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- 连 茹
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1 组织样本 mirna 提取细胞样本 mirna 提取全血样本 mirna 提取 TaqMan mirna 反转录试剂盒 通过 HG TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒检测 microrna B1802 mirna 25T/100T 500/1600 B1803 mirna 25T/100T 500/1600 D1802 HG TaqMan mirna 25T/100T 800/2600 TAPxxxxx HG TaqMan mirna PCR 100T 20μl
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6 二 microrna 反转录 (TaqMan mirna 反转录试剂盒,Cat.No:D1802) HaiGene 的 TaqMan mirna 反转录试剂盒专用于 mirnas 分子的反转录试验, 转录获得的 cdna 产物用于 TaqMan 定量 PCR 方法检测 mirnas 分子 ( 仅适用 HaiGene TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒, 货号 : TAPxxxxx) HaiGene TaqMan mirna 反转录试剂盒采用加 A 法进行反转录, 加 A 法的反转录效率远高于茎环法, 因此, 采用该方法可极大的提高检测灵敏度 ( 原理见下图 ) 该试剂盒操作简单, 仅需要两步即可轻松完成 mirna 的 cdna 合成, 合成的 cdna 可用于所有 mirna 的后续定量检测 反转录完毕后采用特异性的上游引物和接头引物进行 PCR 扩增,FAM 标记特异性 TaqMan 探针作为荧光报告基团进行定量检测 ( 原理见图 1) 综上所述,HaiGene TaqMan mirna 解决方案综合了加 A 法反转录的高效性和探针法定量的高特异性, 是 mirna 定量研究的绝佳选择 mirna TaqMan 定量 PCR 流程 TaqMan Probe mirnas AAAAA AAAAAAA 3 TTTTTTT adaptor 5 Forward Primer FAM P Q adaptor 3 Reverse Primer 1. 对 mirna 进行加 A 反应 2. 反转录获得 mirna 的 cdna 产物 3. 利用 TaqMan 探针进行 qpcr 检测 2 mirna TaqMan 操作方法和步骤 (1) 按以下组分在 0.2ml EP 管中配制应液 mirna (5~100 ng/μl) 5 TaqMan mirna RT Solution A 4 μl 1 μl Total RNA Total RNA mirna (2) 在 PCR 仪上按以下条件进行加 A 反应 : 37 C 30min 85 C 5min 5
7 (3) 反应完毕后, 在上述 5μl 反应体系中加入如下试剂, 并混合均匀 10 TaqMan mirna RT Primer 10 TaqMan mirna RT Solution B H 2 O 2 μl 2 μl 11 μl (4) 在 PCR 仪上按以下条件进行反转录反应 : 30 C 5min 55 C 60min 95 C 5min cdna mirna mirna cdna 80μl ddh μl HG TaqMan mirna PCR ( TAPXXXXX ) HG TaqMan RNU6B mirna PCR ( TAP01501) HG TaqMan hsa-mir16 mirna PCR ( TAP01511) 三 通过 HG TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒检测 mirna(haigene,cat.no.: TAPxxxxx) HaiGene 的 HG TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒, 采用特异性的正向 mirna 引物和接头引物进行 PCR 扩增, 检测荧光基团采用 FAM 标记的特异性 mirna TaqMan 探针 ( 原理见图 1) 使用该试剂盒可以高特异性 高灵敏度的检测低至 100 个细胞的 mirna 分子 HaiGene TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒多达一万余种, 试剂盒编号为 TAPXXXXX, 每一个 mirna 分子对应一个检测试剂盒 ( 包含特异性的 TaqMan 探针 正向引物 反向引物 定量试剂 ), 可于 HG TaqMan mirna qpcr kit.xls 中查询 如果您研究的 microrna 分子不在我们的列表中, 请来信咨询, 我们将及时为您优化设计 内参 mirna 定量试剂盒可选择使用 (1)TaqMan RNU6B mirna 定量 PCR 试剂盒 ( 货号 :TAP01501) 人 鼠等哺乳动物 ; (2)TaqMan hsa-mir16 mirna 定量 PCR 试剂盒 ( 货号 :TAP01511) 适用于来源于人 鼠全血样品 6
8 mirna 提取 mirna 反转录 mirna Realtime PCR 参考文献 操作方法和步骤 1 配制反应体系根据机型选择步骤 A 或 B A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-Time PCR 仪, 包括 :ABI 7000/7300/7500/7900 等 按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系 : 5 Golden HS TaqMan qpcr Mix 50 ROX Reference Dye 20 mirna TaqMan Assay *cdna 模板 ddh 2 O 4 μl 0.4 μl 1 μl 1~2.5 μl Up to 20 μl cdna TaqMan mirna B: 无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-Time PCR 仪, 包括 :LightCycler (Roche); MyiQ 2 CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad);Line-Gene( 杭州博日 ) 等 按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系 : 5 Golden HS TaqMan qpcr Mix 20 mirna TaqMan Assay *cdna 模板 ddh 2 O 4 μl 1 μl 1~2.5 μl Up to 20 μl 注意 :cdna 模板来自于第二步所得 TaqMan mirna 反转录产物 7
