellysateofBL21(DE3) (pet22b);3,4:theperiplasticproteinofbl21(de3)(pe3s(s) LK);5,6:TheperiplasticproteinofBL21(DE3)(pE3S(G)LK); 7:TheinclusionproteinofBL21(DE3)(pE3S(S)LK); 8:TheinclusionproteinofBL21(DE3)(pE3S(G)LK) 2.9 基因工程菌株的 STI 生物学毒性鉴定将两株基因工程菌株的培养上清和菌体裂解物,

6 2010,30(4) 郭乐等 : 大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 三重串联突变体与黏附素 K99 融合基因的表达研究 31 分别进行乳鼠灌胃试验, 结果均为阴性 (G/C 值表 1 乳鼠灌胃实验鉴定 STI 生物学毒性 0.083), 如表 1 所示, 表明该菌株已无 STI 生物学毒性 Table1 ThetestofSTIbiologicaltoxicitybysucklingmouseasay 空白对照鉴定组阳性对照阴性对照生理盐水 pe3s(s)lk pe3s(g)lk C83922 pet 22b 上清液裂解液上清液裂解液上清液上清液裂解液灌鼠数目 3 只 2 只 2 只 2 只 3 只 2 只 2 只 2 只平均值 (G/C) STI 毒性阴阳性阴性阴性阴性阴性阴性阳性阴性阴性剖检观察表明, 阳性对照组乳鼠肠管肿胀松软, 有较多积液, 肠壁发黄混浊,G/C 值 >0.09, 但鉴定组和阴性对照组乳鼠肠道无肿胀现象, 且光滑有光泽, 与阳性对照组形成鲜明对比 3 讨论由产肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪腹泻一直是国内外专家研究的热点, 如何解决这个问题, 国内外主要存在两种策略 : 一是药物治疗, 二是免疫预防由于药物昂贵药物多为抗生素等种种弊端, 国内外研究大都倾向于免疫预防的策略随着现代分子生物学和免疫学的发展, 为研制有效防治 ETEC 引起的仔猪腹泻的多价基因工程疫苗提供了先进的理论和技术支持产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素 STI 是肠毒素中最主要的直接致病因子之一, 因其独特的生物化学性质 : 耐强酸, 耐强碱, 耐高温, 引起国内外专家的广泛关注然而 STI 的分子量较小, 免疫原性极差, 如何赋予 STI 较强的免疫原性又能有效降低其生物毒性, 一直是 ETEC 基因工程疫苗研制的一个热点和难点我们利用酶连接技术将 3 个 STI 突变体基因连接起来, 并与黏附素 K99 基因融合,3 个 STI 突变体基因串连, 增加了 STI 的抗原决定簇基因, 同时 STI 与大分子黏附素蛋白 K99 的偶联, 又进一步赋予了 STI 较强的免疫原性 SDS PAGE 和 Westernbloting 分析表明, 构建的两种重组菌株 BL21(DE3)(pE3S(S)LK) BL21(DE3)(pE3S (G)LK) 所表达的 3STΙ(S) K99 和 3STΙ(G) K99 重组蛋白, 分别占菌体蛋白相对含量的 21.4% 和 21.9%, 且能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株 C83922 抗血清特异性识别利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性, 结果均为阴性 (G/C 值 0.083), 这表明该融合蛋白菌株已无 STΙ 生物学毒性 pet 22b 表达载体是一种分泌性表达载体, 其主要特点是在 N 末端带有周质定位作用的 pelb 信号序列, 融合表达的信号肽协助目的蛋白转运到细胞周质, 促进蛋白正确折叠 ; 转运时信号肽被信号肽酶 (SP) 切除本研究中, 在细菌上清和周质中有可溶性的目的蛋白, 包涵体中也存在目的蛋白, 可能是由于目的蛋白在大量形成时, 来不及正确折叠, 从而主要以包涵体的形式存在融合蛋白的构建中, 连接肽的选择对每种成分的活性保留有重要意义 [7] 连接肽应选用非极性的疏水氨基酸, 长度在 10~15 个氨基酸之间, 能使两种分子形成保持活性所必需的空间构象在构建 3STI(S) K99 和 3STI(G) K99 融合基因的策略中, 我们较频繁地使用 Linker 来降低 STI 与 K99 以及 STI 与 STI 之间的基因表达干扰, 通过 SDS PAGE Westernblot 证明了 3STI(S) K99 和 3STI(G) K99 重组蛋白能与所制备的 C83922 抗血清发生特异性反应另外, 本研究只是定性地验证了构建的 BL21 (DE3)(pE3S(S)LK) 和 BL21(DE3)(pE3S(G)LK) 重组菌株能够较高水平地表达融合蛋白, 且融合蛋白 3STI K99 丧失了 STI 生物学毒性, 保持了与产肠毒素性大肠杆菌强毒株 C83922 抗血清特异性反应的抗原抗体反应特异性但是融合蛋白 3STI K99 的免疫原性是否优越于 STI K99 的免疫原性, 能否激发机体产生较高的抗体水平, 能否获得较高的免疫保护率, 需进一步加以验证本工作主要为今后研究小分子蛋白 STI 的抗原性及免疫原性提供基本素材, 为研制和大肠杆菌耐热性肠毒素相关的新型基因工程疫苗奠定一定的基础参考文献 [1]JeyasinghamM D,ButlyP,KingTP,etal.EscherichiacoliK88 receptorexpresioninintestineofdisease suspectweanedpigs. VeterinaryMicrobiolog,1999,68(3 4): [2]AkiyamaY,KamitaniS,KusukawaN,etal.Catalysisofoxidative foldingofdisulfide bondedproteinsinescherichiacolidsbagene produce.biolchem,1992,167(22):440.

7 32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No [3]MoseleySL,HardyJM,HuqMI,etal.Isolationandnucleotide sequencedeterminationofageneencodingaheat stableenterotoxin ofescherichiacoli.infectimmun,1983,39: [4]RoosendaalB,GaastraW,DeGraafFK.Thenucleotidesequence ofthegeneencodingthek99subunitofenterotoxigenicescherichia coli.femsmicrobiolleters,1984,22: [5]SambrookJ,FritschE F,ManiatisT.MolecularCloning:A LaboratoryManual.2 nd ed. New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPres, [6]GiannelaRA.Sucklingmousemodelfordetectionofheat stable E.colienterotoxin:characteristicsofthemodel.InfectImmune, 1976,14:95. [7] ClementsJD. Construction ofanontoxicfusion peptidefor immunizationagainstescherichiacolistrainsthatproduceheat labileandheat stableenterotoxins.infectimmun,1990,58(1): 159. ExpresionofFusionGeneofTreeHeat stabletoxini MutantsandK99 AdhesinofEnterotoxigenicEscherichiacoli GUOLe LIMin WANGYu jiong (KeyLaboratoryofMinistryofEducationforProtectionandUtilizationofSpecialBiological ResourceinWesternChina,SchoolofLifeScience,NingxiaUniversity,Yinchuan ,China) Abstract EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)isamajorcauseofdiarheainanimalsandinfants.The twomostimportantvirulencefactorsofetecarecolonizationfactorantigens(cfas),andtheheatstable(st) enterotoxinorheatlabile(lt)enterotoxin.therecombinantplasmidpe3s(s)lkandpe3s(g)lk,containing threesti smutantsandonecolonizationfactork99geneweregotensuccesfulybypcranddoubleenzyme cleavingandinsertingtechnology.theresultofsds PAGEandWesternblotingprovedthattherecombinant strainbl21(de3)(pe3s(s)lk)andbl21(de3)(pe3s(g)lk)couldproducethefusionproteinof3sti (S) K99 and3sti(g) K99 efectivelywhichwerespecialyrecognizedbyanti serum ofenterotoxigenic EscherichiacoliC83922.Inaddition,therecombinantproteinof3STΙ(S) K99and3STΙ(G) K99tunedoutto losetheirbiologicaltoxicityofstι(thenumericalvalueofg/c 0.083)bythetestofpouringstomachof suckingmice.itprovidesbasicmaterialsandtheoreticalintroductionforpreventcolibacilusdiarheaofnewborn pigletandcontributestodevelopinganewefectivemultivalentgeneengneeringvaccine. Keywords EnterotoxigenicEscherichiacoli Colonizationfactorantigens Heatstableenterotoxin

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