9 mirna 提取 mirna 反转录 mirna Realtime PCR 参考文献 2 进行 Real-Time PCR 反应 通常采用两步法, 程序如下 : Stage 1: 95 15min Stage 2: 95 10s 60 60s 40 cycles FAM 3. 实例 microrna 因其序列特别短, 只有 20-25nt, 引物设计空间有限, 无论是茎环法还是加尾法反转录, 如后续定量 PCR 用染料法和反向通用引物检测, 都不可避免的会出现非特异性扩增 ( 通过做水阴性对照即可验证 ), 这就使得数据的可信度大大降低 海基自主研发的 TaqMan microrna Assay 采用 FAM 标记 TaqMan 探针和特异性上游引物进行 mirna 定量检测, 有效的确保了扩增的高特异性和高灵敏度, 拒绝非特异性扩增, 完全可与 ABI 探针法相媲美! 普通 SYBR Green (T ) Taqman microrna Assay HaiGene A:hsa-let-7b NC NC B:hsa-miR-122 8
10 mirna 提取 mirna 反转录 mirna Realtime PCR 参考文献 C:hsa-miR-30b D: hsa-mir-7 3 microrna HaiGene B1802 RNA T TaqMan microrna HaiGene D1802 cdna 5 2ul SYBR Green T TaqMan microrna Aassay HaiGene TAPXXXXX hsa-let-7 hsa-mir-122 hsa-mir-135 hsa-mir-7 (NC)2 TaqMan microrna Assay 9
11 mirna 提取 mirna 反转录 mirna Realtime PCR 参考文献 参考文献 (1)Development of a robust, low cost stem-loop real-time quantification PCR technique for mirna expression analysis. (2)Quantitative stem-loop RT-PCR for detection of micrornas. (3)MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qpcr). (4)Detection of let-7a microrna by real-time PCR in gastric carcinoma (5)Novel real-time PCR assay of micrornas using S-Poly(T), a specific oligo(dt) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. Material and Methods The mirna was extracted from the tissue or cell samples using Tissue&Cell microrna Extraction Kit (HaiGene, Harbin, China) according to manufacturer s protocol. To investigate the mir-21 expression level in tissue samples, cdna synthesis was carried out according to the protocol of TaqMan mirna cdna Synthesis Kit (HaiGene, Harbin, China). Briefly, the reaction mix consisting of 100 ng of mirna, 1μl of 5 TaqMan mirna RT Solution A, was performed to add the polya tail at 37 C for 30min, 85 C for 5min. Followed with adding 2μl of 10 TaqMan mirna RT Solution B, 2μl of 10 TaqMan mirna RT Primer, and 11μl of ddh2o, which incubated at 35 C 5min, 55 C 60min followed by enzyme inactivation at 95 C for 5 minutes. Quantification of mirna was performed by HG TaqMan mirna PCR Kit(HaiGene, Harbin, China). RealTime PCR was performed in 20 μl with 2 μl of cdna product, 1 μl of mirna TaqMan Assay, and 4μl of 5 Golden HS TaqMan qpcr Mix under the following conditions:95 C for 15min, 40 cycles of 95 C for 10s, and 60 C for 60s in LightCycler 480 (Roche). MiR-21 levels were normalized to U6B RNA levels using the 2(-ΔCt) model. Real-time PCR assays were performed in duplicate for each sample, and the mean value was used for the calculation of mirna expression levels. The statistical analyses were done using Microsoft Excel (Microsoft) both to calculate the SD and to test for statistically significant differences between the samples using a T test. A value P < 0.05 was considered statistically significant. 10
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